Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedret enzymbeskyttelsesanalyse for å studere Staphylococcus aureus internalisering og intracellulær effekt av antimikrobielle forbindelser

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen tar sikte på å beskrive hvordan man studerer omfanget av Staphylococcus aureus internalisering og dens evne til å overleve inne i den menneskelige vertscellen, samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser.

Abstract

Staphylococcus aureus uttrykker virulensfaktorer for å utløse internaliseringen i eukaryote celler og for å overleve inne i forskjellige subcellulære rom. Dette dokumentet beskriver en enzymbeskyttelsesanalyse for å studere omfanget av S. aureus internalisering og dens intracellulære overlevelse i tilhenger av ikke-profesjonelle fagocytiske celler (NPPCer) samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser. NPPCer dyrkes i en multi-brønn plate til de når 100% samløp. S. aureuskulturer dyrkes over natten i cellekulturmediet. Bakteriell suspensjon fortynnes i henhold til antall celler per brønn for å inokulere cellene ved en kontrollert multiplisitet av infeksjon. Inokulerte celler inkuberes i 2 timer slik at bakteriene kan internaliseres av NPPCene, hvoretter lysostaphin legges til kulturmediet for selektivt å drepe ekstracellulære bakterier. Lysostaphin er til stede i kulturmediet for resten av eksperimentet.

På dette tidspunktet kan de infiserte cellene inkuberes med antimikrobielle forbindelser for å vurdere deres intracellulære aktiviteter mot S. aureus. Deretter vaskes cellene tre ganger for å fjerne stoffene, og intracellulær S. aureusbelastning kvantifiseres deretter ved å dyrke på agarplater. Alternativt, for å studere stafylokokkers virulensfaktorer involvert i intracellulær overlevelse og celletoksisitet, kan lysostaphin inaktiveres med proteinase K for å eliminere behovet for vasketrinn. Dette tipset forbedrer påliteligheten til den intracellulære bakterielle belastnings kvantifiseringen, spesielt hvis celler har en tendens til å løsne fra kulturplaten når de blir sterkt smittet på grunn av multiplikasjonen av intracellulær S. aureus. Disse protokollene kan brukes med nesten alle typer tilhenger NPPCer og med 3D-cellekulturmodeller som organoider.

Introduction

Staphylococcus aureus er både et livstruende patogen og en commensal bakterie i huden og slimhinnen som koloniserer to milliarder individer rundt om i verden1. Hos mennesker har nesebærere av S. aureus økt risiko for infeksjon med sin egen transportstamme; Imidlertid er de multifaktorielle determinantene til S. aureus mucosal vogn fortsatt uklare1,2. I tillegg til akutte infeksjoner kan pasienter også utvikle kroniske S. aureusinfeksjoner som ofte er utfordrende å kurere3. En bedre forståelse av vertspatogeninteraksjoner under kolonisering og infeksjon er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier og forbedre pasientbehandlingen.

In vitro, S. aureus kan utløse internaliseringen i vertsceller som uttrykker α5β1 integrin4. Trepartsinteraksjonen mellom stafylokokkerfibronectinbindende proteiner forankret til celleveggen til S. aureus, fibronektin og β1-integrin uttrykt på vertscelleoverflaten er kjent som hovedveien til S. aureus internalisering i NPPCer som keratinocytter, osteoblaster, fibroblaster og epitel- og endotelceller. Nyere studier viser at S. aureus finnes inne i menneskelige celler under nesekolonisering5,6 og infeksjon7. Imidlertid er rollen til det intracellulære reservoaret i patogenesen av S. aureusinfeksjon fortsatt uklar. Vertscellene kan fungere som et ly for S. aureus, som er beskyttet mot både immunsystemet8 og de fleste antimikrobielle forbindelser6,9.

Lysostaphin beskyttelsesanalysen, beskrevet av Proctor10 tidligere på 1980-tallet, muliggjør studiet av bakterielle og vertsfaktorer involvert i internalisering av S. aureusisolasjoner . Lysostaphin er en bakteriocin produsert av Staphylococcus simulans, som utviser kraftig aktivitet mot nesten alle S. aureusisolasjoner , inkludert antibiotikaresistente stammer11. Lysostaphin har blitt brukt til å ødelegge bare ekstracellulær S. aureus for å muliggjøre telling av bare levedyktige intracellulære bakterier12. Denne teknikken har blitt mye brukt og har bidratt til oppdagelsen av flere virulensfaktorer av S. aureus. Gentamycin, alene og kombinert med lysostaphin, er også mye brukt til å studere intracellulære bakterier.

