Summary
本研究详细介绍了在涉及雌性大鼠的实验设计中需要考虑的关键因素。从更广泛的意义上说，这些数据有助于减少耻辱感，并有助于开发更具包容性的诊断和干预工具。
Abstract
目前的方法建立了一种可重复的，标准化的，具有成本效益的方法来监测雌性斯普拉格·道利（SD）青少年大鼠的发情周期。这项研究证明了荷尔蒙周期的复杂性以及构建可靠和有效的监测技术所需的广泛理解。通过对主要实验设计和程序要素的深入研究，这种对循环及其基本原理的描述为进一步理解和解构误解提供了一个框架，供将来复制。
除了使用阴道灌洗的样本收集过程的概述外，该程序还描述了数据分类为发情，发情，发情和发情的四阶段模型的机制。这些阶段的特征是一种新的方法，利用收集时阴道液状况，细胞类型，细胞排列和细胞数量的4个分类决定因素。每个阶段的变化，有利和不利的样本，周期性和非周期性之间的区别以及收集的分类组件的图形描述与数据的有效解释和组织实践一起呈现。总体而言，这些工具首次允许发布可量化的数据范围，从而在复制时实现分类因素的标准化。
Introduction
新颖的贡献
啮齿动物发情周期已被确定为健康的重要指标。然而，研究人员的无意识偏见和对女性身体的不准确解释阻碍了科学界的发展。“发情”这个词的词源本身就意味着一种自卑感和消极感。欧里庇得斯用这个词来描述“疯狂”或疯狂，荷马用来描述恐慌，柏拉图用来描述一种非理性的驱动力。这项研究强调了这些原始观点如何影响当前的科学界，并通过一种新颖的马赛克范式来解决这些问题 - 以前研究的方法的更新组合，扩大了范围，以更全面的方法。
首先，研究和使用这种技术是必要的，因为没有标准化和全面的监测技术，数据解释实践可能不清楚。其次，尽管发情周期特征取决于正在研究的个体大鼠，但它们通常是普遍存在的。第三，虽然荷尔蒙周期是常规和有益的过程，但它们被“翻译成人类”一节中探讨的危险污名所包围。本研究旨在以三种方式解决这三个问题 - （A）通过描述深入的发情周期监测技术并阐明如何解释结果，（B）通过概述保持每个周期的完整性和个性的方法，以及（C）通过提请人们注意使未经证实的做法永久化的误解。
这项研究的独特之处在于它关注青春期大鼠，这一时期的特点是关键的发育变化，揭示了成年期的各种行为，解剖学和生理表现1。建立一个标准化的实验设计来监测研究不足的人群中的荷尔蒙循环，同时解构常见的偏见，这将允许开发可靠和有效的荷尔蒙相关性2，3，4 和确定条件依赖性循环中断5，6，7，8，9，10.最终，这些新颖性有助于扩大各种健康问题的诊断标准，治疗方法和干预措施。
基本定义和用途
发情周期是响应于三种振荡的女性性类固醇激素而发生的动态生理过程的集合：雌二醇，致发光激素（LH）和黄体酮（图1A，B）。内分泌和中枢神经系统之间的相互作用调节周期，该周期通常持续4-5天，并从性成熟开始到生殖衰老和/或停止复发。它根据激素水平分为单独的类别 - 最常见的是发情期（DIE），发情期（PRO），发情期（EST）和发情期（MET）的4个阶段，它们以循环方式进行。分裂的数量可以从3阶段11 到13阶段12，具体取决于研究的性质13。较少的划分数量通常将MET排除为一个阶段，并将其归类为短期过渡期。较高的数字通常包括允许更仔细地检查诸如肿瘤发展或自发伪妊娠等现象的小节，即没有胚胎植入的怀孕的生理状态12，14，15。
在这项研究中，通过阴道管的成分鉴定分期，命名为3个分类决定因素 - 存在的细胞类型，细胞排列和细胞数量（图2A-D）。虽然本研究没有监测阴道液的状况，但建议将其作为第四种分类成分。有关检查阴道液的更多信息，请参见参考列表16。分类成分可以通过阴道灌洗提取细胞来检查，阴道灌洗是现代发情周期监测中推荐的主要技术。虽然每个阶段的深入生理过程不在本研究的范围之内，但更多信息可以在文献中找到17.
这种发情周期监测技术的使用和持续发展植根于性类固醇激素与身体系统功能之间的联系，例如心血管系统18，内分泌系统8和中枢神经系统19，20，21。同时，当涉及雌性啮齿动物22，23，24，25时，发情周期监测可能并不总是必要的。相反，重要的是首先考虑在特定研究领域是否报告了性别差异，这可以在已发表的评论22，23中进一步探讨。虽然发情周期监测在广泛的研究调查中至关重要，但它不应被视为将雌性啮齿动物纳入实验的障碍。虽然这种技术可能看起来很复杂且耗时，但根据研究者的不同，该过程本身可能需要不到15分钟的时间才能完成，并且具有成本效益。总体而言，将雌性啮齿动物纳入科学研究有利于了解身体系统，各种病症和病理以及一般健康，因为这些发展主要基于雄性身体模板。
啮齿动物的通用参数和自然变异性
为被视为“典型”的方面建立范围对于定义标准周期模式，设置用于比较和分析目的的参数以及检测异常和异常值是必要的。同时，同样重要的是要认识到每只大鼠的周期都是独一无二的，并且预计会根据动物品系，生理过程和环境条件出现偏差。事实上，发情周期最“正常”的方面之一是可变性。这在整个周期长度中可见，范围为3-38天26，27;性成熟年龄，范围从32-34天到多周28，29，30;什么被认为是非周期性的11，和分类行列式模式11，13。总体而言，发情周期没有通用的模板，将其转化为科学界和公众是实验过程的重要组成部分。
实验时间点和发育年龄
认识到这种可变性原则有助于建立可靠和有效的实验设计。例如，发情周期监测的开始依赖于大鼠的解剖学和生理学发育，这取决于环境和生理因素。在阴道开口（VO）的发展之前，监测无法开始，该阴道口是阴道外孔被通向阴道管内侧的外阴包围（图3A-D）。虽然VO通常在32至34天之间完全发展，但它仍然对每个受试者都是个体化的，并且关于该过程的许多内容仍然未知。这个开口已被用于识别性成熟的开始，这与雌二醇31的增加，下丘脑 - 垂体 - 卵巢轴32的成熟以及大鼠的第一次排卵17，33，34，35有关。然而，最近的出版物发现，它只是生殖发育的间接标志，因为它可以与不利环境中的荷尔蒙和发育事件脱钩31，并且可能代表雌二醇水平的变化而不是性成熟33。因此，建议不要仅仅依靠VO来确定发育年龄并作为发情周期监测36的限定符，而是利用第一EST阶段的外观和上皮细胞30的角化来标记性成熟的开始。
在30，37 的啮齿动物中，体重与青春期的发育年龄显着相关，因此也可以帮助确定该时期的发育年龄。与这种现象相关的拟议机制包括刺激生殖发育所必需的激素，例如生长激素，以及通过食欲调节器瘦素30抑制下丘脑 - 垂体肾上腺（HPA）轴。然而，不建议将这一措施作为发育年龄的唯一指标，因为不同物种和供应商之间的大鼠之间存在巨大差异38。在VO和体重的发展中看到的可变性说明了该概念在整个实验过程中的重要性。
对人类的翻译：文化和科学背景
动物与人类生殖研究的转化关系是双向的。基于动物的研究结果会影响如何评估，接近和分析人类过程39.对人类生殖系统及其相关过程的感知会影响动物的研究方式。事实上，该领域进一步研究的最响亮迹象之一源于与影响科学过程的荷尔蒙周期相关的偏见社会文化信仰。其中许多惯例源于对讨论月经的普遍文化厌恶，这导致了在充分证实的知识方面存在数据差距40，41。这会产生一系列后果，从轻微到致命 - 从货架高度和智能手机尺寸到警察防弹衣的安装和错过的癌症诊断42。
将月经描述为不卫生，破坏性和有毒 - 在受人尊敬的文本，媒体，字典和医学教义中看到 - 被科学出版物所保留。这是通过对荷尔蒙周期的不准确和有偏见的描述，生殖系统与神经内分泌对应物和环境影响的隔离，以及将周期完成视为“未能受孕”的还原论观点43，44。这导致产生不健全的实验实践，例如省略影响荷尔蒙周期的外部变量，仅根据解剖学发展确定开始和终点，以及以线性而不是循环方式测量周期进展。尽管社会文化因素与生物学后果之间存在直接相关性，但在科学文献中并不经常考虑这一点。通过检查更全面的出版物43，44，45，研究人员可以解构这些耻辱感，并创建更可靠和有效的实验设计。
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Protocol
本协议中概述的所有处理和程序方法均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物护理和使用指南，并已获得佩珀代因大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）的批准。
1. 动物护理和使用
- 获取雌性大鼠，根据功率分析以数量计，雄性大鼠促进惠顿效应或更一致的循环46。根据已知数据库中的研究目标确定菌株47.
