Gnagare Estrous cykelövervakning med vaginal sköljning: Inget sådant som en normal cykel

Summary

Denna studie beskriver de avgörande faktorerna att tänka på i experimentella mönster som involverar honråttor. I en större mening tjänar dessa data till att minska stigmatiseringen och hjälpa till att utveckla mer inkluderande diagnostiska och interventionsverktyg.

Abstract

Den nuvarande metoden etablerar ett reproducerbart, standardiserat och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att övervaka estrouscykeln hos kvinnliga Sprague Dawley (SD) ungdomsråttor. Denna studie visar komplexiteten i hormonella cykler och det breda spektrum av förståelse som krävs för att konstruera en pålitlig och giltig övervakningsteknik. Genom en fördjupad undersökning av huvudsakliga experimentella design- och procedurelement ger denna beskrivning av cykeln och dess grundläggande principer en ram för ytterligare förståelse och dekonstruerar missuppfattningar för framtida replikering.

Tillsammans med en översikt över provinsamlingsprocessen som använder vaginal sköljning beskriver proceduren mekanismen för datakategorisering i fyrstegsmodellen av proestrus, estrus, metestrus och diestrus. Dessa steg kännetecknas av ett nytt föreslaget tillvägagångssätt, som använder de 4 kategoriserande determinanterna för vaginalt vätsketillstånd, närvarande celltyp (er), cellarrangemang och cellkvantitet vid tidpunkten för insamlingen. Variationer av varje steg, gynnsamma och ogynnsamma prover, skillnaden mellan cyklicitet och acyklicitet och grafiska skildringar av de insamlade kategoriseringskomponenterna presenteras tillsammans med effektiva tolknings- och organisatoriska metoder för data. Sammantaget möjliggör dessa verktyg publicering av kvantifierbara dataområden för första gången, vilket leder till standardisering av kategoriseringsfaktorer vid replikering.

Introduction

Nya bidrag
Gnagarens estrouscykel har identifierats som en viktig indikator på välbefinnande. Men omedvetna fördomar hos utredare och felaktiga tolkningar om kvinnokroppen hindrar det vetenskapliga samfundet. Själva etymologin av ordet "estrous" innebär en känsla av underlägsenhet och negativitet. Euripides använde termen för att beskriva en "frenesi" eller galenskap, Homeros för att beskriva panik och Platon för att beskriva en irrationell drivkraft. Denna studie belyser hur dessa urtidsperspektiv påverkar det nuvarande vetenskapliga samfundet och tar itu med dessa problem genom ett nytt mosaikparadigm - en uppdaterad kombination av tidigare studerade metoder, utökad i omfattning för ett mer omfattande tillvägagångssätt.

Studien och användningen av denna teknik är nödvändig, för det första eftersom det inte finns någon standardiserad och omfattande övervakningsteknik, och datatolkningspraxis kan vara oklar. För det andra, även om estrous cykelegenskaper är beroende av att enskilda råttor studeras, är de ofta universaliserade. För det tredje, medan hormonella cykler är rutinmässiga och fördelaktiga processer, är de omgivna av farlig stigma som utforskas i avsnittet "Översättning till människor". Denna studie syftar till att ta itu med dessa tre frågor på tre sätt - (A) genom att beskriva en djupgående estrous cykelövervakningsteknik och klargöra hur resultaten kan tolkas, (B) genom att beskriva metoder som upprätthåller integriteten och individualiteten i varje cykel och (C) genom att uppmärksamma missuppfattningar som upprätthåller ogrundade metoder.

Denna studie är också unik i sitt fokus på tonårsråttor, en period som präglas av avgörande utvecklingsförändringar som belyser olika beteendemässiga, anatomiska och fysiologiska manifestationer i vuxen ålder¹. Att bygga en standardiserad experimentell design för att övervaka hormonella cykler i en underbeforskad population samtidigt som man dekonstruerar vanliga fördomar kommer att möjliggöra utveckling av tillförlitliga och giltiga hormonella korrelationer ^2,3,4 och bestämning av tillståndsberoende cykelstörningar 5,6,7,8,9,10 . I slutändan tjänar dessa nyheter till att utöka diagnostiska kriterier, behandlingar och interventioner av olika hälsoproblem.

Grundläggande definitioner och användningsområden
Den estrouscykeln är en samling dynamiska fysiologiska processer som uppstår som svar på de tre oscillerande kvinnliga könssteroidhormonerna: östradiol, leuteiniserande hormon (LH) och progesteron (Figur 1A,B). Interaktioner mellan det endokrina och centrala nervsystemet reglerar cykeln, som oftast kvarstår i 4-5 dagar och återkommer från början av sexuell mognad till reproduktiv åldrande och / eller upphörande. Det är indelat i separata kategorier baserat på hormonnivåer - oftast i de 4 stadierna av diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) och metestrus (MET), som utvecklas på ett cirkulärt sätt. Antalet divisioner kan sträcka sig från 3 steg¹¹ till 13 steg¹², beroende på studiens art¹³. Det lägre antalet divisioner utesluter ofta MET som ett stadium och klassificerar det som en kortvarig övergångsperiod. Det högre antalet innehåller vanligtvis underavsnitt som möjliggör en närmare inspektion av fenomen som tumörutveckling eller spontan pseudograviditet, det fysiologiska tillståndet för graviditet utan embryonal implantation 12,14,15.

I denna studie identifierades stadierna genom komponenter i vaginalkanalen, som heter de 3 kategoriserande determinanterna-celltyperna närvarande, cellarrangemang och cellkvantitet (figur 2A-D). Medan tillståndet för vaginalvätskan inte övervakades i denna studie, rekommenderas det att inkludera det som en fjärde kategoriserande komponent. Mer information om undersökning av vaginalvätskan finns i referenslistan¹⁶. De kategoriserande komponenterna kan undersökas genom att extrahera celler via vaginal sköljning, den primära tekniken som rekommenderas i dagens estrouscykelövervakning. Medan de djupgående fysiologiska processerna inom varje steg ligger utanför ramen för denna studie, kan mer information hittas i litteraturen¹⁷.

Användningen och den fortsatta utvecklingen av denna estrous cykelövervakningsteknik är rotad i kopplingarna mellan könssteroidhormoner och funktionen hos kroppsliga system som hjärt-kärlsystemet¹⁸, endokrina systemet⁸ och centrala nervsystemet 19,20,21. Samtidigt är det inte alltid nödvändigt med övervakning av estrouscykeln när kvinnliga gnagare är inblandade 22,23,24,25. Snarare är det viktigt att först överväga om könsskillnader har rapporterats inom det specifika studieområdet, vilket kan undersökas ytterligare i publicerade recensioner^22,23. Även om estrous cykelövervakning är avgörande i ett brett spektrum av forskningsundersökningar, bör det inte ses som ett hinder för att inkludera kvinnliga gnagare i experiment. Även om denna teknik kan verka komplex och tidskrävande, kan själva proceduren ta mindre än 15 minuter att slutföra, beroende på utredaren, och är kostnadseffektiv. Sammantaget är inkluderingen av kvinnliga gnagare i vetenskapliga studier fördelaktig för förståelsen av kroppssystem, olika tillstånd och patologier och allmänt välbefinnande, eftersom denna utveckling huvudsakligen har baserats på den manliga kroppsmallen.

Universella parametrar och naturliga variationer hos gnagaren
Att fastställa intervall för aspekter som ses som "typiska" är nödvändigt för att definiera standardcykelmönster, ställa in parametrar för jämförande och analytiska ändamål och upptäcka avvikelser och avvikelser. Samtidigt är det också viktigt att inse att varje råttas cykel är unik, och avvikelser baserade på djurstam, fysiologiska processer och miljöförhållanden förväntas. Faktum är att en av de mest "normala" aspekterna av estrouscykeln är variabilitet. Detta ses i den totala cykellängden, med ett intervall på 3-38 dagar^26,27; åldern för sexuell mognad som kan sträcka sig från 32-34 dagar till flera veckor 28,29,30; vad som anses vara^{acykliskt 11}, och de kategoriserande determinantmönstren^11,13. Sammantaget finns det ingen universell mall för estrouscykeln, och att översätta det till både det vetenskapliga samfundet och allmänheten är en viktig del av experimentprocessen.

Experimentella tidpunkter och utvecklingsålder
Att erkänna denna princip om variabilitet hjälper till att bygga en pålitlig och giltig experimentell design. Till exempel är starten av estrous cykelövervakning beroende av råttornas anatomiska och fysiologiska utveckling, som varierar beroende på miljömässiga och fysiologiska faktorer. Övervakningen kan inte börja förrän utvecklingen av vaginalöppningen (VO), som är den yttre vaginala öppningen omgiven av vulva som leder till den inre delen av vaginalkanalen (figur 3A-D). Medan VO ofta utvecklas fullt ut mellan 32 och 34 dagar, förblir den individualiserad för varje ämne, och mycket om processen är fortfarande okänt. Denna öppning har använts för att identifiera uppkomsten av sexuell mognad, som har kopplats till ökningen av östradiol³¹, mognaden av hypotalamus-hypofys-äggstocksaxeln³² och den första ägglossningen hos råttor 17,33,34,35. Nya publikationer har dock funnit att det bara är en indirekt markör för reproduktiv utveckling, eftersom den kan bli frikopplad från hormonella och utvecklingshändelser i ogynnsamma miljöer³¹ och kan representera förändringar i östradiolnivåer snarare än sexuell mognad³³. Därför rekommenderas det att inte förlita sig enbart på VO för att bestämma utvecklingsålder och som en kvalificerare för estrouscykelövervakning³⁶ utan att också använda utseendet på det första EST-steget och kornifiering av epitelcellerna³⁰ för att markera uppkomsten av sexuell mognad.