En nylig studie viste imidlertid at gentamycin kommer inn i eukaryote celler og når internaliserte bakterier på en tids- og konsentrasjonsavhengig måte13. Denne studien viste også at lysostaphin ikke kommer inn i eukaryote celler, og bekrefter at en lysostaphinbasert enzymbeskyttelsesanalyse (EPA) er den mest nøyaktige analysen for å kvantifisere intracellulær S. aureusbelastning etter kultur13. Uansett hvilken forbindelse som brukes til å ødelegge ekstracellulære bakterier (f.eks. lysostaphin eller gentamycin), bør den fjernes ved å vaske cellene før du plating intracellulær S. aureus på agarplater. Etterfølgende vasker kan føre til løsrivelse av celler, spesielt dårlig tilhengerceller (f.eks. tungt infiserte celler), noe som vil føre til en underestimering av den intracellulære S. aureusbelastningen . Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan EPA kan brukes til å kvantifisere den intracellulære S. aureusbelastningen og for å måle den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser ved hjelp av en in vitro-modell . Vær oppmerksom på at det er foreslått en enkel metode for å forbedre påliteligheten av intracellulær belastnings kvantifisering ved å unngå intensive vasker.

Protocol

1. Kultur av menneskelige epitelceller

  1. Forbered komplett kulturmedium med Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) høy glukose med fenolrød, supplert med 10% foster bovint serum (FBS) uten antibiotika.
  2. Vokse A549 epitelceller i komplett kulturmedium ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2. Sørg for at bruken av et kulturfartøy i riktig størrelse har nok celler til påfølgende trinn (se trinn 1.10).
    MERK: En 75 cm2 (T-75) kolbe er tilstrekkelig til å frø to 24-brønns plater og subkulturere cellene.
  3. To dager før infeksjon, lag en enkelt 24-brønns plate.
  4. Fjern og kast det brukte kulturmediet fra T-75-kolben og vask cellene en gang med 10 ml Dulbecco′s fosfatbufret saltvann (DPBS).
  5. Tilsett 5 ml trypsin-EDTA og inkuber cellene i 5 min ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2.
  6. Tilsett 5 ml komplett kulturmedium og overfør cellene til et rør.
  7. Sentrifuger cellene i 5 min ved 300 × g.
  8. Kast supernatanten og resuspend cellene i 10 ml friskt komplett kulturmedium.
  9. Telle cellene med en automatisk celleteller (eller et tellekammer).
  10. Fortynn cellene i komplett kulturmedium for å forberede 30 ml cellesuspensjon i en konsentrasjon på 2,0 × 105 celler / ml.
  11. Tilsett 1 ml celleoppheng i hver brønn på en 24-brønnsplate, som tilsvarer en celletetthet på ca. 1,0 × 105 celle/cm² for et brønnareal på 2 cm².
  12. Inkuber cellene i 48 timer ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2 til de når 100 % samløp.
    MERK: I tillegg til betingelsene som skal testes, bør tre brønner reserveres for celletelling på infeksjonsdagen (se trinn 3.1.4). I henhold til antall forhold som skal testes, kan opptil to 24-brønnsplater tilberedes samtidig. Volumer som er angitt i protokollen, bør økes tilsvarende.

2. Kultur av S. aureus stammer

  1. To dager før infeksjon, forberede fullstendig infeksjon medium med DMEM høy glukose uten fenol rød, supplert med 10% FBS uten antibiotika.
  2. Thaw S. aureus stammer som skal testes på agarplater.
  3. Inkuber agarplatene i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
  4. Dagen før inokulering inokulerer du en koloni av S. aureusstammen som skal testes i 10 ml komplett infeksjonsmedium.
  5. Inkuber bakteriene i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C med risting ved 160 o/min. Bruk 50 ml rør holdt ved 45° for å unngå at bakteriene setter seg.
    MERK: Før du starter med en ny stamme, anbefales det å verifisere lysostaphin følsomhet under de samme kulturforholdene som skal brukes til videre eksperimenter (media, bakteriebelastninger og lysostaphinkonsentrasjon og inkubasjonstid). Det er også viktig å bestemme bakteriebelastningen som tilsvarer en OD600nm på 0,5 fordi den kan variere litt fra en stamme til en annen. Kulturforhold for bakteriestammer kan tilpasses i henhold til det eksperimentelle målet.