注意：目前的数据反映了女性青少年SD国际遗传标准化计划（IGS）的数据，作为合作研究的一部分，位于佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校实验室的男性SD大鼠的存在。这些大鼠在28天大时分组到达，并监测发情周期进展10或20天，以显示急性和慢性水平的差异，从34天龄开始（在7天适应期之后）。 - 在处理之前，留出一个隔离期和/或适应期，以便在运输和适应新环境后进行生理稳定。
注：引用了3天的最短期限，建议7天的期限为48，49，50，51，52。总体而言，这取决于运输条件，动物品系和研究目标。 - 确保使用适应期来减少压力，因为压力会破坏正常的生殖系统功能53。但是，不要通过尝试消除它来过度补偿，因为适量的压力对动物的健康有益51。
- 宿主大鼠在温度-（68-79°F，即20-26°C）和湿度控制（30-70%）的环境中，通过联系动物饲养场或实验室管理人员并确保这些特征。随意 分发带有公司 网站上列出的营养成分的水和食物，每周清洁一次笼子。
注意：在这项研究中，大鼠被安置在2组，按性别分开，在19“x 10”x 8“的透明可重复使用的塑料笼子里，并可以使用每周更换一次的玉米棒床上用品。温度保持在70°F，湿度保持在35-79%，平均为62%。 - 检查尾巴和脚趾的环尾或缺血性坏死的发展，以寻找相对湿度水平低和极端温度的证据，这可能导致生物反应的交替。
注意：温度和湿度对生殖系统，性成熟和发情周期54，55，56，57，58很重要。 - 通过在整个实验室空间中沉积等量的光源，确保整个外壳空间的适当和平衡照明，这些光源作用于时间控制的light：黑暗系统。
注意：在这里，12：12小时亮：暗循环，06：00-18：00小时亮起，由2，550流明线性LED灯泡控制。 - 根据动物色素沉着、年龄、菌株、性别和荷尔蒙状态的变化，遵循52 规定的 lux 要求。
注意：当研究人员对收集的细胞样本进行分类时，一致的照明将允许正确的视觉检测和可靠的分期59。光的持续时间和强度与生殖系统、性成熟和发情循环54、55、56、57、60、61直接相关。
2. 设备和实验准备
- 回顾分类行列式（如图 2A所示）：如何识别发情周期的每个阶段以及如何操作显微镜和相机设备。
- 确保每个被监测的受试者都已达到性成熟，并显示适当的发育指标 - VO，体重和年龄。称量大鼠并在每天的同一时间检查它们的VO以进行准确的比较，并使用批准的处理方法转移它们。如果动物失去超过其先前体重的20%，请咨询大学附属兽医。
注意：VO仍然在尿道开口的尾部和肛门的颅骨，位于两者之间，如图 3所示。 - 由于这些因素与菌株有关，因此请与供应商核实规格，并考虑特定于实验室62的环境因素。
注意：一般来说，这将发生在32-34天之间，对于SD大鼠来说，平均体重在75-150克63 之间，并且由先前被膜状鞘覆盖的圆形开口表示。 - 选择适合被监测大鼠组的样本收集期，以防止收集过渡样本。首先，在一天中的2或3个不同时间点对一些动物进行采样，以确定大多数周期阶段存在的时间（例如，不同动物在12：00小时，13：00小时和14：00小时采样）。每天在同一时间完成阴道灌洗，以获得一致和可靠的分期。
注意：据报道，12：00至14：00之间的小时最适合捕获所有阶段。在这项研究中，发情周期监测发生在12：00和14：00小时之间，用压缩式保持处理（见步骤3.4）。与其他实验干预（例如，行为调节，药物治疗）相比，发情周期监测时间的重要性是一个发展中的研究领域，可以进一步探索11。确定发情周期监测的持续时间取决于研究，可以在已发表的研究11，33中进一步探讨。 - 取下显微镜的保护盖，然后取下相机保护镜盖并将镜头放在显微镜的目镜上，将相机连接到计算机。
- 然后，在计算机上打开预选软件。要使用本研究中选择的软件，请在标有“相机列表”的选项卡下，选择连接到屏幕左侧 USB 的相机。确保 USB 相机已正确连接到计算机，如果没有，计算机将在标有“相机列表”的选项卡下显示“无设备”。
- 在选项卡下选择USB相机后，打开位于底座上的显微镜灯开关。
- 在指定用于细胞样本照片的计算机上创建一个文件夹。为收集数据的每一天创建一个文件夹，在拍摄图像之前预先准备。
- 准备好设备后，从其存放处取出受试者的笼子并将其带到样品收集站。
3. 阴道细胞的收集
- 取出一次性注射器，并用0.2 mL无菌0.9%NaCl填充每个注射器。如果存在气泡，请轻轻轻拂枪管注射器，直到所有气泡都到达注射器的开口尖端并排出空气。如果仍然存在气泡，请将溶液排出到NaCl容器中并重新填充，直到没有气泡。
注：过度轻拂可能会导致形成更多气泡。 - 将每个注射器返回到塑料包装以保持无菌区域，注射器的尖端位于包装的密封部分内。
- 打开笼子，轻轻地抬起主体的尾巴底部或身体的躯干，关闭笼子的盖子以防止其他人离开。根据个人喜好和动物反应，从下面列出的方法中选择一种保持方法。
- 对青少年大鼠使用压缩式保持，将受试者放在上胸部区域，受试者的鼻子向下指向地面。在开始拭子之前，请确保受试者被压缩到足以防止移动，但在保持中舒适和安全。在插入注射器之前，通过轻轻弯曲尾巴来暴露受试者的阴道管。
- 将动物的前爪放在笼子的顶部或侧面，对成年老鼠使用后腿提升术，而尾巴和后肢则被第一和第二指之间轻轻握住，让拇指自由操作注射器64。
- 让动物适应处理和监测。轻柔而安全地处理动物，以减少多余的压力，并保护研究人员免受咬伤等攻击。
注意：监测的头几天可能不会产生预期的结果，因为动物会适应自己的病情。在适应期间处理动物收集体重可以帮助这种过渡33。 - 在用食指和中指稳定握住注射器的同时，以平行于阴道管的角度插入注射器的尖端（不超过2毫米）。通过将柱塞向内推来缓慢地将NaCl排出到运河中。不要将注射器进一步插入运河，因为这样做可能会破坏发情周期。
- 通过将注射器的柱塞从上皮衬里拉开（向上）从阴道管中提取NaCl。如果在此过程中难以将受试者保持在保持状态，请将其放回笼中短暂休息，然后再尝试提取NaCl。
- 收集细胞样品后，将受试者放回笼中，并在显微镜下评估所有样品之前对每只动物重复此过程。
注意：或者，可以在转移到下一只动物之前收集和评估每个样本。如果样本无法分类，动物可能需要第二次灌洗。如果初始收集的相同注射器不直接接触容器中的盐水并且仅适用于同一动物，则可以重复使用。
4. 样品评估
- 通过检查提取的阴道液样本开始分类。在描述文档或其他记录系统上将粘度记录为粘性或非粘性，并将着色记录为不透明或透明。
注意：实验方案的这一部分可以在收集样品时或以后执行。 - 将2-3滴液体排出到显微镜载玻片上，并将显微镜盖板玻璃放在载玻片顶部。将盖玻片从载玻片的顶部到底部或从载玻片的一侧到另一侧，将盖玻片玻璃放在显微镜载玻片上，以防止形成气泡。如果可能，如果需要进一步检查，请将收集的样品的大约一半留在注射器中，以防止将过量的液体放在载玻片上。
- 通过移动显微镜载玻片在载物台上找到收集的细胞。如果细胞太少或碎片量太大，请将剩余的液体排出到新的载玻片上并重新检查。如果注射器中剩余的样品量不足，或者第二滴液存在类似问题，则在尝试确定发情周期阶段之前，请从受试者那里收集另一个样品。
- 找到细胞后，在触摸计算机或计算机键盘之前，请取下一只手套以防止弄脏键盘。
- 通过单击软件面板左侧标记为 Snap 的功能来获取细胞样品的图像。
- 然后，通过单击页面左上角“文件”图标下的“另存为”来保存文件。将照片保存在计算机上预先标记的文件夹下。
注：标签模板示例： #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective镜头。 - 如果每个帧中没有很多细胞，请在每个物镜上拍摄多张照片。
注意：多个图像的示例标签： #1_01/09/2021_EST_4x1 和 #1_01/09/2021_EST_4x2。 - 在多个物镜下对每个收集的样品重复该过程。包括至少一个较小的对象化（如 4x）和至少一个较大的对象化（如 20x）。
- 将图像上传到共享驱动器/文件夹或外部硬盘驱动器，以便所有涉及的研究人员都可以访问文件并有可用的备份副本。
5. 阶段分类
- 设置计算机屏幕以同时查看拍摄的照片和记录表（图4A-C）。
注意：这将允许在查看收集的示例时进行文档记录。实验方案的这一部分可以在收集样品时或以后完成。 - 确定样品中存在哪些细胞类型。使用条件从步骤 5.2.1-5.2.4 中列出的四个选项中进行选择并记录结果。
- 无核角质化上皮 （AKE）/角质化上皮细胞
- 如图 2B 和 图5C所示，寻找锯齿状或有棱角分明的细胞，尽管没有细胞核，但它们可能在细胞内显示光圆形区域（核幽灵），代表细胞核曾经存在的位置。使用更高的放大倍率，如20x及以上，来区分这种有核细胞和无核细胞。
- 如果需要，使用更高的放大倍率来区分细胞的角化或角化部分 - 一层缺乏细胞核并充满角蛋白的薄细胞层。
注意：除了锯齿状的外观外，它们还可以通过折叠或拆卸的方式来区分，从而形成锯齿状和细长的结构，称为角蛋白条。
- 大有核上皮 （LNE） 细胞
- 寻找这些通常由不规则、锯齿状或棱角分明的边框包裹的圆形到多边形单元格。
- 观察它们的细胞核如何以各种形式出现，从完整到退化或皮孔，与染色质在经历死亡或恶化的细胞核中的不可逆凝聚有关，如图 2B 和 图5D1，2所示。注意这些细胞核如何比细胞内的细胞质占用更少的空间，其核与细胞质（N：C）的比率低于小上皮细胞。注意在较高放大倍率下可以看到的细胞质颗粒13。
- 白细胞/中性粒细胞/多形核细胞
- 寻找这些具有多叶核的紧凑球形细胞（因此称为多形核细胞），它们随着细胞的成熟而消失（图2B 和 图5A）。更高的放大倍率（例如，40x）可用于观察多叶细胞核。
注意：在收集和制备时，这些细胞可能会凝结，折叠或破裂。
- 寻找这些具有多叶核的紧凑球形细胞（因此称为多形核细胞），它们随着细胞的成熟而消失（图2B 和 图5A）。更高的放大倍率（例如，40x）可用于观察多叶细胞核。
- 小有核上皮 （SNE） 细胞
- 注意这些圆形到椭圆形的细胞，它们比上面描述的嗜中性粒细胞大。
- 观察这些非角化上皮细胞的圆形细胞核（图2B），其占用的空间比细胞内的细胞质更大，相对于大上皮细胞产生更高的N：C比。
注意：在收集和准备时，这些单元格可能会折叠或重叠以创建类似于字符串或条形的形状，如图 5B1 所示。
- 无核角质化上皮 （AKE）/角质化上皮细胞
- 检查样本中存在的细胞如何针对每个对象化进行组织。使用较低的对象化（如 4x）查看整个单元排列的代表性视图。记录细胞是否聚集在一起（C），均匀分散（ED）或随机分散（RD）（见 图4C），并注意每种细胞类型的特定组织（例如，小有核上皮细胞聚集，嗜中性粒细胞均匀分布）。
- 接下来，直观地估计并记录总细胞数量（少量，中等，数量）和单个细胞数量（每种细胞类型的百分比）。
注意：smidge表示可用于确定样品分类的最小数量的细胞，数量表示存在无数数量的细胞，这些细胞要么占载玻片上的大部分（如果不是全部）空间，要么彼此堆叠，中等数量的细胞表示相对平均数量的细胞（例如如图5A-D和图6A-D所示）。 - 注意“异常”类别中特定主题是否与列出的标准或典型方面有任何偏差，并在需要时咨询兽医。
- 利用分类组件和以下描述，确定样品中呈现的发情周期阶段。
- 死
- 寻找LEU作为主要或唯一存在的细胞类型，在DIE开始时以团块方式排列，但在后期阶段更分散。
注意：在过渡到DIE时，随着上皮细胞开始分解，细胞的数量可能会减少，如图6 D1所示。同时，LEI的数量开始增加，它们最初倾向于以聚集的方式排列，并随着时间的推移而分散。 - 请注意，细胞的总量可能相对较低，最常见于DIE期的后期阶段，即第二天或第三天。
- 观察该阶段可能存在的大量粘液，其表现为浓缩的LEU链（图5A1）。在向PRO过渡的后期阶段，注意伴随LEU的小团块或SNE细胞链（图5A1，2）。
- 观察阴道液在过渡到、完全过渡到和过渡出 DIE 时的粘稠和不透明外观。
注意：该阶段的平均持续时间在4天周期内为48小时，在5天周期内可能为72小时。
- 寻找LEU作为主要或唯一存在的细胞类型，在DIE开始时以团块方式排列，但在后期阶段更分散。
- 亲
- 寻找SNE细胞作为显性细胞，以及可以以低数量看到的LEU，LNE和/或AKE细胞。使用高物化来观察SNE细胞的颗粒状外观，这些细胞通常在此阶段以簇，片状或链状排列（图5B1，2）。
- 观察从DIE进入PRO时阴道液的粘性和不透明外观，以及一旦完全过渡到PRO阶段（大鼠平均持续时间为14小时）它如何变得非粘稠和透明。
- 最
- 寻找AKE细胞的主导地位，EST中SNE细胞的减少，以及随着EST继续11，13，细胞数量和大小的增加。
- 注意AKE细胞通常以角蛋白条或含有鬼核的形式聚集在一起的排列的显着特征，其在从PRO（图6B）到MET（图6C）的过渡中可以变得更加随机地分散。
- 观察特征性的非粘性和透明的阴道液，当大鼠正在过渡到，完全过渡到并过渡出EST时，可以预期。
注：EST的进展包括许多多样化（图5C 和 图6B，C）。该阶段通常在4天周期内平均发生24小时，或在5天周期内可能发生48小时。
- 遇到
- 当大鼠过渡到MET时，寻找更多数量的SNE和LNE细胞，要么在管内细胞比例方面占主导地位，要么与LEU11，13的比例接近相等。此外，请注意MET中的碎片数量和其他阶段的更多碎片，这是由于EST之后的上皮细胞衰变并进入DIE而引起的。
- 观察缺乏一致的排列，因为可以看到所有细胞类型和不同的数量（图5D1-3）。然而，寻找在开始阶段靠近上皮细胞的堆积或聚集的LEU，这些LEU在过渡到DIE时可能会返回到聚集排列。
- 观察该阶段阴道液的非粘性和透明外观，以及在进入DIE时向更粘稠和不透明的外观的变化。
注意：此阶段的平均持续时间为6-8小时。
- 死
- 用受试者正在走向的阶段标记过渡中的样本，在括号中标记过渡以跟踪何时收集这些样本。有关如何区分这4个阶段及其过渡的更多信息，请参阅 代表性结果。
注意：由于收集的样品是静态的，循环是动态的，幻灯片可能会描述阶段之间的过渡（如图6A-D所示）。 - 对每只动物完成此过程，直到监测阶段完成。
- 在第11天（45天）或21天（55天龄）上，在断头台斩首前用5%异氟醚和2%氧气对大鼠实施安乐死。这些时间点可能因研究的性质而异。
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Representative Results
目前的数据反映了女性青少年SD国际遗传标准化计划（IGS）在男性SD大鼠存在的情况下的数据。作为合作研究的一部分，这些动物位于佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校的实验室。 图5 显示了4个循环阶段的多种变化。 图5A1 被鉴定为存在几种细胞类型的双发性样品。该示例表明，具有大量上皮细胞的样品在满足其他分类组分资格（例如 LEI 的主导地位）时，符合二estrus 条件。该样品还展示了在该阶段经常看到的由LEU组成的粘液链排列，其类似于在PRO阶段看到的由SNE细胞组成的链。为了区分 DIE 阶段的粘液链和由 SNE 细胞组成的 PRO 阶段中出现的链，识别 LEI 的主导地位非常重要。图5A2，3 显示了经常观察到的细胞排列进展 - 在DIE阶段后期收集的样品中收集并移动到随机（RD）甚至支付（ED）的LEU的初始聚集。具体而言， 图5A2 是存在许多细胞的DIE样品。这反映了LEU如何也伴随着大量的上皮细胞（图5A1，2），通过LEU的主导地位和角蛋白条的缺失来区分metestrus。相比之下， 图5A3 表明，在DIE阶段的后期阶段，例如在第二天或第三天，通常可以看到低总细胞计数（smidge）。在PRO阶段，SNE细胞经常排列成链，许多细胞彼此堆叠（图5B1）或一小块细胞排列成更小的团块（图5B2）。 图5B3 举例说明了一个PRO样品，该样品具有SNE细胞的特征性片状团块，这些SNE细胞重叠并形成条形，这些条形可能与EST阶段存在的由AKE细胞组成的角蛋白条混淆。为了区分两者，重要的是要确定PRO中SNE细胞和EST中AKE细胞的主导地位。
图5C1，2 显示了在EST中看到的AKE细胞的典型聚集和随机放电，前者包括许多细胞，后者是中等数量。在这些例子中可以看到鬼魂核，角蛋白条的形成以及在此阶段经常收集的细菌。SNE细胞有时在EST阶段（图5C1）表示为先前PRO阶段的残留物。EST晚期，当受试者转向MET时SNE细胞开始出现时，经常被误认为是PRO阶段。为了区分两者，重要的是要考虑核大小。通常，PRO的有核细胞具有较高的N：C比。 图5C3 所示的样品呈现出许多AKE细胞的链状排列，这不被视为EST阶段的特征。这表明每只动物都是独一无二的，可能会出现偏离标准的情况，并且分类决定因素需要组合检查。
为了区分SNE细胞存在时EST和PRO，观察到在EST阶段这些细胞中发生较低的N：C比值。为了区分EST中存在的角蛋白条与PRO阶段SNE细胞重叠或滚动形成的角蛋白条（图5B3）以及从MET过渡过程中由衰变上皮细胞形成的角蛋白条（图6D1），重要的是要确定显性细胞类型，排列和数量以区分所表示的阶段。最后， 图5D1，2 举例说明了代表MET阶段的随机放电中存在的所有细胞类型的组合。除了这些例子中存在的众多细胞外，由于上皮细胞在EST之后的衰变以及过渡到具有清除上皮细胞阴道管功能的LEU占主导地位的LEA，因此在该阶段收集大量碎片（图5D2）是很常见的。 图5D2 还显示了MET如何通过其较高浓度的上皮细胞和角蛋白条的存在来区分MET与DIE。总体而言，这些表示描述了每个阶段中存在的广谱，并且不尽如人意。
4个过渡阶段的表示如图6所示。虽然这项研究将过渡中的样品归类为4个发情周期阶段之一，但正确识别过渡阶段仍然很重要。在从 DIE 到 PRO 的过渡过程中（图 6A），LEI 的数量通常会总体减少，而 SNE 单元的数量会增加。LNE和AKE细胞有时存在于这种转变中，尽管数量不高（图6A1）。图6A2-4描绘了在此转变期间经常收集的聚集和随机分散的SNE细胞数量较多，随机和均匀分散的LEU数量较少。总体而言，在与其他过渡阶段区分开来时，重要的是要注意SNE细胞的主导地位以及PRO中团块和链形成的开始。图6A中的所有示例都表示除图6A4外的大量细胞计数，并带有一些。在图6B中，该图显示了从PRO到EST的过渡过程中看到的大量聚集的SNE和AKE电池的示例。
与EST相比，在这种转变过程中，SNE细胞的数量更多，AKE细胞的聚集更少，随机放电 更多。 存在的碎片代表了先前发情期的衰变AKE细胞，通常在发情期看到。在从MET到DIE的最终过渡阶段也可以看到这种情况，其中上皮细胞开始衰变并产生碎片（图6D1，2），前者中存在许多细胞，后者中存在适中的细胞。这些数字显示了LEU数量增加的现象，成为向二月形过渡的主要细胞类型。对于监测20天（n = 3）的组，有12天收集过渡样本，平均为4天。对于监测10天（n = 3）的组，有9天收集过渡样本，平均为3天。
图7显示了不利的细胞样本收集，其中大多数需要重复灌洗。 图7A1 显示了由于注射器插入和拔出不当而收集的大量鳞状细胞，导致鳞状细胞从阴道管壁上吸走。这些细胞可以与聚集的上皮细胞或LEU区分开来，因为质量的高密度和致密性及其独特的边界。 图7B 表示碎片的集合，其中没有提取细胞，聚焦平面不正确，或者没有完全扫描载玻片中的细胞。碎片可以通过熟悉细胞类型和通常独特的小尺寸和结块来区分细胞。这些碎片通常源于动物的垫料，毛发或细胞腐烂。 图 7C 描绘了一张幻灯片，其中包含的细胞计数低于 1 个位数。虽然在MET晚期和早期DIE期间通常会出现低细胞计数，但这代表了细胞太少而无法准确分类到阶段的载玻片。
图7D 显示了NaCl提取溶液与显微镜载玻片上来自管的阴道液相结合的两个示例。在第一幅图像 （图7D1）中，液体存在且失焦，阻碍了准确分类的能力。在 图7D2中，流体沿着LEU以粘性圆圈分布在载玻片上。虽然由于细胞存在率高，这个例子不需要重复灌洗，但重要的是要考虑放置在载玻片上的液体量以及显微镜盖玻片的位置以防止涂片。总体而言，这些图像强调了捕获高质量代表性图像以进行正确分类的重要性。这包括在捕获图像之前通过扫描每张载玻片来考虑细胞提取的方式，焦点平面和图像的内容。
在对实验组中的每只动物进行分类后，通常会在条形图或折线图上绘制阶段进展图。这使得研究人员能够检查整个周期模式，并确定动物何时呈现发情阶段的不规则进展，称为非周期性。然后，可以通过此分析工具中的周期长度和阶段进展模式对样品进行分析。如图 8A，B所示，这个概念包括将不同高度的柱线（在本研究中）分配给各个阶段，并在x轴上平移记录的数据（图4B）。在这些示例中，MET 和 DIE 由最低柱线高度表示，PRO 由中间表示，EST 由最高柱线高度表示。由于MET级的持续时间短，它与DIE级结合成一个酒吧。虽然有不同的方法来测量周期完成度，但通常将一个完整的周期计为从一个EST到另一个11的移动。但是，这并不反映周期完成，而是在存在连续的EST阶段时为2天的EST阶段持续时间。
图8A 反映了一只大鼠的数据，该大鼠通过MET / DIE，PRO和EST进行一致和重复的进展，此外，该大鼠落在4至5天周期的范围内，平均长度为4.375。每个阶段不超过标准化的长度范围，平均在EST中花费1.0625天，这是对非周期性的典型评估。如果提取的数据有规律地遵循EST到EST的这种模式，这不仅证实了受试者的激素水平保持在可接受的范围内，而且该过程的进行没有显着中断该过程的周期性。最后，这只大鼠完成了16个周期，通过计算EST到EST柱的数量来确定。
图8B 显示了常见的非循环类型，包括扩展（称为EXT）和未记录的阶段。该图还强调了检查周期模式以及每个阶段花费的时间和天数的重要性。具体而言，在本例中，虽然EST的平均周期长度和天数落在概述的参数范围内，但阶段进展的周期模式揭示了异常。因此，全面检查发情周期非常重要。扩展的 DIE（标记为 Ext Diest）和 EST（标记为 Ext Est）阶段都在图中所示的整个周期中记录，并且有多个周期未记录 PRO 阶段。此示例还说明了检查所看到的连续阶段数的重要性，这些阶段落在典型范围之外，而不是仅检查周期的平均长度和EST中的天数，这些阶段落在典型范围内。
这些示例的原因和相关性可能包括生理异常（肿瘤、假妊娠、长期压力）、有害环境条件（长时间照射、暴露于有毒化学物质、孤独的外壳）、样本收集时间不当、研究人员错误（样本收集不良、图像捕获、分期不当）、年龄相关现象（青春期和生殖衰老期常见的不规则性）或特定特定偏差等因素 动物。为了区分研究人员的错误或样本收集时间不当以及物理异常或与年龄相关的现象，更详细地检查4个分类组件是有帮助的。这可以帮助确定不规则现象的可能原因，或者从更广泛的意义上说，可以用于更仔细地研究发情周期特征的研究。
图9通过包括y轴上的总细胞数量和单个细胞数量，由不同条形填充颜色表示的细胞类型以及由不同条形填充模式表示的细胞排列（在整个监测周期内绘制）来说明这种更仔细的检查。该分析方法允许更详细地检查已完成的循环总数，每个周期的长度，阶段进展以及每个单独的大鼠的分类组分。 图9A 代表周期数低于平均水平的大鼠，在监测的10天内总共有3个完整的周期 - 两个3天周期和一个5天周期（平均值为3.67）。在50%的天数的阶段进展中看到的不规则性包括一个或多个未记录的阶段，并且收集的30%的样本处于过渡阶段 - 第2天作为MET-DIE，第5天作为EST-MET，第8天作为PRO-DIE过渡。这可能是由于样本收集时间不当，研究人员错误，与年龄相关的现象或独特的偏差。进一步的监测本来可以澄清哪些适用。
在记录的每个阶段中观察到典型的显性排列，细胞类型以及单个和总细胞量。在EST阶段内，观察到一些（25%的样品），中度（25%的样品）和大量（50%的样品）聚集的AKE细胞，其中LEU，SNE和LNE细胞的存在较少。在捕获的一个MET阶段中，存在许多随机分散的LEU（50%），AKE细胞（20%），LNE（15%）和SNE（15%）细胞的组合。对于DEIC阶段，观察到少量（50%的样品）和大量（50%的样品）随机分散，均匀分散，并且优势LEU的组合散布在AKE，LNE和SNE细胞中。在收集的一个PRO阶段中，存在一小块随机分散的LEU（存在60%的细胞）和SNE细胞（存在40%的细胞），它们处于排列组合中，代表了从DIE到PRO的过渡。
在 图9B中，所代表的大鼠总共有3个完整的周期，具有4天的周期模式。收集的样本不代表一致的阶段进展，具有延长的DE DIE期（第6-9天）和5个其他未记录的阶段实例（2个未记录的MET阶段，2个未记录的PRO阶段和1个未记录的EST阶段）。由于只有20%的样品处于过渡状态（第3天为DIE-PRO，第5天为EST-MET，第18天为MET-DIE，第19天为DIE-PRO），并且在MET阶段和延长的DIE期之外，只有3个阶段未记录，因此得出结论，样本收集的时间适合该特定动物。由于监测的最后10天包括通过4个阶段的有序进展，最初的不规则性可归因于青少年年龄。监测持续时间（20天）的增加使得这一结论得以发生。
对分类组件的检查揭示了典型的范围。EST阶段反映了中等（50%的样品）到大量（50%样品）的聚集AKE细胞的优势，其中LEU，SNE和LNE细胞较少。在收集的MET样品中，存在中等（33.33%的样品）至大量（66.67%的样品）随机分散和聚集的LEU（数量范围为10-90%），聚集的SNE（0-30%），随机分散的LNE（0-10%）以及聚集和随机分散的AKE细胞（10-90%）的组合。DIE阶段反映了在随机分散的AKE和SNE细胞存在的情况下，中等（20%）至大量（80%样品）的均匀分散，随机分散和聚集的LEU（范围为50-100%）的主导地位。PRO阶段是通过在LEU，AKE和LNE细胞存在的情况下随机分散和聚集的SNE（10-99%）细胞的支配（占样品的3.33%）和大量（66.67%的样品）的主导来鉴定的。
分析提取的数据时的另一种选择是创建发情循环曲线，方法是包括前面描述的元素 - y轴上的总细胞量和单个细胞数量，由不同条形填充颜色表示的细胞类型，以及由不同条形填充模式表示的细胞排列，在每个周期阶段的总监测周期中绘制图表。这可以完成每只大鼠或整个组的平均值。该分析工具的目的是检查每个阶段的组分分类趋势，这有助于整个科学界表征特定于发情周期阶段分类的分类组分区别。在 图 10A1 中，10 天 DIE 曲线显示，中等（50% 的样品）和数量（50% 的样品）的均匀分散的 LEI（平均为 78.25%）以及较少的 SNE、AKE 和 LNE 电池占主导地位。在 图10A2中，20天二月经曲线显示出中等（20%的样品）和大量（80%的样品）量的均匀分散，聚集和随机分散的LEU（平均82%，在所有10天内存在）以及较少数量的AKE和SNE细胞的优势。
图10 B1中所示的PRO阶段在LEU和AKE电池存在下显示出适量随机分散的SNE电池（60%）的主导地位。图10B2中的20天PRO载物台剖面显示，与LEU和AKE细胞一起，一小块（33.33%的样品）和大量（66.67%的样品）组合的排列和随机分散的SNE（所有3个样品中平均为66.33%）细胞占主导地位。图10 C1中所示的10天EST曲线在排列组合中表现出中等（50%样品）或大量（50%样品）量（存在2天的平均80%）的AKE细胞的优势，以及较少数量的LEU，SNE和LNE电池。在图 10C2 中，20 天 EST 剖面图显示，中等（75% 的样品）或大量（15% 的样品）随机分散的 AKE（存在 4 天的平均 57.5%）细胞或排列组合的细胞占主导地位，同时存在较少数量的 LEU、SNE 和 LNE 细胞。
图10 D1中的10天MET载物台曲线包括许多随机分散的LEU（50%），AKE（20%）细胞和SNE（30%）细胞。图10D2中的20天MET载物台曲线表现出中等（3.33%的样品）或大量（6.667%的样品）量的LEU（所有3个样品中平均为50%），SNE（所有3个样品中平均存在15%），AKE细胞（存在3个样品中为23.33%），LNE细胞（所有2个样品的平均为15%）。一半的LEU是随机分散的（1个样品），其余50%是排列组合（1个样品）。三分之二的SNE细胞在存在时随机分散，而其余33.33%在存在时处于排列组合中（3个样本中的1个）。最后，66.67%的AKE细胞聚集在存在的样品中（2天），而其余33.33%处于排列组合（1天）中。表1包括两组分类行列式的数值平均值。虽然图9A，B和图10A-D中的数据包括来自单个动物的分类决定因素的信息，但这些表格包括发情阶段的平均值作为示例。当在其他实验室中重现时，这些参数可能成为阶段识别的标准。反过来，这可能会降低目前参与分期过程的主观性水平。
统计学
一般来说，在解释周期特征时需要考虑一些参数，尽管对什么是“异常”缺乏共识，并且偏差是典型的。Goldman等人将“常规”确定为4-5天周期，24-48小时EST和48-72小时DIE阶段11。与这些参数的分歧可能是由于各种因素，包括一个或多个生理异常，收集时间不当，或随着激素水平成熟，青春期大鼠经常经历的初始周期性。除了咨询实验室兽医，使试验收集期能够确保适当的时机，并监测青春期后的动物以建立比较时间表外，统计分析还有助于将因果关系和/或相关性归因于任何异常。在将循环表征为类别（例如，一致和异常）之后，卡方分析可以帮助比较组。此外，可以使用方差分析 （ANOVA）11 在干预后比较分类分量或一般循环特征。然而，正如引言中所讨论的那样，这种偏差可能没有生物学意义，因此必须考虑实验背景。
图1：发情周期阶段的激素节律性 （A）概述和总结了在突出的发情周期阶段的不同性别类固醇激素水平。阶段进展以气象开始和结束，以证明建筑激素水平和该过程的循环进展。改编自外部源11.（B）性类固醇激素通过血液从中枢神经系统流向生殖系统。可以看出，激素水平分别通过促性腺激素释放激素（GrH或LHRH）以及卵泡刺激素和促黄体生成激素的组合从下丘脑和垂体腺发出信号而增加。这包括正反馈回路和负反馈回路，具体取决于雌二醇和黄体酮的浓度。信息17 和从外部来源追踪的图像65，66，67。简称：LHRH =促黄体生成素释放激素。 请点击此处查看此图的大图。
图2：测量的行列式的发情周期分类。 （A）这里列出的是分期收集的细胞样品时使用的组分以及每个阶段的主要组分。重要的是要记住，这些是一般参数，差异是预期的。（B）以下是每个阶段中存在的显性细胞类型。虽然这些是一般分裂，但每种细胞类型都可以在所有阶段中找到。（C）这里介绍的是本研究中发现的细胞排列类型。（D）此处的图像反映了4个发情周期阶段中存在的典型细胞量，象限体积表示近似的细胞量。来源于外部来源13 和先前改编的68。 请点击此处查看此图的大图。
图3：斯普拉格·道利大鼠的阴道开口 （A）未发育的外生殖器和阴道开口的解剖学方向，导致阴道相对于尿道开口。（B） 未开发区域的视觉表示，用箭头标记。（C）发育的外生殖器和阴道口相对于尿道开口的解剖学方向，通常发生在34天左右。（D）图 A中概述的发达区域的相应可视表示。所有数字均来自外部来源29. 请点击此处查看此图的大图。
图4：对行列式数据记录模板进行分类（A）一个数据记录选项;包括对行列式进行分类的说明。这是每天使用，每只监测大鼠一个。（B）该模板是数据输入的一个选项，简化了分类行列式和大鼠识别的记录。这允许将注释输入到第二个 PRO 分类中的数据表中。顶行的颜色反映了分配给所表示实验组的颜色，这有助于将一个组与另一个组区分开来。（C） 另一个模板选项;包括所有分类决定因素，可以根据个人偏好或研究目标进行修改。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮;C = 团块;ED = 均匀分散;RD = 随机分散;COM = 组合;贴片 = smidge;模数 = 中等;数字 = 数量;EXE = 锻炼;SED = 久坐不动;东部 = 发情期;死亡 = 二极;met-die = metestrus-diestrus transition;亲 = 原发情;促发情 = 发情前-发情过渡;** = 可能对出版物有帮助的质量示例。请点击此处查看此图的大图。
（A）这一系列图像描绘了二极分期的各种例子。第一幅图像（A1）描绘了由浓缩LEU链代表的粘液沉积物，上皮细胞以随机放电形式存在。这是同时使用4倍和10倍放大倍率的重要性的一个例子。这种4倍放大倍率看起来类似于发情原链，但在10倍时仔细检查时，显示出LEU的主导地位。第二幅图像（A2）描绘了在发情期经常看到的情况 - LEU的主导地位以及上皮细胞的聚集排列：SNE，LNE和AKE细胞。本系列（A3）中的最后一张图像反映了LEU的随机放电，通常在阴道和盐水液滴中间的发情期内看到。（B）这一系列图像描绘了发情期的各种例子。第一幅图像（B1）描绘了SNE细胞成链的聚集排列。第二幅图像（B2）反映了总细胞计数较低且SNE细胞团块的载玻片。第三张图像（B3）描绘了SNE细胞的常见聚集和更多随机放电以及低数量的LEU和AKE细胞。（C）这一系列图像描绘了发情期的各种例子。第一幅图像（C1）描绘了在SNE细胞存在的情况下AKE细胞的常见聚集排列，具有角蛋白条形成。第二张图像（C2）显示了AKE细胞与鬼核和细菌的聚集。最后一个图像（C3）显示了AKE细胞的链状排列。（D）这一系列图像描绘了陨石阶段的各种例子。第一幅图像（D1）描绘了在碎片存在的情况下LEU，SNE细胞，AKE细胞和LNE电池的随机放电和聚集。第二幅图像（D2）反映了以团块排列存在的所有细胞类型，以及角蛋白条。最后一张图像（D3）显示了存在的LEU，SNE，AKE和LNE电池的更全面排列。这些数字以 4 倍（A1、A2、B2、B3、D1 和 D3）或 10 倍（A3、C1、C2、C3 和 D2）对象化进行放大，以增加分类组件的可视化效果。比例尺 = 100 μm。供尺寸参考;AKE电池的直径约为40-52μm，LEU约为10μm，LNE电池的直径为36-40μm，SNE电池的直径约为25-32μm16。缩写：SNE =小核上皮;LNE = 大核上皮;AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞。请点击此处查看此图的大图。
（A） 这一系列图像描述了 DIE 和 PRO 阶段之间过渡的示例。第一张图像（A1）显示了LEU，SNE，LNE和AKE细胞的大团块和随机放电。第二幅图像（A2）包括大量聚集的LEU和SNE，其中穿插着LEU链。第三幅图像（A3）包括LEU和少量SNE的团块甚至支付。第四张也是最后一张图像（A4）描绘了聚集和随机放电的SNE电池和LEU。（B）该图像描绘了PRO和EST阶段之间过渡的示例，SNE和AKE细胞结块。（C）该图像描绘了在碎片中看到的AKE，SNE和LNE细胞的聚集和随机放电，以表示从EST到MET的过渡。（D）第一幅图像（D1）描绘了MET和DIE阶段之间过渡的示例，随着LEU的增加，衰变的上皮细胞。第二幅图像（D2）描绘了在先前描述的聚集LEU和SNE细胞存在的情况下的AKE细胞。这些数字以 4 倍（A1、A2、A3、B 和 C）或 10 倍（A4、D1 和 D2）放大倍率拍摄，以增加分类组件的可视化效果。比例尺 = 100 m。作为尺寸参考，AKE电池的直径约为40-52μm，LEU约为10μm，LNE电池的直径为36-40μm，SNE电池的直径约为25-32μm16。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮;C = 团块;东部时间 = 发情期;死亡 = 二月;PRO = 发情期;MET = 气象。请点击此处查看此图的大图。
（A）在这两幅图像中，除了随机分散的LEU外，还从阴道管壁吸出鳞状细胞。（B） 该图像包括少量碎片，其中细胞要么看不见，要么没有被收集。（C）在本例中，观察到总细胞数较低。（D）在这两幅图像（D1和D2）中，可以看到氯化钠（NaCl）提取液和阴道液并扩散到整个显微镜载玻片中。这些数字以 4 倍（A1、A2 和 D1）或 10 倍（B、C 和 D2）的放大倍率拍摄，以增加分类组件的可视化效果。比例尺 = 100 μm。作为尺寸参考，AKE电池的直径约为40-52μm，LEU约为10μm，LNE电池的直径为36-40μm，SNE电池的直径约为25-32μm16。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮。请点击此处查看此图的大图。
图8：规则和不规则的循环模式样本 （A）该图像反映了通过重复和一致的模式进行的总共16个完整的循环，反映了性类固醇激素的有规律振荡。在此中，发情由最低点表示，发情期由中间表示，发情期由最高高度的条形表示。这些数据通过跟踪发情阶段之间的天数进行分析，每个发情期到发情期代表一个完整的周期。这些数据反映了加州大学洛杉矶分校饲养的雌性大鼠的数据。（B）该图像代表了22只大鼠的各种非周期性模式的理论组合。在全高柱线的多个重复日数中可以看到扩展发情，在最低条形高度的多个重复日中看到扩展的发情，并且没有从发情到明细的周期性进展模式。缩写：估计值 = 发情期;迪斯特/迪斯特 = 迪斯特鲁斯。 请点击此处查看此图的大图。
（A） 此堆叠条形图反映了用于将收集到的单个样本分类到发情样本阶段的工具的每个组件。在这里，监测10天的受试者显示了各种细胞类型，数量和排列。这对青春期动物来说是预期的，因为荷尔蒙水平通常不会变得一致或正常化，直到成年期。（B）在这里，为监测了20天的动物提供了发情曲线。在这里可以看到类似的不规则性，受试者在死亡中停留了4天，而不是典型的1-2天。这些数据代表了佩珀代因大学饲养的6只雌性大鼠。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮;C = 团块;ED = 均匀分散;RD = 随机分散;COM = 组合;贴片 = smidge;模数 = 中等;数字 = 数量;EXE = 运动 ;SED = 久坐不动;东部 = 发情期;死亡 = 二极;亲 = 原发情;气象 = 气象。
（A）本节描述了每天分类为destrus的单个大鼠的分类行列式数据。第一个图像 （A1） 表示在 10 天内收集的数据，第二个图像 （A2） 表示 20 天内收集的数据。（B）本节描述了每天被归类为发情期的单个大鼠的数据。第一个图像 （B1） 表示在 10 天内收集的数据，第二个图像 （B2） 表示 20 天内收集的数据。（C）这描述了被确定为发情期的每天的单个大鼠的数据。第一个图像 （C1） 表示在 10 天内收集的数据，第二个图像 （C2） 表示 20 天内收集的数据。（D）该系列的这一部分描述了被确定为气象阶段的单个大鼠每天的分类成分数据。第一个图像 （D1） 表示在 10 天内收集的数据，第二个图像 （D2） 表示在 20 天内收集的数据。这些数字中的数据反映了佩珀代因大学饲养的6只雌性大鼠的数据。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮;C = 团块;ED = 均匀分散;RD = 随机分散;COM = 组合;贴片 = smidge;模数 = 中等;数字 = 数量;EXE = 运动 ;SED = 久坐不动;东部 = 发情期;死亡 = 二极;亲 = 原发情;气象 = 气象。请点击此处查看此图的大图。
| 美国东部标准时间： 10 天 | 持续时间（天） | 断续器（%） | 低浓铀 （%） | 断续器 （%） | 断续器 （%） | 总细胞计数（%） |
| 3 | 88 | 2.78 | 1.89 | 7.33 | MOD： 44.44 NUM： 44.44 贴片： 11.11 | |
| 范围 | 2–4 | 70–100 | 0–10 | 0–17 | 0–20 | 斯密奇-无数 |
| 安排 | C： 50 编者： 0 研发： 50 |
青色： 0 编者： 0 研发： 100 |
青色： 0 编者： 0 研发： 100 |
C： 50 编者： 0 研发： 50 |
||
| 美国东部标准时间： 20 天 | 持续时间（天） | 断续器（%） | 低浓铀 （%） | 断续器 （%） | 断续器 （%） | 总细胞计数（%） |
| 4 | 71.92 | 5.5 | 2.92 | 19.67 | 模组： 50 刀头： 50 贴片： 0 | |
| 范围 | 4–4 | 10–100 | 0–20 | 0–20 | 0–80 | 斯密奇-无数 |
| 安排 | C： 60 编： 6.67 RD： 33.33 |
青色： 0 编： 12.5 RD： 87.5 |
青色： 33.33 编者： 0 RD： 66.67 |
青色： 44.44 编者： 0 RD： 55.56 |
表1：平均阶段行列式样品。 这些表格描述了分类决定因素的平均值和收集的所有EST阶段的概述。上表反映了所有监测10天的动物的平均值，下表反映了20天的平均值。这包括发情周期的持续时间、细胞类型和百分比、细胞排列以及每种细胞类型所见每种排列的百分比。这些数据反映了佩珀代因大学饲养的6只雌性大鼠的数据。缩写：AKE =无核角质化上皮;LEU = 白细胞;LNE = 大核上皮;SNE = 小核上皮;C = 团块;ED = 均匀分散;RD = 随机分散;东部时间 = 发情期。
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Discussion
关键步骤和重要注意事项
所提供方案中的某些关键步骤需要强调，特别是在阴道细胞的收集中。在阴道液提取过程中，确保注射器插入的适当角度和深度是产生满意结果并最终防止对动物的刺激，伤害或宫颈刺激的关键。子宫颈的刺激可以是假性妊娠诱导的一个来源，表现为12-14天的白细胞纯阴道涂片11。在显微镜评估阶段，关注显示收集的阴道细胞的视觉平面至关重要。这是通过识别一个或两个单元格并调整可视化直到实现焦点来完成的。
在此之后，通过扫描整个显微镜载玻片来捕获阴道细胞的代表性图像以进行分期。这确保了捕获的图像反映了动物阴道管中收集和存在的内容的准确描述。在分类之前，必须熟悉分类决定因素，例如区分细胞类型和每种细胞类型可以具有的各种转化。建议每个参与者都接受适当的培训，并通过预先准备的练习幻灯片进行阶段识别。
为了减少过程中涉及的偏倚和主观性，建议在分类阶段包括两名参与者，两名参与者对治疗组分配保持盲目，同时知道每只动物先前记录的阶段识别。分配两名参与者对样本进行分类可以举行会议并减少识别中的主观性。但是，如果参与者要单独对样本进行分类，则建议在开发专业知识时有一个初始协作期，以提高评分者之间的可靠性。可以采用二次检查系统来防止不一致的发现，例如在分类后交换数据集并利用照片来确认初始评估。
限制和修改
当前技术的局限性包括生存期的持续时间。由于重复插入注射器可能伴随的伤害或刺激，长期和反复监测与动物的适当护理和使用不一致。因此，在进行纵向研究时，可能需要通过降低灌洗频率来修改程序。例如，不是每天监测每只动物一次，而是可以将大鼠分成几组，在一周中的不同日子进行监测。第二个限制涉及在概述的过程中没有样品染色，没有按颜色分离细胞组分，从而更加依赖上述方案中列出的分类决定簇。
此外，在这种分类决定因素中，有一些主观因素可能限制精确复制。具体而言，所收集样品中的细胞数量百分比基于个人估计。这方面的修改可以包括开发一种数学算法来量化存在的单个细胞类型。替代修改可能包括沉积在一张显微镜载玻片上的样品数量，可以根据载玻片和盖子的大小增加。进一步的局限性可能包括本研究中缺乏阴道液数据 - 对未来研究的修改可能包括记录收集的阴道液状况，作为对分期分类的贡献。该协议的其他修改可能包括利用另一种等渗流体进行细胞提取，这将产生相同的结果，例如磷酸盐缓冲盐水13。最后，当将该程序应用于不同年龄或菌株的大鼠时，由于身体大小或活动水平，可能需要修改动物处理技术等。这可以包括用于成人的抓握方法69 和前肢Crisscross64 方法以及用于年轻大鼠的单手和双手约束方法64 。
替代方法
与发情周期监测的替代方法相比，阴道灌洗在准确性，产生的信息量，最小的侵入性和低相关成本方面是独一无二的。子宫和卵巢的组织学检查可用于识别周期阶段，但更具侵入性，不允许持续监测。虽然测量性类固醇激素水平有助于监测发情周期，但它需要血液收集，并且不允许表征每个受试者独特的细胞或阴道液谱。由于外生殖器的发育与性类固醇激素水平间接相关，阴道开口的检查可以提供关于性成熟的信息。此外，组织的颜色，水分水平，大小和阴道开口的肿胀与发情周期阶段70相关。然而，导致大鼠阴道管开口的确切生理学尚未得到充分报道。最近的出版物发现，这只是生殖发育的间接标志，并不总是与青春期31，34保持一致。尿液样品的生化分析具有成本效益且易于进行，但不允许其他方法的特异性和可靠性71。因此，它不如检查阴道管中存在的细胞可靠或有效。
此外，电阻抗的测量已被用于监测发情周期，并且比液体灌洗在物理上刺激性更小。但是，此方法不会提供有关分类组件的尽可能多的信息。该装置专门设计用于优化有意交配的时间，测量性类固醇激素水平最高时为72，73，74。此外，据报道，这种方法对于区分EST和非EST是有效的，但其监测75以外的发情周期的能力有限。总体而言，据报道这种方法不可靠，并不总是具有成本效益，并且在文献中不经常使用，导致缺乏可比数据74。虽然阴道拭子在它提供的信息中与灌洗最相似，但它包括增加的刺激或伤害的风险，因为它需要直接接触阴道管内膜以取回细胞。最后，虽然对显微镜载玻片进行染色可以在细胞类型之间提供更鲜明的对比度并允许样品保存，但与湿式载玻片53相比，这是一项更耗时且更昂贵的工作。总体而言，每种监测技术都有其局限性和优点，利用这些方法的组合来接受啮齿动物发情周期的全面检查可能是有益的。
应用
在更大的科学界和公众的背景下看待当前的研究仍然很重要。这种方法可以用于任何涉及检查雌性动物的项目 - 不仅在专注于有意育种的研究中，排除出现异常的动物和/或下丘脑 - 垂体 - 卵巢轴的功能，而且还用于治疗组内的主要见解。更具体地说，该程序在i）药理学研究中是有影响力的，因为各种药物和化学物质破坏或改变生殖道和发情周期11，27，76;ii）神经系统研究，例如那些专注于创伤性脑损伤，认知或退行性疾病的研究，由于性类固醇激素与神经系统之间的相互作用77;iii）循环系统研究由于性类固醇激素受体位于肌细胞上以及随后的相互作用77;iv）与骨骼生长相关的研究38;到内分泌系统11，78;v）其他非生产性研究3.
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项研究是通过加州大学洛杉矶分校脑损伤研究中心（BIRC）之间NIH资助的合作进行的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera | AmScope | Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 | https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15 |
| BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel | Fischer Scientific | 14-815-526 | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201 |
| Bed O Cob 1/8 | NEWCO | 93009 | https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/ |
| Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass | Fischer Scientific | 12-553-7A | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a |
| Corning™ Rectangular Cover Glasses | Fischer Scientific | 12-553-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true |
| Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fischer Scientific | 06-666 | https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes |
| Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001 | NEWCO Specialty and LabDiet | 5012 | https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html |
| Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm | Grainger | 36UX10 | https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC |
| Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% | Live Action Safety | ABB079830939 | https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/ |
| Syringe Sterile 1ml with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies | BH Supplies | ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 | https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ== |
| Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen | Allentown | LV40326013 | https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description |
| Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad | Medline | EAN: 0480196288558 Global Trade Identification Number: 40080196288558 |
https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4 |
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