Kroppsvikt är särskilt korrelerad med utvecklingsålder under tonårsperioden hos gnagare^30,37 och kan därför också hjälpa till att bestämma utvecklingsåldern under denna period. Föreslagna mekanismer relaterade till detta fenomen inkluderar stimulering av hormoner som är nödvändiga för reproduktiv utveckling, såsom tillväxthormon, och hämning av hypotalamus-hypofys binjure (HPA) -axeln av aptitregulatorn, leptin³⁰. Det rekommenderas dock inte att använda detta mått som den enda indikatorn på utvecklingsålder på grund av den stora variationen som ses mellan råttor mellan arter och leverantörsleverantörer³⁸. Variationen som ses i utvecklingen av VO och kroppsvikt exemplifierar konceptets betydelse i den övergripande experimentella processen.

Översättning till människor: kulturella och vetenskapliga sammanhang
Det translationella förhållandet mellan reproduktionsstudier mellan djur och människa är dubbelriktat. Resultaten från djurbaserade studier påverkar hur de mänskliga processerna bedöms, närmar sig och analyseras³⁹. Uppfattningen av det mänskliga reproduktionssystemet och dess relaterade processer påverkar hur djur studeras. Faktum är att en av de högsta indikationerna för vidare forskning på detta område härrör från partiska sociokulturella övertygelser relaterade till hormonella cykler som påverkar den vetenskapliga processen. Många av dessa konventioner härrör från en allmän kulturell aversion mot att diskutera menstruation, vilket har lett till en datalucka i väl underbyggd kunskap^40,41. Detta har ett spektrum av konsekvenser som sträcker sig från mindre till dödliga - från hyllhöjd och smarttelefonstorlek till polisens kroppspansarmontering och missade cancerdiagnoser⁴².

Beskrivningen av menstruation som ohälsosam, destruktiv och giftig - sett i vördade texter, media, ordböcker och medicinska läror - bevaras av vetenskapliga publikationer. Detta sker genom felaktiga och partiska beskrivningar av hormonella cykler, isoleringen av reproduktionssystemet från dess neuroendokrina motsvarigheter och miljöpåverkan och det reduktionistiska perspektivet på slutförandet av en cykel som ett "misslyckande att bli gravid"^43,44. Detta leder till skapandet av osunda experimentella metoder, såsom utelämnande av externa variabler som påverkar hormonella cykler, bestämning av start och slutpunkter baserade enbart på anatomisk utveckling och mätning av cykelframsteg på ett linjärt snarare än cirkulärt sätt. Trots den direkta korrelationen mellan sociokulturella faktorer och biologiska konsekvenser beaktas det inte ofta i vetenskaplig litteratur. Genom inspektion av mer holistiska publikationer 43,44,45 kan forskare dekonstruera dessa stigmas och skapa mer tillförlitliga och giltiga experimentella mönster.

Protocol

Alla hanterings- och procedurmetoder som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för djurvård och användning och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Pepperdine University och UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

1. Djurvård och användning

1. Skaffa honråttor, i antal enligt kraftanalys, och hanråttor för att främja Whitten-effekten eller mer konsekvent cykling⁴⁶. Bestäm stammen baserat på syftet med studien i kända databaser⁴⁷.
   OBS: De aktuella uppgifterna återspeglar de för kvinnliga ungdomar SD International Genetic Standardization Program (IGS) i närvaro av manliga SD-råttor som finns vid både Pepperdine University och UCLA-laboratorier som en del av en samarbetsstudie. Dessa råttor anlände i separata grupper vid 28 dagars ålder, och den östra cykelprogressionen övervakades i antingen 10 eller 20 dagar för att visa skillnader på akuta och kroniska nivåer, med början vid 34 dagars ålder (efter en 7-dagars acklimatiseringsperiod).
2. Före hantering, tillåt en karantän och / eller en acklimatiseringsperiod för fysiologisk stabilisering efter transport och anpassning till den nya miljön.
   OBS: En minimiperiod på 3 dagar har citerats, med en 7-dagarsperiod rekommenderad 48,49,50,51,52. Sammantaget är detta beroende av transportförhållandena, djurstammen och studiemålen.
3. Se till att stressen minskar med hjälp av en acklimatiseringsperiod, eftersom stress kan störa korrekt reproduktionssystemfunktion⁵³. Överkompensera dock inte genom att försöka eliminera det, eftersom en måttlig mängd stress är till nytta för djurens välbefinnande⁵¹.
4. Värdråttor i en temperatur- (68-79 ° F, dvs 20-26 ° C) och fuktkontrollerad (30-70%) miljö genom att kontakta vivarium- eller laboratoriecheferna och säkerställa dessa funktioner. Distribuera vatten och chow ad libitum med näringskomponenter listade på företagets hemsida och burrengöring en gång i veckan.
   OBS: I denna studie var råttorna inrymda i grupper om 2 separerade efter kön i 19 "x 10" x 8 " klara återanvändbara plastburar och hade tillgång till corncob sängkläder som byttes en gång i veckan. Temperaturen hölls vid 70 ° F och fuktigheten vid 35-79%, med i genomsnitt 62%.
5. Kontrollera utvecklingen av ringsvans eller ischemisk nekros i svans och tår för bevis på låga relativa fuktighetsnivåer och extrema temperaturer, vilket kan orsaka växling av biologiska svar.
   OBS: Temperatur och fuktighet är viktiga för reproduktionssystemet, sexuell mognad och estrous cyklicitet 54,55,56,57,58.
6. Säkerställ korrekt och balanserad belysning i hela bostadsutrymmet genom att deponera lika stora mängder ljuskällor i hela laboratorieutrymmet som verkar på ett tidsstyrt ljus: mörkt system.
   OBS: Här styrdes en 12:12-h ljus: mörk cykel, med lampor tända från 06: 00-18: 00 h, av 2,550-lumen linjära LED-lampor.
7. Följ luxkraven som tillhandahålls⁵² baserat på variationer av djurens pigmentering, ålder, stam, kön och hormonell status.
   OBS: När forskare kategoriserar de insamlade cellproverna kommer konsekvent belysning att möjliggöra korrekt visuell detektering och pålitlig iscensättning⁵⁹. Ljusets varaktighet och intensitet är direkt relaterade till reproduktionssystemet, sexuell mognad och estrous cykling 54,55,56,57,60,61.

2. Utrustning och experimentförberedelser

1. Granska de kategoriserande determinanterna (ses i figur 2A): hur man identifierar varje steg i estrouscykeln och hur man använder mikroskop- och kamerautrustningen.
2. Se till att varje ämne som ska övervakas har nått sexuell mognad och visar lämpliga indikatorer på utveckling - VO, kroppsvikt och ålder. Väg råttorna och undersök dem för VO mellan vid samma tidpunkt varje dag för korrekta jämförelser och överför dem med en godkänd hanteringsmetod. Kontakta den universitetsanknutna veterinären om ett djur förlorar mer än 20% av sin tidigare kroppsvikt.
   OBS: VO förblir kaudal mot urinrörsöppningen och kranial till anus, som ligger mellan de två, som avbildas i figur 3.
3. Eftersom dessa faktorer är belastningsberoende, kontrollera med leverantören för specifikationer och överväga miljöfaktorer som är specifika för laboratoriet⁶².
   OBS: I allmänhet kommer detta att inträffa mellan 32-34 dagars ålder och en genomsnittlig kroppsvikt som sträcker sig från 75-150 gram⁶³ för SD-råttor och indikeras av en cirkulär formad öppning som tidigare täckts av en membranös mantel.
4. Välj en provtagningsperiod som är lämplig för den grupp råttor som övervakas för att förhindra insamling av övergångsprover. Ta först prov på några djur vid 2 eller 3 olika tidpunkter under dagen för att bestämma den tid där de flesta cykelstadier är närvarande (t.ex. provtagning klockan 12:00, 13:00 timmar och 14:00 timmar för olika djur). Slutför vaginalsköljningen vid samma tidpunkt varje dag för konsekvent och pålitlig iscensättning.
   OBS: Det har rapporterats att timmarna mellan 12:00 och 14:00 h är bäst för att fånga alla steg. I denna studie inträffade estrouscykelövervakning mellan 12:00 och 14:00 h, hanterad med kompressionsstilen (se steg 3.4). Betydelsen av estrous cykelövervakningstid i förhållande till andra experimentella interventioner (t.ex. beteendekonditionering, medicinering) är ett utvecklingsområde för forskning och kan utforskas ytterligare¹¹. Att bestämma varaktigheten av estrouscykelövervakningen är studieberoende och kan undersökas ytterligare i publicerade studier^11,33.
5. Ta bort skyddskåpan från mikroskopet och fäst kameran på datorn genom att ta bort det skyddande kameralinsskyddet och placera linsen över mikroskopets okular.
6. Öppna sedan den förvalda programvaran på datorn. För att använda den programvara som valts i denna studie, välj kameran som är ansluten till USB-enheten på vänster sida av skärmen, under fliken märkt Kameralista. Se till att USB-kameran är korrekt ansluten till datorn, som kommer att läsa Ingen enhet under fliken märkt Kameralista, om inte.
7. När USB-kameran har valts under fliken, slå på mikroskopets ljusströmbrytare på basen.
8. Skapa en mapp på den dator som är avsedd för cellprovfoton. Skapa en filmapp för varje separat dag som data samlas in, förberedd innan bilder tas.
9. Med utrustningen förberedd hämtar du försökspersonens bur från dess hållplats och tar den till provtagningsstationen.

3. Samling av vaginala celler

1. Hämta en engångsspruta och fyll var och en av sprutorna med 0,2 ml steril 0,9% NaCl. Om luftbubblor är närvarande, snärta försiktigt på pipsprutan tills alla luftbubblor har nått sprutans öppna spets och utvisar luften. Om det fortfarande finns luftbubblor, tryck ut lösningen tillbaka i NaCl-behållaren och fyll på tills det inte finns några.
   OBS: Överdriven snärtning kan leda till att fler luftbubblor bildas.
2. Sätt tillbaka varje spruta i plastförpackningen för att upprätthålla ett sterilt fält, med spetsen på sprutan inuti den förseglade delen av förpackningen.
3. Öppna buret och lyft försiktigt motivet med antingen svansens botten eller kroppens bagageutrymme, stäng locket på buret för att förhindra att andra går ut. Välj en anläggningsmetod bland dem som anges nedan baserat på personliga preferenser och djurens respons.
4. Använd kompressionsstilen för tonårsråttor genom att placera motivet mot det övre bröstområdet, med motivets näsa pekande ner mot marken. Innan du börjar pinnen, se till att motivet är tillräckligt komprimerat för att förhindra rörelse men är bekvämt och säkert i lastrummet. Exponera motivets vaginala kanal genom att försiktigt böja svansen innan du sätter in sprutan.
5. Använd hindbenlyftet för vuxna råttor genom att placera djurets framfötter på antingen toppen eller sidan av buren, medan svansen och bakbenen hålls fast med ett försiktigt grepp mellan första och andra fingret, vilket gör att tummen är fri att använda sprutan⁶⁴.
6. Låt djuren acklimatisera sig till hantering och övervakning. Hantera djuren försiktigt men ändå säkert för att minska överdriven stress och för att skydda forskaren från aggression som att bita.
   OBS: De första dagarna av övervakningen kanske inte ger önskat resultat eftersom djuren acklimatiserar sig till sina förhållanden. Hantering av djuren för att samla kroppsvikter under acklimatiseringsperioden kan hjälpa denna övergång³³.
7. Medan du håller sprutan stadigt med pekfingret och långfingret, sätt in sprutans spets (högst 2 mm) i en vinkel parallellt med vaginalkanalen. Driv långsamt ut NaCl i kanalen genom att trycka kolven inåt. För inte in sprutan längre in i kanalen, eftersom det kan störa estrouscykeln.
8. Extrahera NaCl från vaginalkanalen genom att dra bort sprutans kolv från epitelfodret (uppåt). Om det är svårt att hålla motivet i lastrummet under denna process, placera dem tillbaka i buren under en kort viloperiod innan du försöker extrahera NaCl.
9. När cellprovet har samlats in, placera motivet tillbaka i buret och upprepa denna procedur för varje djur innan alla prover utvärderas under mikroskopet.
   OBS: Alternativt kan varje prov samlas in och utvärderas innan du går vidare till nästa djur. Ett djur kan kräva en andra sköljning om provet inte kan kategoriseras. Samma spruta från den första samlingen kan återanvändas om den inte kommer i kontakt med saltlösningen direkt i behållaren och endast för samma djur.

4. Utvärdering av prover

1. Börja kategoriseringen genom att undersöka det vaginala vätskeprovet som extraherats. Anteckna viskositeten som antingen viskös eller ickeviscous och färgen som antingen ogenomskinlig eller genomskinlig på beskrivningsdokumentet eller annat registreringssystem.
   OBS: Detta avsnitt av protokollet kan utföras vid tidpunkten för provtagning eller senare.
2. Utvisa 2-3 droppar av vätskan på ett mikroskopglas och placera ett mikroskopglas ovanpå bilden. Placera täckglaset på mikroskopglaset från toppen av bilden till botten eller från ena sidan av bilden till den andra för att förhindra bildandet av luftbubblor. Om möjligt, lämna ungefär hälften av det uppsamlade provet i sprutan om ytterligare undersökning krävs och för att förhindra att en överflödig mängd vätska placeras på bilden.
3. Leta reda på de insamlade cellerna genom att flytta mikroskopglaset över scenen. Om det finns för få celler eller en stor mängd skräp, utvisa den återstående vätskan på en ny bild och granska igen. Om mängden prov som finns kvar i sprutan är otillräcklig, eller om den andra droppen ger liknande problem, samla in ett annat prov från försökspersonen innan du försöker identifiera estrouscykelsteget.
4. När cellerna har lokaliserats och innan du rör vid datorn eller datorns tangentbord, ta bort den ena handsken för att förhindra att tangentbordet smutsas ner.
5. Hämta bilder av cellproverna genom att klicka på funktionen märkt Snap på vänster sida av programvarupanelen.
6. Spara sedan filen genom att klicka på Spara som under Fil ikonen längst upp till vänster på sidan. Spara fotot under en förmärkt mapp på datorn.
   OBS: Exempel på etikettmall: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lins som används.
7. Ta mer än ett foto vid varje objektivlins om det inte finns många celler i varje bildruta.
   Exempeletiketter för flera bilder: #1_01/09/2021_EST_4x1 och #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Upprepa proceduren för varje insamlat prov under flera objektiva linser. Inkludera minst en mindre objektifiering, till exempel 4x, och minst en större objektifiering, till exempel 20x.
9. Ladda upp bilderna till en delad enhet/mapp eller en extern hårddisk så att alla inblandade forskare har tillgång till filerna och det finns säkerhetskopior tillgängliga.

5. Scen kategorisering

1. Ställ in datorskärmen för att samtidigt visa de tagna bilderna och inspelningsbladet (figur 4A-C).
   OBS: Detta gör att dokumentationen kan inträffa när du tittar på det insamlade provet. Denna del av protokollet kan slutföras vid tidpunkten för provtagningen eller senare.
2. Bestäm vilka celltyper som finns i provet. Välj bland de fyra alternativen som anges i stegen 5.2.1–5.2.4 med hjälp av kriterierna och registrera resultaten.
   1. Anucleated keratinized epitel (AKE) / cornified epitelceller
      1. Leta efter taggiga eller vinkelkantade celler, som ses i figur 2B och figur 5C, som trots bristen på kärnor kan visa ljusa runda områden (kärnspöken) i cellen som representerar var en kärna en gång var närvarande. Använd högre förstoring, såsom 20x och högre, för att skilja mellan sådana kärnbildade och anucleated celler.
      2. Använd högre förstoring för att skilja den keratiniserade eller kornade delen av cellen - ett tunt lager av celler som saknar kärnor och fylls med keratin - om så önskas.
         OBS: Förutom deras ojämna utseende kan dessa också särskiljas genom hur de kan vikas eller demonteras, vilket skapar ojämna och långsträckta strukturer som kallas keratinstänger.
   2. Stora kärnbildade epitelceller (LNE)
      1. Leta efter dessa vanligtvis runda till polygonala celler inneslutna av oregelbundna, taggiga eller vinklade gränser.
      2. Observera hur deras kärnor kan ta olika former, allt från intakta till degenererade eller pykontiska, relaterade till irreversibel kondensation av kromatin i kärnan i en cell som genomgår död eller försämring, vilket ses i figur 2B och figur 5D1,2. Observera hur dessa kärnor upptar mindre utrymme än cytoplasman i cellen, med ett lägre förhållande mellan kärna och cytoplasmatisk (N: C) än de små epitelcellerna. Se upp för cytoplasmatiska granuler som kan ses vid högre förstoringar¹³.
   3. Leukocyter (LEUs)/neutrofiler/polymorfonukleära celler
      1. Leta efter dessa kompakta, sfäriska celler med multilobulerade kärnor (därmed kända som polymorfonukleära celler), som försvinner när cellen mognar (figur 2B och figur 5A). Högre förstoring (t.ex. 40x) kan användas för att observera de multilobulerade kärnorna.
         OBS: Vid insamling och beredning kan dessa celler kondensera, vikas eller brista.
   4. Små kärnbildade epitelceller (SNE)
      1. Se upp för dessa runda till ovala celler som är större än de neutrofiler som beskrivs ovan.
      2. Observera de runda kärnorna i dessa icke-keratiiniserade epitelceller (figur 2B), som tar upp en större mängd utrymme än cytoplasman inuti cellen, vilket skapar ett högre N: C-förhållande i förhållande till stora epitelceller.
         OBS: Vid insamling och förberedelse kan dessa celler vikas eller överlappa varandra för att skapa en form som liknar en sträng eller stapel, som visas i figur 5B1.
3. Undersök hur cellerna i provet är organiserade för varje objektifiering. Använd den lägre objektifieringen, till exempel 4x, för att visa en representativ vy över det övergripande cellarrangemanget. Registrera om cellerna är klumpade ihop (C), jämnt dispergerade (ED) eller slumpmässigt dispergerade (RD) (se figur 4C) och notera den specifika organisationen av varje celltyp (t.ex. små kärnbildade epitelceller klumpas ihop och neutrofiler fördelas jämnt).
4. Därefter uppskattar och registrerar visuellt den totala cellmängden (en smidge, måttlig, många) och de enskilda cellmängderna (procentandel av varje celltyp närvarande).
   OBS: En smidge representerar det minsta antalet celler som finns som kan användas för att bestämma provkategoriseringen, många representerar närvaron av ett oräkneligt antal celler som antingen står för det mesta om inte hela utrymmet på bilden eller staplas ovanpå varandra, och ett måttligt antal celler representerar ett relativt genomsnittligt antal celler (exempel ses i figur 5A-D och figur 6A-D).
5. Observera om det finns några avvikelser från antingen de angivna kriterierna eller aspekter som är typiska för det specifika ämnet i kategorin "avvikelser" och rådfråga en veterinär om det behövs.
6. Bestäm vilket estrouscykelsteg som presenteras i provet med hjälp av kategoriseringskomponenterna och beskrivningarna nedan.
   1. Dö
      1. Leta efter LEUs som den dominerande eller enda celltypen närvarande, ordnade på ett klumpigt sätt i början av DIE men mer spridda i sena skeden.
         OBS: Under övergången till DIE kan mängden celler minska när epitelcellerna börjar bryta ner, vilket ses i figur 6D1. Samtidigt börjar antalet LEUs öka, och de tenderar att ordnas på ett klumpigt sätt initialt och spridas över tiden.
      2. Observera att den totala mängden celler kan vara jämförelsevis låg, oftast i de senare stadierna av DIE-perioden, den andra eller tredje dagen.
      3. Observera den höga mängden slem som kan vara närvarande i detta skede, som presenteras som koncentrerade strängar av LEUs (Figur 5A1). Se upp för små klumpar eller cellulära strängar av SNE-celler som åtföljer LEUs under sena faser i övergången till PRO (figur 5A1,2).
      4. Observera det viskösa och ogenomskinliga utseendet hos vaginalvätskan vid övergång till, helt övergång till och övergång från DIE.
         OBS: Den genomsnittliga varaktigheten av detta stadium är 48 h under en 4-dagars cykel och eventuellt 72 h under en 5-dagars cykel.
   2. PRO
      1. Leta efter SNE-celler som de dominerande cellerna och efter LEUs-, LNE- och / eller AKE-celler som kan ses i låga siffror. Använd hög objektifiering för att observera det granulära utseendet hos de SNE-celler som vanligtvis är ordnade i kluster, ark eller strängar under detta steg (figur 5B1,2).
      2. Observera det viskösa och ogenomskinliga utseendet på vaginalvätskan när du flyttar från DIE till PRO, och hur det blir nonviscous och transparent när det helt övergår till PRO-stadiet (genomsnittlig varaktighet på 14 timmar hos råttor).
   3. Est
      1. Leta efter dominans av AKE-celler, en minskning av SNE-cellerna i EST och en ökning av antalet och storleken på celler när EST fortsätter^11,13.
      2. Notera det utmärkande kännetecknet för det ofta klustrade arrangemanget av AKE-celler, i form av keratinstänger eller innehållande spökkärnor, som kan bli mer slumpmässigt spridda i övergången från PRO (figur 6B) och till MET (figur 6C).
      3. Observera den karakteristiska nonviscous och transparent vaginalvätska, som kan förväntas när råttorna övergår till, helt övergick till och övergick från EST.
         OBS: Utvecklingen av EST inkluderar mycket diversifiering (figur 5C och figur 6B, C). Scenen inträffar vanligtvis i genomsnitt 24 timmar i en 4-dagars cykel eller möjligen 48 timmar i en 5-dagars cykel.
   4. Träffade
      1. Leta efter högre antal SNE- och LNE-celler när råttan övergår till MET, antingen dominerande när det gäller cellandel i kanalen eller nära lika stor andel av LEUs^11,13. Notera vidare den större mängden skräp i MET och övergångarna än i andra steg på grund av epitelcellförfallet efter EST och flyttar in i DIE.
      2. Observera bristen på konsekvent arrangemang eftersom alla celltyper ses och i olika mängder (figur 5D1-3). Leta dock efter LEUs som är packade eller klumpade i närheten av epitelcellerna i början som kan återgå till det klumpiga arrangemanget vid övergång till DIE.
      3. Observera vaginalvätskans nonviscous och transparenta utseende i detta skede och förändringen till ett mer visköst och ogenomskinligt utseende när du flyttar in i DIE.
         OBS: Den genomsnittliga varaktigheten för detta steg är 6-8 h.
7. Märk prover i övergångar med det stadium ämnet rör sig mot, med övergången inom parentes för att spåra när dessa samlas in. Mer information om hur man skiljer mellan dessa 4 steg och deras övergångar finns i de representativa resultaten.
   OBS: Eftersom de insamlade proverna är statiska och cykeln är dynamisk kan bilderna visa övergångar mellan steg (ses i figur 6A-D).
8. Slutför denna process för varje djur tills övervakningsfasen är klar.
9. På antingen dag 11 (45 dagar) eller 21 (55 dagar), avliva råttorna med 5% isofluran och 2% syre före en giljotin halshuggning. Dessa tidpunkter kan variera beroende på studiens art.

Representative Results

De aktuella uppgifterna återspeglar de för kvinnliga ungdomar SD International Genetic Standardization Program (IGS) i närvaro av manliga SD-råttor. Dessa djur var belägna vid både Pepperdine University och UCLA laboratorier som en del av en samarbetsstudie. Figur 5 visar flera variationer av de 4 cykelstegen. Figur 5A1 identifierades som ett diestrusprov med flera celltyper närvarande. Detta exempel visar att prover med ett större antal epitelceller kvalificerar sig som diestrus när de uppfyller de andra kategoriseringskomponentkvalifikationerna, såsom en dominans av LEUs. Detta prov visade också slemsträngsarrangemanget sammansatta LEUs som ofta ses i detta skede, vilket liknar strängarna som består av SNE-celler som ses i PRO-scenen. För att skilja en slemsträng i DIE-stadiet från de strängar som förekommer i PRO-stadiet som består av SNE-celler är det viktigt att identifiera leus dominans. Figur 5A2,3 visar en cellarrangemangsprogression som ofta observeras - en initial klumpning av LJ: erna som samlar in och flyttar till en slumpmässig (RD) eller till och med utbetalning (ED) i prover som samlats in under senare perioder av DIE-scenen. Specifikt var figur 5A2 ett DIE-prov med många celler närvarande. Detta återspeglar hur LEUs också kan åtföljas av ett stort antal epitelceller (figur 5A1,2), som skiljer sig från metestrus genom en dominans av LEUs och frånvaron av keratinstänger. Däremot visar figur 5A3 att ett lågt totalt cellantal (en smidge) vanligtvis sågs under den senare fasen av DIE-stadiet, såsom under den andra eller tredje dagen. Under PRO-stadiet ordnades SNE-cellerna ofta i strängar med många celler staplade ovanpå varandra (figur 5B1) eller en smidge av celler ordnade i mindre klumpar (figur 5B2). Figur 5B3 exemplifierar ett PRO-prov med den karakteristiska arkliknande klumpningen av SNE-celler som överlappar och bildar staplar som kan förväxlas med keratinstängerna som består av AKE-celler som finns i EST-scenen. För att skilja de två är det viktigt att identifiera dominansen av SNE-celler i PRO och av AKE-celler i EST.

Figur 5C1,2 visar den typiska klumpningen och slumpmässiga utbetalningen av AKE-celler som ses i EST, där den förra inkluderar många celler och den senare ett måttligt antal. Spökkärnor, keratinstångsformationer och bakterier som ofta samlas in under detta stadium ses i dessa exempel. SNE-celler representerades ibland under EST-stadiet (figur 5C1) som rester av det tidigare PRO-steget. Det sena EST-stadiet, när SNE-celler börjar dyka upp när ämnet rör sig mot MET, misstas ofta för PRO-scenen. För att skilja de två är det viktigt att ta hänsyn till kärnkraftsstorleken. I allmänhet har de kärnbildade cellerna i PRO ett högre N: C-förhållande. Provet som visas i figur 5C3 presenterade ett strängliknande arrangemang av många AKE-celler som inte sågs som en egenskap hos EST-scenen. Detta visar att varje djur är unikt, att avvikelser från kriterierna kan förekomma och att de kategoriserande bestämningsfaktorerna ska undersökas i kombination.

För att skilja mellan EST och PRO när SNE-celler är närvarande såg man att ett lägre N: C-förhållande inträffade i dessa celler under EST-scenen. För att skilja keratinstängerna som finns i EST från de som bildas genom överlappning eller rullning av SNE-celler i PRO-scenen (figur 5B3) och de som bildas av sönderfallande epitelceller i övergången från MET (figur 6D1) är det viktigt att identifiera den dominerande celltypen, arrangemanget och kvantiteten för att skilja det stadium som representeras. Slutligen exemplifierar figur 5D1,2 kombinationen av alla celltyper som finns i den slumpmässiga utbetalningen som representerar MET-stadiet. Förutom de många celler som finns i dessa exempel var det vanligt att samla en högre mängd skräp under detta stadium (figur 5D2) på grund av sönderfallet av epitelceller efter EST och övergången till DIE med en dominans av LEUs som fungerar för att rensa vaginalkanalen i epitelceller. Figur 5D2 visar också hur MET kan särskiljas från DIE genom sin högre koncentration av epitelceller och närvaron av keratinstänger. Sammantaget visar dessa representationer det breda spektrumet som finns inom varje steg och är icke-uttömande.

Representationer av de 4 övergångsfaserna visas i figur 6. Medan denna studie kategoriserade prover i övergång som ett av de 4 estrous cykelstadierna, är det fortfarande viktigt att identifiera övergångsfaserna ordentligt. Vid övergången från DIE till PRO (figur 6A) skedde ofta en total minskning av antalet LEU och en ökning av antalet SNE-celler. LNE- och AKE-celler var ibland närvarande i denna övergång, men inte i stora mängder (figur 6A1). Figur 6A2-4 visar det högre antalet klumpiga och slumpmässigt dispergerade SNE-celler som ofta samlades in under denna övergång, med ett lågt antal slumpmässigt och jämnt spridda LEUs. Sammantaget, när man skiljer sig från andra övergångsstadier, var det viktigt att notera dominansen av SNE-celler och början på klumpar och strängformationer som ses i PRO. Alla exempel i figur 6A representerar ett antal celler utom figur 6A4, med en smidge. I figur 6B visar bilden ett exempel på många klumpiga SNE- och AKE-celler som ses i övergången från PRO till EST.

Under denna övergång ses SNE-celler vara i högre antal med mindre klumpiga och mer slumpmässiga utbetalningar av AKE-celler än under EST. Det närvarande skräpet representerar de sönderfallande AKE-cellerna från det tidigare estrusstadiet som ofta ses i metestrus. Detta ses också i det sista övergångssteget, från MET till DIE, där epitelcellerna började sönderfalla och producera skräp (figur 6D1,2), med många celler närvarande i den förra och ett måttligt antal i den senare. Dessa siffror visar fenomenet att LEUs ökar i antal för att bli den dominerande celltypen i övergången till diestrus. För gruppen som övervakades i 20 dagar (n = 3) var det 12 dagar då övergångsprover samlades in, med ett genomsnitt på 4. För gruppen som övervakades i 10 dagar (n = 3) fanns det 9 dagar då övergångsprover samlades in, med ett genomsnitt på 3.

Figur 7 representerar ogynnsamma cellprovsamlingar, varav en majoritet motiverade upprepade sköljningar. Figur 7A1 visar en massa skivepitelceller som samlats in på grund av en felaktig sprutainsättning och extraktion, vilket gör att skivepitelceller sugs av vaginalkanalväggen. Dessa celler kan särskiljas från klumpade epitelceller eller LEUs på grund av massans höga densitet och kompaktitet och dess distinkta gränser. Figur 7B representerar en samling skräp, där antingen inga celler extraherades, fokusplanet är felaktigt eller bilden inte helt skannades efter celler. Skräp kan särskiljas från celler genom förtrogenhet med celltyperna och den ofta distinkta lilla storleken och klumpen. Detta skräp härrör ofta från djurströ, hår eller cellförfall. Bild 7C visar en bild som innehåller ett cellantal som ligger under en smidge. Medan lågt cellantal vanligtvis sågs under sen MET och tidig DÖ, representerar detta bilder som har för få celler för att exakt kategorisera i ett stadium.

Figur 7D visar två exempel på NaCl-extraktionslösningen i kombination med vaginalvätska från kanalen på mikroskopglaset. I den första bilden, figur 7D1, var vätskan närvarande och ur fokus, vilket hindrade förmågan att exakt kategorisera. I figur 7D2 spreds vätskan över bilden i sammanhängande cirklar längs med ljuvarna. Även om detta exempel inte kräver en upprepad sköljning på grund av den höga cellnärvaron, är det viktigt att överväga mängden vätska som placeras på bilden och placeringen av mikroskopets täckglas för att förhindra utstryk. Sammantaget betonar dessa bilder vikten av att fånga representativa kvalitetsbilder för korrekt kategorisering. Detta inkluderar att överväga sättet att extrahera celler, fokusplanet och innehållet i bilden genom att skanna varje bild innan du tar en bild.

Efter att ha kategoriserat varje djur i experimentgruppen /grupperna är det vanligt att grafera scenens progressioner på antingen en stapel eller ett linjediagram. Detta gör det möjligt för forskare att undersöka det övergripande cykelmönstret och identifiera när djuret presenterar en oregelbunden progression av estrousstadierna, känd som acyklicitet. Proverna kan sedan analyseras med cykellängden och stegprogressionsmönstret i detta analysverktyg. Detta koncept visas i figur 8A,B och innefattar att tilldela staplar av varierande höjd, i fallet med denna studie, till de enskilda stegen och översätta inspelade data (figur 4B) över x-axeln. I dessa exempel representeras MET och DIE av den lägsta, PRO av mitten och EST av de högsta stapelhöjderna. På grund av MET-stegets korta varaktighet kombineras det med DIE-steget i en stapel. Även om det finns olika metoder för att mäta cykelavslutningar, är det vanligt att räkna en hel cykel som rörelsen från en EST till en annan¹¹. Detta återspeglar dock inte en cykelavslutning utan en 2-dagars EST-stegs varaktighet när det finns på varandra följande EST-steg.

Figur 8A återspeglar data från en råtta som fortskrider genom en konsekvent och repetitiv progression genom MET/DIE, PRO och EST. Varje steg överskrider inte de standardiserade längdintervallen, med i genomsnitt 1,0625 dagar tillbringade i EST, en typisk utvärdering för acyklicitet. Om de data som extraheras följer detta mönster av EST till EST med regelbundenhet, bekräftar detta inte bara att ämnets hormonnivåer förblev inom acceptabla intervall, utan också att proceduren genomfördes utan att signifikant avbryta processens cykliska karaktär. Slutligen slutförde denna råtta 16 cykler, bestämda genom att räkna antalet EST till EST-staplar.

Figur 8B representerar vanliga typer av acyklicitet, inklusive utökade (ses som EXT) och oregistrerade stadier. Denna siffra belyser också vikten av att undersöka både cykelmönstret och längden och antalet dagar som spenderas i varje steg. Specifikt, i detta exempel, medan den genomsnittliga cykellängden och antalet dagar i EST faller inom skisserade parametrar, avslöjade cykelmönstret för stegprogression avvikelser. Därför är det viktigt att undersöka estrouscykeln omfattande. Både utökade DIE -steg (märkta som Ext Diest) och EST (märkta som Ext Est) registrerades under de cykler som visas i figuren, och det fanns flera cykler där PRO -steget inte registrerades. Detta exempel visar också vikten av att undersöka antalet på varandra följande steg som ses, som faller utanför typiska intervall, snarare än att enbart undersöka den genomsnittliga längden på cykeln och dagarna i EST, som faller inom typiska intervall.

Orsakerna och korrelationerna till dessa exempel kan inkludera faktorer som fysiologiska avvikelser (tumörer, pseudograviditet, långvarig stress), skadliga miljöförhållanden (långvarig belysning, exponering för giftiga kemikalier, enstliga bostäder), felaktig tidpunkt för provinsamling, forskarfel (dålig provinsamling, bildtagning, felaktig iscensättning), åldersrelaterade fenomen (vanlig oregelbundenhet som ses i tonåren och reproduktiv åldrande) eller avvikelser som är unika för den specifika djur. För att separera forskarfel eller felaktig tidpunkt för provinsamling och fysiska avvikelser eller åldersrelaterade fenomen är det till hjälp att undersöka de 4 kategoriserande komponenterna mer detaljerat. Detta kan hjälpa till att bestämma de möjliga orsakerna till oegentligheter eller, i en bredare mening, kan användas i studier som studerar estrouscykelegenskaperna närmare.

Figur 9 illustrerar denna närmare granskning genom att inkludera totala och enskilda cellmängder på y-axeln, celltyper som representeras av olika stapelfyllningsfärger och cellarrangemang som representeras av olika stapelfyllningsmönster, diagram över den totala övervakningsperioden. Denna analysmetod möjliggjorde undersökning av det totala antalet genomförda cykler, längden på varje cykel, stegprogression och kategoriseringskomponenterna mer detaljerat för varje enskild råtta. Figur 9A representerar en råtta som hade ett lägre antal cykler än genomsnittet, med totalt 3 hela cykler under de 10 dagar som övervakades - två 3-dagarscykler och en 5-dagars cykel (genomsnitt 3,67). Oregelbundenheten som ses i stegprogressionen med 50% av dagarna inkluderade ett eller flera oregistrerade steg och 30% av de insamlade proverna var i övergång-dag 2 som en MET-DIE, dag 5 som en EST-MET och dag 8 som en PRO-DIE-övergång. Detta kan ha berott på felaktig tidpunkt för provtagning, forskarfel, ett åldersrelaterat fenomen eller unika avvikelser. Ytterligare övervakning kunde ha gett klarhet om vilka som gällde.

De typiska dominerande arrangemangen, celltyperna och individuella och totala cellmängder sågs inom vart och ett av de registrerade stadierna. Inom EST-stadierna sågs en smidge (25% av proverna), måttlig (25% av proverna) och många (50% av proverna) klumpiga AKE-celler, med en lägre närvaro av LEUs, SNE och LNE-celler. I det enda MET-steget som fångades var en kombination av många slumpmässigt dispergerade LEUs (50%), AKE-celler (20%), LNE (15%) och SNE (15%) celler närvarande. För DIE-stadierna sågs en smidge (50% av proverna) och många (50% av proverna) slumpmässigt dispergerade, jämnt dispergerade och en kombination av dominerande LEUs varvat med AKE-, LNE- och SNE-celler. I det enda pro-steg som samlades in var en smidge av slumpmässigt dispergerade LEUs (60% av cellerna närvarande) och SNE-celler (40% av de närvarande cellerna), som var i en kombination av arrangemang, närvarande, vilket representerade en övergång från DIE till PRO.

I figur 9B hade den representerade råttan totalt 3 kompletta cykler, med ett 4-dagars cykelmönster. De insamlade proverna representerade inte en konsekvent stegprogression, med en förlängd DIE-period (dag 6-9) och 5 andra fall av oregistrerade steg (2 oregistrerade MET-steg, 2 oregistrerade PRO-steg och 1 oregistrerat EST-steg). Eftersom endast 20 % av proverna var i övergång (dag 3 som DIE-PRO, dag 5 som EST-MET, dag 18 som MET-DIE och dag 19 som DIE-PRO), och endast 3 steg inte registrerades utanför MET-stadiet och den förlängda DIE-perioden, drogs slutsatsen att tidpunkten för provtagningen var lämplig för detta specifika djur. Eftersom de senaste 10 övervakade dagarna inkluderade en ordnad progression genom de 4 stegen, kunde de initiala oegentligheterna hänföras till ungdomsåldern. Den mer ökade övervakningstiden (20 dagar) möjliggjorde denna slutsats.

Undersökningen av de kategoriserande komponenterna avslöjade typiska intervall. EST-stadierna återspeglade en dominans av en måttlig (50% av proverna) till en mängd (50% av proverna) av klumpiga AKE-celler med färre LEUs-, SNE- och LNE-celler. I de insamlade MET-proverna fanns en kombination av en måttlig (33,33% av proverna) till många (66,67% av proverna) slumpmässigt dispergerade och klumpade LEUs (med ett kvantitetsintervall på 10-90%), klumpig SNE (0-30%), slumpmässigt dispergerad LNE (0-10%) och klumpade och slumpmässigt dispergerade AKE-celler (10-90%). DIE-stadierna återspeglade en dominans av en måttlig (20%) till en talrik (80% av proverna) mängd jämnt dispergerade, slumpmässigt dispergerade och klumpade LEUs (intervall 50-100%) i närvaro av både slumpmässigt dispergerade AKE- och SNE-celler. PRO-stadierna identifierades av dominansen av en smidge (3,33% av proverna) och många (66,67% av proverna) mängden slumpmässigt dispergerade och klumpade SNE (10-99%) celler i närvaro av LEUs,AKE och LNE-celler.

Ett annat alternativ när du analyserar de data som extraheras är att skapa estrouscykelprofiler genom att inkludera de element som tidigare beskrivits - totala och enskilda cellmängder på y-axeln, celltyper som representeras av olika stapelfyllningsfärger och cellarrangemang som representeras av olika stapelfyllningsmönster, graferade över den totala övervakningsperioden för varje cykelsteg. Detta kan slutföras per råtta eller medelvärden för hela gruppen. Syftet med detta analysverktyg är att undersöka de kategoriserande komponenttrenderna per steg, vilket hjälper det övergripande vetenskapliga samfundet att karakterisera de kategoriserande komponentskillnaderna som är specifika för kategoriseringsstegskategoriseringarna. I figur 10A1 visade 10 dagars DIE-profilen en dominans av en måttlig (50% av proverna) och många (50% av proverna) mängden jämnt dispergerade LEUs (i genomsnitt 78.25%) tillsammans med färre SNE-, AKE- och LNE-celler. I figur 10A2 uppvisade 20-dagars diestrusprofilen en dominans av en måttlig (20% av proverna) och många (80% av proverna) mängd jämnt dispergerade, klumpade och slumpmässigt dispergerade LEUs (i genomsnitt 82% som närvarande under alla 10 dagar) tillsammans med ett lägre antal AKE- och SNE-celler.

PRO-stadiet som visas i figur 10B1 visade en dominans av ett måttligt antal slumpmässigt dispergerade SNE-celler (60%) i närvaro av LEUs och AKE-celler. 20-dagars PRO-scenprofil i figur 10B2 visade en dominans av en smidge (33,33% av proverna) och en talrik (66,67% av proverna) mängd av en kombination av arrangemang och slumpmässigt dispergerade SNE (i genomsnitt 66,33% som finns i alla 3 prover) celler tillsammans med LEUs och AKE-celler. 10-dagars EST-profilen som ses i figur 10C1 uppvisade en dominans av en måttlig (50% av proverna) eller en mängd (50% av proverna) mängd AKE-celler (i genomsnitt 80% för de 2 närvarande dagarna) i en kombination av arrangemang, tillsammans med ett lägre antal LEUs-, SNE- och LNE-celler. I figur 10C2 uppvisade 20-dagars EST-profilen en dominans av måttliga (75% av proverna) eller en mängd (15% av proverna) antal slumpmässigt dispergerade AKE -celler (i genomsnitt 57,5% för de 4 närvarande dagarna) eller de i en kombination av arrangemang, tillsammans med ett lägre antal LEUs-, SNE- och LNE-celler.

10 dagars MET-scenprofil i figur 10D1 inkluderade många slumpmässigt dispergerade LEUs (50%), AKE (20%) celler och SNE (30%) celler. 20 dagars MET-stegprofil i figur 10D2 uppvisade en måttlig (3,33% av proverna) eller en mängd (6,667% av proverna) mängd LEUs (i genomsnitt 50% i alla 3 prover), SNE (i genomsnitt 15% som finns i alla 3 prover), AKE-celler (med 23,33% i de 3 närvarande proverna), LNE-celler (i genomsnitt 15% i alla 2 närvarande prover). Hälften av levlarna var slumpmässigt dispergerade (1 prov) och de återstående 50% var en kombination av arrangemang (1 prov). Två tredjedelar av SNE-cellerna dispergerades slumpmässigt när de var närvarande, medan de återstående 33,33% var i en kombination av arrangemang när de var närvarande (1 av 3 prover). Slutligen klumpades 66,67% av AKE-cellerna i de närvarande proverna (2 dagar), medan de återstående 33,33% var i en kombination av arrangemang (1 dag). Tabell 1 innehåller de numeriska medelvärdena för de kategoriserande determinanterna från de två grupperna. Medan data i figur 9A, B och figur 10A-D innehåller information om kategoriseringsfaktorerna från enskilda djur, innehåller dessa tabeller medelvärden för estrusstadiet som ett exempel. När de reproduceras i andra laboratorier kan dessa parametrar bli standarden för scenidentifiering. Detta kan i sin tur minska den subjektivitetsnivå som för närvarande är involverad i iscensättningsprocessen.

Statistik
I allmänhet finns det några parametrar att tänka på när man tolkar cykelegenskaperna, även om det saknas konsensus om vad som anses vara "onormalt" och avvikelser är typiska. identifiera "vanlig" som en 4-5 dagars cykel med 24-48 h EST och 48-72 h DIE steg¹¹. Avvikelse från dessa parametrar kan bero på olika faktorer, inklusive en eller flera fysiologiska avvikelser, felaktig insamlingstidpunkt eller den initiala acykliciteten som ofta upplevs av unga råttor när hormonnivåerna mognar. Förutom att konsultera laboratorieveterinären, möjliggöra en försöksuppsamlingsperiod för att säkerställa korrekt timing och övervaka djur förbi tonåren för att upprätta en jämförande tidslinje, kan statistiska analyser vara till hjälp för att tillskriva orsakssamband och / eller korrelation till eventuella avvikelser. Efter att ha karakteriserat cyklerna i kategorier (t.ex. konsekventa och onormala) kan en chi-square-analys hjälpa till att jämföra grupperna. Dessutom kan de kategoriserande komponenterna eller allmänna cykelegenskaperna jämföras efter intervention med hjälp av variansanalys (ANOVA)¹¹. Sådana avvikelser kan emellertid inte vara biologiskt meningsfulla, som diskuteras i inledningen, och därför måste det experimentella sammanhanget beaktas.

Figur 1: Hormonrytmicitet i estrous cykelstadier. Stegprogressionen börjar och slutar med metestrus för att demonstrera bygghormonnivåerna och den cirkulära progressionen av processen. Anpassad från en extern källa¹¹. (B) Flöde av könssteroidhormoner från centrala nervsystemet till reproduktionssystemet via blodomloppet. Det ses att hormonnivåerna ökas genom signaler från hypotalamus och hypofysen via gonadotropinfrisättande hormon (GrH eller LHRH) och kombinationen av follikelstimulerande hormon respektive luteiniserande hormon. Detta inkluderar både positiva och negativa återkopplingsslingor beroende på koncentrationen av östradiol och progesteron. Information¹⁷ och bilder spårade från externa källor 65,66,67. Förkortning: LHRH = luteiniserande hormonfrisättande hormon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Estrous cykelkategorisering av uppmätta determinanter. (A) Listade här är de komponenter som används vid iscensättning av de insamlade cellproverna och de dominerande komponenterna för varje steg. Det är viktigt att komma ihåg att det här är allmänna parametrar och skillnader förväntas. (B) Här är de dominerande celltyperna som finns i varje steg. Även om dessa är allmänna uppdelningar, kan varje celltyp hittas inom alla steg. (C) Här presenteras de cellarrangemangstyper som finns i denna studie. (D) Bilden här återspeglar de typiska cellmängderna som finns i vart och ett av de 4 estrouscykelstegen, med kvadrantvolymen som representerar de ungefärliga cellmängderna. Hämtad från en extern källa¹³ och tidigare anpassad⁶⁸. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Vaginal öppning hos Sprague Dawley råttor(A) Anatomisk orientering av de outvecklade yttre könsorganen och vaginalöppningen som leder till vaginalkanalen i förhållande till urinrörsöppningen. (B) Visuell representation av det outvecklade området, markerat med en pil. (C) Anatomisk orientering av de utvecklade yttre könsorganen och vaginalöppningen i förhållande till urinrörsöppningen, som vanligtvis uppträder runt 34 dagars ålder. (D) Motsvarandevisuell representation av det utvecklade området som beskrivs i bild A. Alla siffror kommer från en extern källa²⁹. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Kategorisering av determinanter dataregistreringsmall. innehåller beskrivningar av kategorisering av determinanter. Detta ska användas dagligen, en för varje råtta som övervakas. (B) Denna mall är ett alternativ för datainmatning, med en förenklad registrering av kategoriseringsdeterminanterna och råttidentifieringen. Detta gör att anteckningar kan matas in i databladet i den andra PRO-kategoriseringen. Färgen på den övre raden återspeglar den färg som tilldelats den representerade experimentgruppen, vilket hjälper till att skilja en grupp från en annan. (C) Ett annat mallalternativ; inkluderar alla kategoriserande determinanter och kan modifieras baserat på personliga preferenser eller mål för studien. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEU = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel; C = klumpad; ED = jämnt dispergerad; RD = slumpmässigt spridd; COM = kombinerad; SMD = smidge; MOD = måttlig; NUM = många; EXE = övning; SED = stillasittande; Est = estrus; Die = diestrus; met-die = metestrus-diestrus övergång; Pro = proestrus; pro-Est = proestrus-estrus övergång; ** = kvalitetsexempel som kan vara till hjälp i en publikation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Scenkategoriserande determinantvariationer. Den första bilden (A1) visar en slemavlagring representerad av strängar av koncentrerade LEUs, med epitelceller närvarande i slumpmässiga utbetalningar. Detta är ett exempel på vikten av att använda både 4x och 10x förstoring. Denna 4x förstoring verkar likna en proestrussträng men vid närmare granskning vid 10x, visar en dominans av LEUs. Den andra bilden (A2) visar vad som ofta sågs i diestrusstadier - en dominans av LEUs sett tillsammans med ett klumpigt arrangemang av epitelceller: SNE-, LNE- och AKE-celler. Den sista bilden i denna serie (A3) återspeglar en slumpmässig utbetalning av LEUs, som ofta ses inom diestrusfasen mitt i vaginala och saltlösningsvätskedroppar. (B) Denna serie bilder visar olika exempel på proestrusstadiet. Den första bilden (B1) visar ett klumpigt arrangemang av SNE-celler i strängar. Den andra bilden (B2) återspeglar en bild med ett lägre totalt cellantal och en klumpning av SNE-celler. Den tredje bilden (B3) visar den vanliga klumpningen och mer slumpmässiga utbetalningen av SNE-celler och det låga antalet LEUs- och AKE-celler. (C) Denna serie bilder visar olika exempel på estrusstadiet. Den första bilden (C1) visar ett vanligt klumparrangemang av AKE-celler, med keratinstångsformationer, i närvaro av SNE-celler. Den andra bilden (C2) presenterar klumpningen av AKE-celler med spökkärnor och bakterier. Den sista bilden (C3) presenterar ett strängliknande arrangemang av AKE-celler. (D) Denna serie bilder visar olika exempel på metestrusstadiet. Den första bilden (D1) visar slumpmässig utbetalning och klumpning av LEUs, SNE-celler, AKE-celler och LNE-celler i närvaro av skräp. Den andra bilden (D2) återspeglar alla celltyper som finns i ett klumparrangemang, tillsammans med keratinstänger. Den sista bilden (D3) visar ett mer omfattande arrangemang av de närvarande LEUs-, SNE-, AKE- och LNE-cellerna. Dessa siffror, tagna vid antingen 4x (A1, A2, B2, B3, D1 och D3) eller 10x (A3, C1, C2, C3 och D2) objektifiering, har zoomats in för att möjliggöra ökad visualisering av kategoriseringskomponenterna. Skalstänger = 100 μm. För storleksreferens; AKE-celler har en diameter på cirka 40-52 μm, LEUs på cirka 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm och SNE-celler på cirka 25-32 μm¹⁶. Förkortningar: SNE = litet kärnbildat epitel; LNE = stort kärnbildat epitel; AKE = anucleated keratiniserat epitel; LEUs = leukocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Övergångsstegsprover. Den första bilden (A1) visar stora klumpar och slumpmässig utbetalning av LEUs, SNE, LNE och AKE-celler. Den andra bilden (A2) innehåller en stor massa klumpiga ALU och SNE med insprängda strängar av LEUs. Den tredje bilden (A3) innehåller klumpar och till och med utbetalningar av LEUs och en liten mängd SNE. Den fjärde och sista bilden (A4) visar både klumpiga och slumpmässigt utbetalda SNE-celler och LEUs. (B) Den här bilden visar ett exempel på övergången mellan PRO- och EST-steg med klumpning av SNE- och AKE-celler. (C) Den här bilden visar klumpning och slumpmässig utbetalning av AKE-, SNE- och LNE-celler som ses mitt i skräp för att representera övergången från EST till MET. (D) Den första bilden (D1) visar ett exempel på övergången mellan MET- och DIE-steg, med sönderfallande epitelceller som åtföljer en ökning av LEUs. Den andra bilden (D2) visar AKE-celler i närvaro av klumpiga LEUs och SNE-celler som tidigare beskrivits. Dessa siffror, tagna med antingen 4x (A1, A2, A3, B och C) eller 10x (A4, D1 och D2) förstoring, har zoomats in för att möjliggöra ökad visualisering av kategoriseringskomponenterna. Skalstänger = 100 m. För storleksreferens har AKE-celler en diameter på cirka 40-52 μm, LEUs på cirka 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm och SNE-celler på cirka 25-32 μm¹⁶. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEUs = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel; C = klumpad; EST = estrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

(A) I dessa två bilder sugs skivepitelceller från vaginalkanalväggen, förutom slumpmässigt dispergerade LEUs. (B) Den här bilden innehåller en låg mängd skräp, där celler antingen inte sågs eller inte samlades in. (C) I det här exemplet sågs ett totalt lågt cellantal. (D) I dessa två bilder (D1 och D2) sågs extraktionslösningen natriumklorid (NaCl) och vaginalvätskan och spreds genom mikroskopglasen. Dessa siffror, tagna med antingen 4x (A1, A2 och D1) eller 10x (B, C och D2) förstoring, har zoomats in för att möjliggöra ökad visualisering av kategoriseringskomponenterna. Skalstänger = 100 μm. För storleksreferens har AKE-celler en diameter på cirka 40-52 μm, LEUs på cirka 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm och SNE-celler på cirka 25-32 μm¹⁶. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEUs = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

(A) Den här bilden återspeglar totalt 16 kompletta cykler som fortskrider genom ett repetitivt och konsekvent mönster, vilket återspeglar den regelbundna svängningen av könssteroidhormoner. Inom detta representeras diestrus av den lägsta, proestrus i mitten, och estrus representeras av baren i den högsta höjden. Dessa data analyseras genom att spåra dagarna mellan estrusstadierna, där varje estrus-till-estrus representerar en hel cykel. Dessa data återspeglar data från honråttorna som finns på UCLA. (B) Denna bild representerar en teoretisk kombination av olika acykliska mönster av 22 råttor. Förlängd estrus kan ses med flera repetitiva dagar med staplar i full höjd, förlängd diestrus sett med flera repetitiva dagar med den lägsta stapelhöjden och frånvaron av det cykliska progressionsmönstret från diestrus till metestrus. Förkortningar: Est = estrus; Diest/Die = diestrus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Individuella kategoriseringsdeterminanter(A) Detta staplade stapeldiagram återspeglar varje komponent i verktygen som används för att kategorisera enskilda prover som samlats in i de östra provstegen. Här visar ett ämne som övervakades i 10 dagar en mängd olika celltyper, kvantiteter och arrangemang. Detta förväntas för tonårsdjur, eftersom hormonnivåerna vanligtvis inte blir konsekventa eller regleras förrän i vuxen ålder. (B) Här presenteras en estrousprofil för ett djur som övervakades i 20 dagar. Liknande oegentligheter kan ses här, där ämnet förblev i diestrus i 4 dagar jämfört med den typiska 1-2. Dessa data representerar de 6 honråttor som finns vid Pepperdine University. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEU = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel; C = klumpad; ED = jämnt dispergerad; RD = slumpmässigt spridd; COM = kombinerad; SMD = smidge; MOD = måttlig; NUM = många; EXE = övning ; SED = stillasittande; Est = estrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figur 10: Scenprofiler. (A) Detta avsnitt visar kategorisering av determinantdata för enskilda råttor under varje dag kategoriserad som diestrus. Den första bilden (A1) representerar data som samlats in under 10 dagar och den andra (A2) i 20 dagar. (B) Detta avsnitt visar data för enskilda råttor under varje dag kategoriserade som proestrus. Den första bilden (B1) representerar data som samlats in under 10 dagar och den andra (B2) i 20 dagar. (C) Detta visar data för enskilda råttor under varje dag som identifieras som estrusstadium. Den första bilden (C1) representerar data som samlats in under 10 dagar och den andra (C2) i 20 dagar. (D) Detta avsnitt av serien visar kategoriseringskomponentdata för enskilda råttor under varje dag som identifieras som metestrusstadium. Den första bilden (D1) representerar data som samlats in under en period av 10 dagar och den andra (D2) i 20 dagar. Uppgifterna i dessa siffror återspeglar de 6 honråttor som finns vid Pepperdine University. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEU = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel; C = klumpad; ED = jämnt dispergerad; RD = slumpmässigt spridd; COM = kombinerad; SMD = smidge; MOD = måttlig; NUM = många; EXE = övning ; SED = stillasittande; Est = estrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

EST: 10 dagar	Varaktighet (dagar)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	Nationell expert (%)	Totalt antal celler (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUMMER: 44.44 SMD: 11.11
Spänner	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge–många
	Arrangemang	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 dagar	Varaktighet (dagar)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	Nationell expert (%)	Totalt antal celler (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUMMER: 50 SMD: 0
Spänner	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge–många
	Arrangemang	C: 60 Publik: 6,67 Rd: 33,33	C: 0 ED: 12,5 Rd: 87,5	C: 33,33 ED: 0 RD: 66,67	C: 44,44 ED: 0 Rd: 55,56

Tabell 1: Genomsnittligt stadium determinantprov. Dessa tabeller visar medelvärdena för de kategoriserande determinanterna och översikten för alla INSAMLADE EST-steg. Den övre tabellen återspeglar medelvärdena för alla djur som övervakas i 10 dagar och den nedre tabellen i 20 dagar. Detta inkluderar varaktigheten av estrouscykeln, celltyperna och procentsatserna och cellarrangemangen och procentandelen av varje arrangemang som ses för varje celltyp. Dessa data återspeglar data från 6 honråttor inrymda vid Pepperdine University. Förkortningar: AKE = anucleated keratinized epitel; LEU = leukocyter; LNE = stort kärnbildat epitel; SNE = litet kärnbildat epitel; C = klumpad; ED = jämnt dispergerad; RD = slumpmässigt spridd; EST = estrus.

Discussion

Viktiga steg och viktiga överväganden
Vissa kritiska steg i det tillhandahållna protokollet kräver betoning, särskilt inom samlingen av vaginala celler. Under vaginal vätskeutvinning är det viktigt att säkerställa rätt vinkel och djup för sprrutinsättning för att ge tillfredsställande resultat och i slutändan förhindra irritation, skada eller livmoderhalsstimulering till djuret. Stimuleringen av livmoderhalsen kan vara en källa till pseudogravinduktion, indikerad av 12-14 dagar av ett leukocyt-endast vaginalt smet¹¹. Under mikroskoputvärderingsfasen är det viktigt att fokusera på det visuella planet som visar de insamlade vaginala cellerna. Detta slutförs genom att identifiera en eller två celler och justera visualiseringen tills fokus uppnås.

Efter detta sker att ta representativa bilder av vaginalcellerna för iscensättning genom att skanna hela mikroskopglaset. Detta säkerställer att de bilder som tas återspeglar en korrekt skildring av vad som samlas in och finns i djurens vaginala kanal. Före kategorisering är förtrogenhet med de kategoriserande determinanterna nödvändig, såsom att skilja celltyperna och de olika transformationerna som varje celltyp kan ha. Det rekommenderas att varje deltagare är ordentligt utbildad och övar scenidentifiering genom förberedda övningsbilder.

För att minska mängden bias och subjektivitet som är involverad i processen rekommenderas att inkludera två deltagare i kategoriseringsfasen, båda förblir blinda för behandlingsgruppens uppdrag samtidigt som de känner till tidigare inspelade scenidentifieringar för varje djur. Att tilldela två deltagare att kategorisera prover möjliggör konferens och en minskning av subjektiviteten i identifieringarna. Om deltagarna ska kategorisera prover separat rekommenderas dock att det finns en inledande samarbetsperiod för att öka inter-rater tillförlitligheten när expertis utvecklas. Ett sekundärt undersökningssystem kan användas för att förhindra inkonsekventa resultat, till exempel utbyte av datamängder efter kategorisering och användning av fotona för att bekräfta de första bedömningarna.

Begränsningar och modifieringar
Begränsningar av den nuvarande tekniken inkluderar varaktigheten av livskraften. På grund av den skada eller irritation som kan följa med upprepad insättning av en spruta är långvarig och återkommande övervakning inte i linje med korrekt skötsel och användning av djur. När man utför en longitudinell studie kan det därför vara nödvändigt att ändra proceduren genom att minska sköljningens frekvens. Till exempel, i stället för att övervaka varje djur en gång per dag, kan råttorna delas in i grupper som övervakas på olika dagar under hela veckan. En andra begränsning innefattar frånvaron av provfärgning i den beskrivna processen, utan separering av cellulära komponenter efter färg, vilket skapar ett större beroende av kategoriseringsdeterminanterna som anges i protokollet ovan.

Dessutom finns det inom sådana kategoriseringsdeterminanter element av subjektivitet som kan begränsa exakt replikering. Specifikt är cellkvantitetsprocenten i insamlade prover baserade på personliga uppskattningar. Modifieringar i detta avseende kan inkludera att utveckla en matematisk algoritm för att kvantifiera de enskilda celltyperna som finns. Alternativa modifieringar kan inkludera antalet prover som deponeras på ett mikroskopglas, vilket kan ökas beroende på storleken på bilden och locket. Ytterligare begränsningar kan inkludera bristen på vaginalvätskedata i denna studie - en modifiering av framtida studier kan inkludera registrering av villkoren för vaginalvätskan som samlats in som ett bidrag till scenkategorisering. Ytterligare modifieringar av protokollet kan inkludera användning av en annan isotonisk vätska för cellextraktion, vilket skulle ge samma resultat, såsom fosfatbuffrad saltlösning¹³. Slutligen, när detta förfarande tillämpas på råttor i olika åldrar eller stammar, kan ändringar såsom djurhanteringstekniker krävas på grund av kroppsstorlek eller aktivitetsnivå. Detta kan inkludera greppmetoden⁶⁹ och Forelimb Crisscross^64-metoderna för vuxna och en- och tvåhandsbegränsning^64-metoden som används för yngre råttor.

Alternativa metoder
Jämfört med alternativa metoder för estrous cykelövervakning är den vaginala sköljningen unik i sin noggrannhet, mängden information som produceras, minimal invasivitet och låga tillhörande kostnader. Den histologiska undersökningen av livmodern och äggstockarna kan användas för att identifiera cykelstadier men är mer påträngande och tillåter inte kontinuerlig övervakning. Medan mätning av könssteroid hormonnivåer hjälper till med övervakning av estrous cykeln, Det kräver bloduppsamling och tillåter inte karakterisering av den unika cellulära eller vaginala vätskeprofilen för varje ämne. Eftersom utvecklingen av yttre könsorgan är indirekt korrelerad med könssteroidhormonnivåer kan undersökningen av vaginalöppningen ge information om sexuell mognad. Dessutom har färgningen av vävnaden, fuktnivån, storleken och svullnaden i vaginalöppningen korrelerats med estrouscykelstegen⁷⁰. Den exakta fysiologin som leder till öppningen av vaginalkanalen hos råttor har dock ännu inte rapporterats fullständigt. Nya publikationer har funnit att detta bara är en indirekt markör för reproduktiv utveckling och inte alltid överensstämmer med pubescens ^31,34. Den biokemiska analysen av urinprover är kostnadseffektiv och lätt att genomföra, men tillåter inte specificiteten och tillförlitligheten hos andra metoder⁷¹. Därför är det inte lika tillförlitligt eller giltigt som att undersöka cellerna som finns i vaginalkanalen.

Dessutom har mätningen av elektrisk impedans använts för att övervaka estrouscykeln och är mindre fysiskt irriterande än vätskesköljningen. Denna metod ger emellertid inte så mycket information om kategoriseringskomponenterna. Denna enhet är speciellt utformad för att optimera tidpunkten för avsiktlig parning, mäta när könssteroid hormonnivåer är högst 72,73,74. Dessutom har det rapporterats att denna metod är effektiv för att skilja mellan EST och nonEST men är begränsad i sin förmåga att övervaka estrouscykeln utanför den⁷⁵. Sammantaget har denna metod rapporterats vara opålitlig, inte alltid kostnadseffektiv och används inte ofta i litteraturen vilket leder till brist på jämförbara data⁷⁴. Medan vaginalpinnen mest liknar sköljningen i den information den ger, innehåller den en ökad risk för irritation eller skada eftersom den kräver kontakt med slemhinnan i vaginalkanalen direkt för att hämta celler. Slutligen, även om färgning av mikroskopglasen kan ge en skarpare kontrast mellan celltyper och möjliggöra provbevarande, är det en mer tidskrävande och kostsam strävan än våtfästet⁵³. Sammantaget har varje övervakningsteknik sina begränsningar och fördelar, och det kan vara fördelaktigt att använda en kombination av dessa metoder för att få en omfattande undersökning av gnagarens estrouscykel.

Program
Det är fortfarande viktigt att se den aktuella studien i ett sammanhang med det större vetenskapliga samfundet och allmänheten. Denna metod kan användas i alla projekt som involverar att undersöka kvinnliga djur - inte bara inom studier som fokuserar på avsiktlig avel, för att utesluta djur som uppvisar avvikelser och / eller funktionen hos hypotalamus-hypofys-äggstocksaxeln, utan också för huvudsakliga insikter inom behandlingsgrupper. Mer specifikt är denna procedur effektfull inom i) farmakologiska studier, eftersom olika mediciner och kemikalier stör eller förändrar reproduktionskanalen och estrouscykeln 11,27,76; ii) neurologiska studier, såsom de som fokuserar på traumatiska hjärnskador, kognition eller degenerativa störningar, på grund av interaktioner mellan könssteroidhormoner och nervsystemet⁷⁷; iii) cirkulationssystemforskning på grund av könssteroidhormonreceptorer som finns på myocyter och de efterföljande interaktionerna⁷⁷; iv) forskning relaterad till bentillväxt³⁸; till det endokrina systemet^11,78; och v) andra icke-produktiva studier³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4