3. Infeksjonsanalyse med S. aureus

  1. Bestemmelse av celletetthet og levedyktighet
    1. Fjern og kast det brukte kulturmediet fra de tre brønnene som er dedikert til å telle A549-celler.
    2. Tilsett 1 ml komplett infeksjonsmedium som inneholder 5 μg/ml Hoechst 33342 og 1 μg/ml propidiumjodid.
      MERK: Hoechst 33342 er en kjent mutagen og bør håndteres med forsiktighet. Propidiumjodid, en potensiell mutagen, må håndteres med forsiktighet og avhendes på en sikker måte i henhold til gjeldende forskrifter.
    3. Inkuber cellene i 30 min ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2.
    4. Tell cellenummeret og beregn celle levedyktigheten ved hjelp av et fluorescensmikroskop med bruksfelt.
      MERK: Hvis et fluorescensmikroskop ikke er tilgjengelig, kan celletettheten og levedyktigheten beregnes med trypan blå farging ved hjelp av et celletellingskammer.
  2. Forberedelse av bakteriell suspensjon
    1. Dispenser 25 ml komplett infeksjonsmedium i et rør og forvarm ved 36 ± 1 °C.
    2. Juster S. aureusfjæringen til anOD600nm på 0,5 i komplett infeksjonsmedium ved hjelp av en celletetthetsmåler.
    3. Forbered 20 ml bakteriell suspensjon for celleinokulasjon ved å fortynne 0,5 OD600nm i komplett infeksjonsmedium for å oppnå en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 1 i henhold til antall celler per brønn.
      MERK: MOI tilsvarer antall bakterier som tilsetts per celle i hver brønn. For eksempel, for å oppnå en MOI på 1 med 1,0 × 106 celler per brønn, lag en bakteriell suspensjon ved 2,0 × 106 CFU / ml slik at 106 CFU kan legges i et volum på 500 μL (se trinn 3.3.3). MOI kan justeres i henhold til celletyper og bakteriestammer som skal testes.
    4. Bruk en automatisk spiralplate for å bestemme S. aureusbelastningen av den fortynnede bakterielle suspensjonen som skal brukes til celleinokulasjonstrinnet.
    5. Inkuber agarplatene i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    6. Neste dag teller du antall kolonier med en koloniteller for å beregne den nøyaktige MOI for hver stamme som testes.
      MERK: Hvis det ikke finnes noen automatisk spiralplate, kan bakteriebelastningen bestemmes ved seriell fortynning på en agarplate. Se den bakteriologiske analytiske håndboken for detaljer14.
  3. Celle inokulering
    1. Vær oppmerksom på hver brønn av 24-brønnsplaten ved lav forstørrelsesmikroskopi for å sikre at cellene er sunne og vokser som forventet.
    2. Fjern og kast det brukte cellekulturmediet fra 24-brønnsplaten.
    3. Tilsett 500 μL av bakteriell suspensjon for inokulering til hver brønn med 100% konfluente celler.
    4. Inkuber cellene i 2 timer ved 36 ± 1 °C og 5 % CO2.
      MERK: Det anbefales å bruke tre brønner på platen for hver tilstand som skal testes (triplikere) og utføre minst tre uavhengige eksperimenter. Forsinkelsen av inkubasjon kan tilpasses i henhold til det eksperimentelle målet.
  4. Kvantifisering av intracellulære bakterier med forbedret enzymbeskyttelsesanalyse (iEPA)
    1. Forbered 7 ml 4x lysisbuffer med 3,5 ml 2 % Triton X-100 i sterilt vann og 3,5 ml trypsin-EDTA.
    2. Forbered en lysostaphin lagerløsning ved 10 mg / ml i acetatbuffer og aliquot 25 μL i kryoksiner. Oppbevars ved -80 °C i opptil 6 måneder.
    3. Forbered 250 μL av en fersk lysostaphin arbeidsløsning ved 1 mg/ml ved å blande 25 μL av lysostaphinbestandsoppløsningen (10 mg/ml) og 225 μL 0,1 M Tris-HCl. Oppbevars ved 4 °C i opptil 48 timer.
    4. Forbered 6,25 ml komplett infeksjonsmedium supplert med lysostaphin ved å tilsette 6 ml fullstendig infeksjon middels til 250 μL av lysostaphin-arbeidsløsningen.
    5. Tilsett 250 μL komplett infeksjonsmedium supplert med lysostaphin i hver brønn og rør forsiktig platen ved å svinge platen for hånd.
    6. Inkuber cellene i 1 time ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2 for å la lysostaphinen drepe de ekstracellulære bakteriene.
    7. På slutten av inkubasjonstiden, tilsett 10 μL proteinase K ved 20 mg / ml i hver brønn for å inaktivere lysostaphin.
    8. Inkuber cellene i 2 min ved romtemperatur.
    9. Tilsett 250 μL 4x lysisbuffer for å lyse cellene med osmotisk støt.
    10. Inkuber cellene i 10 min ved 36 ± 1 °C.
    11. Bland grundig ved å pipettere opp og ned ti ganger over hele bunnen av brønnen for å sikre at cellene er helt lysnet og homogenisert.
    12. Bruk en automatisk spiralplate for å bestemme S. aureusbelastningen for hver brønn.
    13. Inkuber agarplatene i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    14. Neste dag teller du antall kolonier med en koloniteller for å beregne den intracellulære S. aureusbelastningen av hver brønn.
  5. Måling av intracellulær effekt av antimikrobielle forbindelser med enzymbeskyttelsesanalyse (EPA)
    1. Forbered 25 ml 1x lysisbuffer med 3,125 ml 2 % Triton X-100 i sterilt vann, 6,25 ml trypsin-EDTA og 15,625 ml sterilt vann.
    2. Forbered 250 μL av en fersk lysostaphin arbeidsløsning ved 1 mg/ml ved å blande 25 μL lysostaphin lageroppløsning (10 mg/ml) og 225 μL 0,1 M Tris-HCl.
    3. Forbered 25 ml komplett infeksjonsmedium supplert med lysostaphin ved å tilsette 24,75 ml fullstendig infeksjon middels til 250 μL av lysostaphin-arbeidsløsningen.
    4. For hver antimikrobielle forbindelse som skal testes, forberede 3,1 ml komplett infeksjonsmedium supplert med lysostaphin og den antimikrobielle forbindelsen ved konsentrasjonen som skal studeres.
    5. Fjern og kast det brukte cellekulturmediet fra 24-brønnsplaten.
    6. Tilsett 1 ml komplett infeksjonsmedium supplert med lysostaphin.
    7. Inkuber cellene i 1 time ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2 for å la lysostaphinen drepe de ekstracellulære bakteriene.
    8. Fjern og kast mediet som er supplert med lysostaphin fra 24-brønnsplaten.
    9. Fyll tre brønner med 1 ml medium supplert med lysostaphin pluss den antimikrobielle forbindelsen som skal testes.
    10. Gjenta trinn 3.5.9 for hver antimikrobielle forbindelse som skal testes.
    11. For kontrolltilstanden, fyll tre brønner med 1 ml medium supplert med lysostaphin uten antimikrobiell forbindelse.
    12. Inkuber cellene i 24 timer ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2.
    13. På slutten av inkubasjonsperioden fjerner og kaster du det brukte mediet og vasker forsiktig hver brønn tre ganger med steril DPBS med CaCl2 og MgCl2.
    14. Tilsett 1 ml 1x lysisbuffer til hver brønn for å løsne og lyse cellene ved osmotisk sjokk.
    15. Inkuber cellene i 10 min ved 36 ± 1 °C.
    16. Bland grundig ved å pipettere opp og ned ti ganger over hele brønnen for å sikre at cellene er helt lysnet og homogenisert.
    17. Bruk en automatisk spiralplate for å bestemme S. aureusbelastningen for hver brønn.
    18. Inkuber agarplatene i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    19. Neste dag teller du antall kolonier med en koloniteller for å beregne den intracellulære S. aureusbelastningen av hver brønn.
      MERK: Den intracellulære aktiviteten til hver antimikrobielle forbindelse bør beregnes i henhold til bakteriebelastningen av kontrolltilstanden. Det er også viktig å sjekke cytotoksisiteten til alle antimikrobielle forbindelser for å bevise at forskjellene som observeres mellom kontrollen og forbindelsene ikke skyldes celledød.

Representative Results

Resultatene av S. aureus internalisering av A549 epitelceller er avbildet i figur 1A. A549-celler ble inokulert med S. aureus SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B, som mangler fibronectinbindende proteiner A og B, ved en MOI på 1 i 2 timer. For å ødelegge ekstracellulær S. aureus ble lysostaphin lagt til kulturmediet, og cellene ble inkubert i 1 time. Deretter ble lysostaphin enten fjernet ved vask for EPA eller inaktivert med proteinase K for iEPA. Deretter ble cellene forstyrret i lysisbuffer, og bakteriebelastningen ble kvantifisert av kultur. Ved å bruke EPA var gjennomsnittlig intracellulær belastning henholdsvis 4,46 og 0,49 Log CFU/ml for SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, grønne stenger). Ved hjelp av iEPA var gjennomsnittlig intracellulær belastning henholdsvis 4,53 og 0,56 Log CFU/ml for SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, røde stenger). Det er interessant å merke seg at både EPA og iEPA viste lignende resultater, noe som kan forklares med hvor enkelt det er å utføre vaskene når cellene er i god stand og fordi S. aureusindusert cytotoksisitet er svært lav i disse eksperimentelle innstillingene (data ikke vist).

Resultatene av intracellulær aktivitet av vancomycin, rifampicin og levofloxacin mot S. aureus er avbildet i figur 1B. For å måle den intracellulære aktiviteten til disse antibiotika ble HaCaT-celler inokulert med S. aureus ATCC 29213 ved en MOI på 1 i 2 timer. Cellene ble inkubert med lysostaphin, med eller uten antimikrobielle forbindelser som skulle testes, i 24 timer. Deretter ble lysostaphin og de antimikrobielle forbindelsene fjernet ved vask. Cellene ble forstyrret i lysisbufferen, og bakteriebelastningen ble kvantifisert av kultur. Gjennomsnittlig intracellulær belastning var 4,57, 4,51, 3,03 og 2,91 log CFU/ml for kontroll, vancomycin (50 μg/ml), rifampicin (7 μg/ml) og levofloxacin (10 μg/ml) henholdsvis (figur 1B).

Figure 1
Figur 1: Intracellulær Staphylococcus aureusbelastning i epitelceller. (A) Enzymbeskyttelsesanalyse (grønne stenger) og forbedret enzymbeskyttelsesanalyse (røde stenger) i A549-celler infisert med S. aureus SF8300 WT og ΔfnbA/B. (B) Intracellulær aktivitet av antimikrobielle forbindelser i HaCaT-celler infisert med S. aureus ATCC 29213. Stolper representerer gjennomsnittsverdiene til tre uavhengige eksperimenter utført i triplikat. Feilfelt representerer standardavvikene. p < 0,0001. Forkortelser: Ctrl = kontroll; cfu = kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Analysene beskrevet her er verdifulle for å studere omfanget av internalisering og intracellulær overlevelse av S. aureus i NPPCs, samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser6,15,16. Noen trinn i begge analyseprotokollene kan være kritiske. Helsetilstanden og tettheten av cellene må være perfekt kontrollert og konsistent mellom uavhengige eksperimenter. Bakteriell inokulum må nøye standardiseres for å oppnå en ekte MOI nær den målrettede teoretiske MOI. Generelt må det tas hensyn til ikke å løsne noen av cellene under pipettering. Vaskene for å fjerne lysostaphin og antibiotika er kritiske trinn i EPA. Bruken av proteinase K har vist seg å forbedre dette trinnet når det ikke brukes antibiotika (se nedenfor). Sist, men ikke minst, bør cellene løsnes helt i hver brønn og grundig homogeniseres etter inkubasjonen med lysisbufferen for pålitelig kvantifisere S. aureus intracellulær belastning.

I noen tilfeller kan det oppstå problemer, og flere punkter må kontrolleres først. Ved mangel på reproduserbarhet må man huske på at S. aureus kan danne klumper, noe som gjør kvantifisering ved absorbans unøyaktig. Klumpingen av bakterier kan økes ved sentrifugering og vasketrinn hvis kulturmediet skal byttes ut (f.eks. for å eliminere et utskilt protein). Bakteriell suspensjon bør brukes raskt fordi bakterier fortsetter å vokse ved romtemperatur. Lysostaphin-effekten kan reduseres på grunn av feil lagringsforhold, suboptimal pH for enzymaktivitet i kulturmediene, variasjon i enzymatisk aktivitet mellom partier og leverandører, og mangel på lysostaphinfølsomhet av noen stammer under spesifikke vekstforhold. Fenolrød kan ha en liten bakteriostatisk effekt, spesielt når kulturmediet er relativt dårlig i næringsstoffer sammenlignet med de typiske buljonger som brukes til voksende bakterier. Dermed er det tilrådelig å bruke et cellekulturmedium uten fenolrød, noe som også forbedrer fluorescens mikroskopiske observasjoner ved å redusere bakgrunnsstøyen.

Selv om denne metoden er et verdifullt verktøy for å studere den intracellulære skjebnen til forskjellige stammer, bør noen grenser for metoden vurderes. Bruken av en svært høy MOI kan overbelaste evnen til internalisering av NPPCer og utjevne forskjellene mellom de forskjellige stammene som er testet. Omfanget av internalisering av de mest cytotoksiske stammene kan undervurderes fordi lysostaphin (eller antibiotika) raskt ødelegger S. aureus som frigjøres av skadede celler. Dermed er eksperimenter med lengre varigheter (dvs. for å studere intracellulær overlevelse eller intracellulær aktivitet av antibiotika) lettere å sette opp med stammer med lav cytotoksisitet. Derfor bør inkubasjonstiden og MOI justeres nøyaktig i henhold til belastningsvirulensen, celletypen og det eksperimentelle målet.

Metoden beskrevet her med bruk av lysostaphin er mer pålitelig enn de som er basert på gentamicin fordi, i motsetning til lysostaphin, har gentamicin en tendens til å bli internalisert av vertsceller13. Den andre fordelen er muligheten til å inaktivere lysostaphin. Hemming av lysostaphinaktivitet ble rapportert av Kim et al.13 ved bruk av EDTA for å chelate sinkioner eller 1,10-fenanthroline; Imidlertid er det fortsatt nødvendig med intensive vasker for å fjerne enzymet før plating av bakteriene. Her muliggjør proteinase K rask inaktivering av lysostaphin. Vi observerte at celler har en tendens til å løsne fra kulturplaten når de blir sterkt smittet på grunn av multiplikasjonen av intracellulær S. aureus. Ved å hoppe over det endelige vasketrinnet forenklet iEPA-metoden i stor grad teknisk håndtering og gjorde det mulig å gjenopprette de internaliserte bakteriene i løst festede eller allerede frittliggende celler.

De mer konsentrerte reagensene og bufferne som brukes i iEPA bidro også til å redusere pipetteringsinnsatsen og minimere tap av celler. I tillegg kan iEPA brukes med celler i suspensjon, så vel som med organoider som er vanskelige å vaske. Til slutt muliggjør enzymbeskyttelsesanalyser studiet av omfanget av internalisering og S . aureus intracellulære skjebne, samt intracellulær aktivitet av antimikrobielle legemidler med forskjellige in vitro-modeller . Forbedringer bør gjøres for bedre å karakterisere forholdet mellom internalisering og cytotoksisitet for bedre å sette pris på viktigheten av å utvikle legemidler som er i stand til å nå S. aureus inne i cellen.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

S. aureus stammer SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA / B ble sjenerøst begavet av Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra FINOVI-foreningen (#AO13 FINOVI) under stiftelsens aegis for University of Lyon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

Biologi utgave 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Forbedret enzymbeskyttelsesanalyse for å studere <em>Staphylococcus aureus</em> internalisering og intracellulær effekt av antimikrobielle forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter