Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Улучшенный анализ защиты ферментов для изучения интернализации золотистого стафилококка и внутриклеточной эффективности антимикробных соединений

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Этот протокол направлен на описание того, как изучить степень интернализации золотистого стафилококка и его способность выживать внутри клетки-хозяина человека, а также внутриклеточную эффективность антимикробных соединений.

Abstract

Золотистый стафилококк экспрессирует факторы вирулентности, чтобы вызвать его интернализацию в клетки эукариот и выжить внутри различных субклеточных компартментов. В данной работе описывается ферментный защитный анализ для изучения степени интернализации S. aureus и его внутриклеточной выживаемости в адгезивных непрофессиональных фагоцитарных клетках (NPPCs), а также внутриклеточной эффективности антимикробных соединений. NFPC выращивают в многолуночной плите до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния. Культуры S. aureus выращивают в течение ночи в клеточной культуральной среде. Бактериальную суспензию разбавляют в соответствии с количеством клеток в лунке, чтобы привить клетки при контролируемой множественности инфекции. Инокулированные клетки инкубируют в течение 2 ч, чтобы позволить бактериям быть интернализованными NPC, после чего лизостафин добавляется в культуральную среду для селективного уничтожения внеклеточных бактерий. Лизостафин присутствует в питательной среде до конца эксперимента.

На этом этапе инфицированные клетки могут быть инкубированы с антимикробными соединениями для оценки их внутриклеточной активности против S. aureus. Затем клетки промывают три раза, чтобы удалить лекарства, и внутриклеточная нагрузка S. aureus затем количественно оценивается путем культивирования на агаровых пластинах. Альтернативно, для изучения факторов стафилококковой вирулентности, участвующих во внутриклеточной выживаемости и клеточной токсичности, лизостафин может быть инактивирован протеиназой К, чтобы устранить необходимость в промывочных шагах. Этот наконечник повышает надежность количественной внутриклеточной бактериальной нагрузки, особенно если клетки имеют тенденцию отделяться от культуральной пластины, когда они сильно заражаются из-за размножения внутриклеточного S. aureus. Эти протоколы могут использоваться практически со всеми типами адгезивных NPC и с 3D-моделями клеточных культур, такими как органоиды.

Introduction

Золотистый стафилококк является одновременно опасным для жизни патогеном и комменсальной бактерией кожи и слизистой оболочки, которая колонизирует два миллиарда особей по всему миру1. У человека носовые носители S. aureus имеют повышенный риск заражения собственным штаммом носительства; однако многофакторные детерминанты носительства слизистой оболочки S. aureus до сих пор неясны1,2. В дополнение к острым инфекциям у пациентов также могут развиться хронические инфекции S. aureus, которые часто трудно вылечить3. Лучшее понимание взаимодействия хозяина и патогена во время колонизации и инфекции имеет решающее значение для разработки новых терапевтических стратегий и улучшения управления пациентами.

In vitro S. aureus может инициировать его интернализацию в клетки-хозяева, экспрессирующие интегрин α5β14. Трехстороннее взаимодействие между стафилококковыми фибронектин-связывающими белками, закрепленными на клеточной стенке S. aureus, фибронектином и интегрином β1, экспрессируемым на поверхности клетки-хозяина, хорошо известно как основной путь интернализации S. aureus в NPCC, таких как кератиноциты, остеобласты, фибробласты и эпителиальные и эндотелиальные клетки4. Недавние исследования показывают, что S. aureus можно найти внутри клеток человека во время колонизации носа5,6 и инфекции7. Однако роль внутриклеточного резервуара в патогенезе инфекции S. aureus остается неясной. Клетки-хозяева могут выступать в качестве укрытия для S. aureus, который защищен как от иммунной системы8, так и от большинства антимикробных соединений6,9.

Анализ защиты лизостафинов, описанный Proctor10 ранее в 1980-х годах, позволяет изучать бактериальные факторы и факторы хозяина, участвующие в интернализации изолятов S. aureus . Лизостафин представляет собой бактериоцин, продуцируемый Staphylococcus simulans, который проявляет мощную активность в отношении почти всех изолятов S. aureus , включая устойчивые к антибиотикам штаммы11. Лизостафин был использован для уничтожения только внеклеточного S. aureus , чтобы обеспечить подсчет только жизнеспособных внутриклеточных бактерий12. Этот метод широко использовался и способствовал открытию нескольких факторов вирулентности S. aureus. Гентамицин, отдельно и в сочетании с лизостафином, также широко используется для изучения внутриклеточных бактерий.

Однако недавнее исследование показало, что гентамицин проникает в эукариотические клетки и достигает интернализованных бактерий в зависимости от времени и концентрации13. Это исследование также продемонстрировало, что лизостафин не попадает в эукариотические клетки, подтверждая, что анализ защиты ферментов на основе лизостафина (EPA) является наиболее точным анализом для количественной оценки внутриклеточной нагрузки S. aureus с помощью culture13. Независимо от того, какое соединение используется для уничтожения внеклеточных бактерий (например, лизостафин или гентамицин), его следует удалить, промыв клетки перед покрытием внутриклеточного S. aureus на агаровых пластинах. Последовательные промывки могут привести к отслоению клеток, особенно плохо адгезивных клеток (например, сильно инфицированных клеток), что приведет к недооценке внутриклеточной нагрузки S. aureus . В этой статье подробно описывается, как EPA может быть использован для количественной оценки внутриклеточной нагрузки S. aureus и для измерения внутриклеточной эффективности противомикробных соединений с использованием модели in vitro . Следует отметить, что был предложен простой метод повышения надежности количественной оценки внутриклеточной нагрузки, избегая интенсивных промывок.

Protocol

1. Культура эпителиальных клеток человека

  1. Приготовьте полную культуральную среду с модифицированной средой Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с феноловым красным, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) без антибиотиков.
  2. Выращивайте эпителиальные клетки A549 в полной питательной среде при 36 ± 1 °C в 5% CO2. Обеспечьте использование сосуда для культивирования соответствующего размера, чтобы иметь достаточное количество клеток для последующих этапов (см. шаг 1.10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одной колбы объемом 75 см2 (Т-75) достаточно для посева двух 24-луночных пластин и субкультуры клеток.
  3. За два дня до заражения подготовьте одну 24-луночную пластину.
  4. Извлеките и выбросьте отработанную питательную среду из колбы Т-75 и промыть клетки один раз 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS).
  5. Добавьте 5 мл трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки в течение 5 мин при 36 ± 1 °C в 5% CO2.
  6. Добавьте 5 мл полной питательной среды и переложите клетки в пробирку.
  7. Центрифугируют ячейки в течение 5 мин при 300 × г.
  8. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 10 мл свежей полной питательной среды.
  9. Подсчитывайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек (или счетной камеры).
  10. Развести клетки в полной культуральной среде для получения 30 мл клеточной суспензии в концентрации 2,0 × 105 клеток/мл.
  11. Добавьте 1 мл клеточной суспензии к каждой скважине 24-луночной пластины, что соответствует плотности ячейки приблизительно 1,0 × 105 ячеек/см² для площади скважины 2 см².
  12. Инкубируют клетки в течение 48 ч при 36 ± 1 °C в 5% CO2 до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к условиям, подлежащим тестированию, три колодца должны быть зарезервированы для подсчета клеток в день заражения (см. шаг 3.1.4). В зависимости от количества условий, подлежащих испытанию, одновременно могут быть подготовлены до двух плит из 24 скважин. Объемы, указанные в протоколе, должны быть соответственно увеличены.

2. Культура штаммов S. aureus

  1. За два дня до заражения приготовьте полную инфекционную среду с высоким содержанием глюкозы DMEM без фенольного красного цвета, дополненного 10% FBS без антибиотиков.
  2. Штаммы Thaw S. aureus для тестирования на агаровых пластинах.
  3. Инкубировать агаровые пластины в течение 18-24 ч при 36 ± 1 °C.
  4. За день до инокуляции инокулируют одну колонию штамма S. aureus для тестирования в 10 мл полной инфекционной среды.
  5. Высиживать бактерии в течение 18-24 ч при 36 ± 1 °C с встряхиванием при 160 об/мин. Используйте пробирки по 50 мл, удерживаемые под углом 45°, чтобы избежать оседания бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы с новым штаммом рекомендуется проверить его восприимчивость к лизостафину в тех же условиях культуры, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов (среды, бактериальные нагрузки, концентрация лизостафина и время инкубации). Также важно определить бактериальную нагрузку, соответствующую OD600 нм 0,5, поскольку она может незначительно варьироваться от одного штамма к другому. Условия культивирования бактериальных штаммов могут быть адаптированы в соответствии с экспериментальной целью.

3. Анализ на инфекцию S. aureus

  1. Определение плотности и жизнеспособности клеток
    1. Извлеките и выбросьте отработанную культуральную среду из трех скважин, предназначенных для подсчета клеток A549.
    2. Добавьте 1 мл полной инфекционной среды, содержащей 5 мкг/мл Hoechst 33342 и 1 мкг/мл йодида пропидия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 является известным мутагеном и с ним следует обращаться с осторожностью. Йодид пропидия, потенциальный мутаген, должен обрабатываться с осторожностью и безопасно утилизироваться в соответствии с применимыми правилами.
    3. Инкубируют клетки в течение 30 мин при 36 ± 1 °C в 5% CO2.
    4. Подсчитайте число клеток и рассчитайте жизнеспособность клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с орудным полем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если флуоресцентный микроскоп недоступен, плотность и жизнеспособность клеток могут быть рассчитаны с помощью окрашивания в синий цвет трипана с помощью камеры подсчета клеток.
  2. Приготовление бактериальной суспензии
    1. Дозировать 25 мл полной инфекционной среды в пробирке и предварительно прогреть при 36 ± 1 °C.
    2. Отрегулируйте суспензию S. aureus до anOD600nm 0,5 в полной инфекционной среде с помощью клеточного плотномера.
    3. Подготовьте 20 мл бактериальной суспензии для клеточной инокуляции, разбавляя 0,5 OD600 нм в полной инфекционной среде для достижения кратности инфекции (MOI) 1 в соответствии с количеством клеток на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MOI соответствует количеству бактерий, добавленных на клетку в каждой лунке. Например, для достижения MOI 1 с 1,0 × 106 клетками на лунку, приготовьте бактериальную суспензию при 2,0 × 106 КОЕ/мл, чтобы можно было добавить 106 КОЕ в объеме 500 мкл (см. шаг 3.3.3). MOI может быть скорректирован в соответствии с типами клеток и бактериальными штаммами, подлежащими тестированию.
    4. Используйте автоматический спиральный пломбер для определения нагрузки S. aureus разбавленной бактериальной суспензии, которая будет использоваться для стадии посева клеток.
    5. Инкубировать агаровые пластины в течение 18-24 ч при 36 ± 1 °C.
    6. На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать точный MOI для каждого тестируемого штамма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если автоматический спиральный пломбир недоступен, бактериальная нагрузка может быть определена путем последовательного разбавления на агаровой пластине. Подробности см. в руководстве по бактериологическому анализу14.
  3. Клеточная прививка
    1. Наблюдайте за каждым колодцем 24-луночной пластины с помощью микроскопии с низким увеличением, чтобы убедиться, что клетки здоровы и растут, как и ожидалось.
    2. Извлеките и выбросьте культуральную среду отработанных клеток с 24-луночной пластины.
    3. Добавьте 500 мкл бактериальной суспензии для инокуляции в каждую лунку со 100% сливающимися клетками.
    4. Инкубируют клетки в течение 2 ч при 36 ± 1 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать три скважины плиты для каждого условия, подлежащего испытанию (втрое) и выполнить не менее трех независимых экспериментов. Задержка инкубации может быть адаптирована в соответствии с экспериментальной целью.
  4. Количественная оценка внутриклеточных бактерий с улучшенным анализом защиты ферментов (iEPA)
    1. Приготовьте 7 мл 4-кратного буфера лизиса с 3,5 мл 2% Тритона X-100 в стерильной воде и 3,5 мл трипсина-ЭДТА.
    2. Готовят раствор лизостафина в 10 мг/мл в ацетатном буфере и аликвоте 25 мкл в криовиалы. Хранить при температуре -80 °C до 6 месяцев.
    3. Готовят 250 мкл свежего рабочего раствора лизостафина при 1 мг/мл, смешивая 25 мкл раствора лизостафина (10 мг/мл) и 225 мкл 0,1 М Tris-HCl. Хранить при температуре 4 °C до 48 ч.
    4. Готовят 6,25 мл полной инфекционной среды, дополненной лизостафином, добавляя 6 мл полной инфекционной среды к 250 мкл рабочего раствора лизостафина.
    5. Добавьте в каждую лунку 250 мкл полной инфекционной среды, дополненной лизостафином, и осторожно перемешайте пластину, поворачивая пластину вручную.
    6. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 36 ± 1 °C в 5% CO2 , чтобы лизостафин убил внеклеточные бактерии.
    7. В конце инкубационного времени добавляют 10 мкл протеиназы К при 20 мг/мл в каждую лунку, чтобы инактивировать лизостафин.
    8. Инкубировать клетки в течение 2 мин при комнатной температуре.
    9. Добавьте 250 мкл 4-кратного буфера лизиса, чтобы лизировать клетки осмотическим шоком.
    10. Инкубировать клетки в течение 10 мин при 36 ± 1 °C.
    11. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз десять раз по всему дну скважины, чтобы клетки были полностью лизированы и гомогенизированы.
    12. Используйте автоматический спиральный пломбировщик для определения нагрузки S. aureus каждой скважины.
    13. Инкубировать агаровые пластины в течение 18-24 ч при 36 ± 1 °C.
    14. На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать внутриклеточную нагрузку S. aureus каждой лунки.
  5. Измерение внутриклеточной эффективности антимикробных соединений с помощью ферментного защитного анализа (EPA)
    1. Приготовьте 25 мл 1x лизизного буфера с 3,125 мл 2% Triton X-100 в стерильной воде, 6,25 мл трипсина-ЭДТА и 15,625 мл стерильной воды.
    2. Готовят 250 мкл свежего рабочего раствора лизостафина при 1 мг/мл путем смешивания 25 мкл раствора лизостафина (10 мг/мл) и 225 мкл 0,1 М Tris-HCl.
    3. Готовят 25 мл полной инфекционной среды, дополненной лизостафином, добавляя 24,75 мл полной инфекционной среды к 250 мкл рабочего раствора лизостафина.
    4. Для каждого антимикробного соединения, подлежащего тестированию, готовят 3,1 мл полной инфекционной среды, дополненной лизостафином и антимикробным соединением в исследуемой концентрации.
    5. Извлеките и выбросьте культуральную среду отработанных клеток с 24-луночной пластины.
    6. Добавьте 1 мл полной инфекционной среды, дополненной лизостафином.
    7. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 36 ± 1 °C в 5% CO2 , чтобы лизостафин убил внеклеточные бактерии.
    8. Удалите и выбросьте среду, дополненную лизостафином, из 24-луночной пластины.
    9. Заполните три лунки 1 мл среды, дополненной лизостафином, плюс антимикробное соединение, подлежащее тестированию.
    10. Повторите этап 3.5.9 для каждого антимикробного соединения, подлежащего испытанию.
    11. Для контрольного состояния заполните три скважины 1 мл среды, дополненной лизостафином без каких-либо антимикробных соединений.
    12. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 36 ± 1 °C в 5% CO2.
    13. В конце инкубационного периода удалить и выбросить отработанную среду и аккуратно промыть каждую лунку три раза стерильным DPBS с CaCl2 и MgCl2.
    14. Добавьте 1 мл 1 буфера лизиса в каждую лунку, чтобы отделить и лизировать клетки осмотическим шоком.
    15. Инкубировать клетки в течение 10 мин при 36 ± 1 °C.
    16. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз десять раз по всей лунке, чтобы клетки были полностью лизированы и гомогенизированы.
    17. Используйте автоматический спиральный пломбировщик для определения нагрузки S. aureus каждой скважины.
    18. Инкубировать агаровые пластины в течение 18-24 ч при 36 ± 1 °C.
    19. На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать внутриклеточную нагрузку S. aureus каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточная активность каждого антимикробного соединения должна рассчитываться в соответствии с бактериальной нагрузкой контрольного состояния. Также важно проверить цитотоксичность всех антимикробных соединений, чтобы доказать, что различия, наблюдаемые между контролем и соединениями, не связаны с гибелью клеток.

Representative Results

Результаты интернализации S. aureus эпителиальными клетками A549 показаны на рисунке 1А. Клетки A549 инокулировали S. aureus SF8300 WT и SF8300 ΔfnbA/B, в которых отсутствуют фибронектин-связывающие белки A и B, при MOI 1 в течение 2 ч. Для уничтожения внеклеточного S. aureus в культуральную среду добавляли лизостафин, и клетки инкубировали в течение 1 ч. Затем лизостафин удаляли либо промывкой для EPA, либо инактивировали протеиназой K для iEPA. Затем клетки были разрушены в буфере лизиса, и бактериальная нагрузка была количественно оценена культурой. При использовании EPA средние внутриклеточные нагрузки составляли 4,46 и 0,49 log CFU/mL для SF8300 WT и SF8300 ΔfnbA/B соответственно (рисунок 1A, зеленые полосы). При использовании iEPA средние внутриклеточные нагрузки составляли 4,53 и 0,56 log CFU/mL для SF8300 WT и SF8300 ΔfnbA/B соответственно (рисунок 1A, красные полосы). Интересно отметить, что как EPA, так и iEPA показали аналогичные результаты, что можно объяснить простотой выполнения промывок, когда клетки находятся в хорошем состоянии, и тем, что цитотоксичность, индуцированная S. aureus, очень низка в этих экспериментальных условиях (данные не показаны).

Результаты внутриклеточной активности ванкомицина, рифампицина и левофлоксацина в отношении S. aureus показаны на рисунке 1В. Для измерения внутриклеточной активности этих антибиотиков клетки HaCaT инокулировали S. aureus ATCC 29213 при MOI 1 в течение 2 ч. Клетки инкубировали с лизостафином, с антимикробными соединениями или без них, подлежащими тестированию, в течение 24 ч. Далее лизостафин и антимикробные соединения удаляли путем промывки. Клетки были разрушены в буфере лизиса, а бактериальная нагрузка была количественно определена культурой. Средние внутриклеточные нагрузки составляли 4,57, 4,51, 3,03 и 2,91 log CFU/mL для контроля, ванкомицин (50 мкг/мл), рифампицин (7 мкг/мл) и левофлоксацин (10 мкг/мл) соответственно (рисунок 1B).

Figure 1
Рисунок 1: Внутриклеточный золотистый стафилококк в эпителиальных клетках. (A) Анализ защиты ферментов (зеленые полосы) и улучшенный анализ защиты ферментов (красные полосы) в клетках A549, инфицированных S. aureus SF8300 WT и ΔfnbA/B. (B) Внутриклеточная активность антимикробных соединений в клетках HaCaT, инфицированных S. aureusus АТХК 29213. Столбцы представляют средние значения трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Полосы погрешностей представляют стандартные отклонения. p < 0,0001. Сокращения: Ctrl = control; КОЕ = колониеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Описанные здесь анализы ценны для изучения степени интернализации и внутриклеточной выживаемости S. aureus в NPPCs, а также внутриклеточной эффективности антимикробных соединений6,15,16. Некоторые шаги в обоих протоколах анализа могут быть критическими. Состояние здоровья и плотность клеток должны прекрасно контролироваться и согласовываться между независимыми экспериментами. Бактериальный инокулят должен быть тщательно стандартизирован, чтобы получить реальный MOI, близкий к целевому теоретическому MOI. В общем, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не отсоединить ни одну из клеток во время пипетки. Промывки для удаления лизостафина и антибиотиков являются критическими шагами в EPA. Было обнаружено, что использование протеиназы K улучшает этот этап, когда антибиотик не используется (см. Ниже). И последнее, но не менее важное: клетки должны быть полностью отделены в каждой лунке и полностью гомогенизированы после инкубации с буфером лизиса для надежной количественной оценки внутриклеточной нагрузки S. aureus.

В некоторых случаях могут возникнуть проблемы, и сначала необходимо проверить несколько пунктов. В случае отсутствия воспроизводимости следует иметь в виду, что S. aureus может образовывать сгустки, что делает количественную оценку по поглощению неточной. Скопление бактерий может быть увеличено путем центрифугирования и промывки, если культуральная среда должна быть заменена (например, для устранения секретируемого белка). Бактериальную суспензию следует использовать быстро, потому что бактерии продолжают расти при комнатной температуре. Эффективность лизостафина может снижаться из-за неправильных условий хранения, неоптимального рН активности ферментов в питательных средах, изменчивости ферментативной активности между партиями и поставщиками и отсутствия чувствительности к лизостафину некоторых штаммов в специфических условиях роста. Фенол красный может оказывать небольшое бактериостатическое действие, особенно когда культуральная среда относительно бедна питательными веществами по сравнению с типичными бульонами, используемыми для выращивания бактерий. Таким образом, целесообразно использовать среду для культивирования клеток без фенольного красного цвета, что также улучшает флуоресцентные микроскопические наблюдения за счет уменьшения фонового шума.

Хотя этот метод является ценным инструментом для изучения внутриклеточной судьбы различных штаммов, следует учитывать некоторые пределы метода. Использование очень высокого MOI может перегрузить возможности интернализации NFPC и выровнять различия между различными тестируемыми штаммами. Степень интернализации большинства цитотоксических штаммов может быть недооценена, потому что лизостафин (или антибиотики) быстро разрушает S. aureus , который высвобождается поврежденными клетками. Таким образом, эксперименты с увеличенной продолжительностью (т.е. для изучения внутриклеточной выживаемости или внутриклеточной активности антибиотиков) легче установить со штаммами с низкой цитотоксичностью. Поэтому время инкубации и MOI должны быть точно скорректированы в соответствии с вирулентностью штамма, типом клетки и экспериментальной целью.

Метод, описанный здесь с использованием лизостафина, является более надежным, чем методы, основанные на гентамицине, поскольку, в отличие от лизостафина, гентамицин имеет тенденцию усваиваться клетками-хозяевами13. Другим преимуществом является возможность инактивации лизостафина. Ингибирование активности лизостафина было сообщено Kim et al.13 с использованием ЭДТА для хелатирования ионов цинка или 1,10-фенантролина; тем не менее, интенсивные промывки по-прежнему необходимы для удаления фермента перед покрытием бактерий. Здесь протеиназа К обеспечивает быструю инактивацию лизостафина. Мы наблюдали, что клетки имеют тенденцию отделяться от культуральной пластины, когда они сильно заражаются из-за размножения внутриклеточного S. aureus. Пропуская заключительный этап промывки, метод iEPA значительно упростил техническое обращение и позволил восстановить интернализованные бактерии в слабо прилегающих или уже отсоединенных клетках.

Более концентрированные реагенты и буферы, используемые в iEPA, также помогли уменьшить усилия по пипетке и свести к минимуму потерю клеток. Кроме того, iEPA можно использовать с клетками в суспензии, а также с органоидами, которые трудно мыть. В заключение, ферментные защитные анализы позволяют изучать степень интернализации и внутриклеточную судьбу S. aureus, а также внутриклеточную активность противомикробных препаратов с различными моделями in vitro . Улучшения должны быть сделаны, чтобы лучше охарактеризовать взаимосвязь между интернализацией и цитотоксичностью, чтобы лучше оценить важность разработки лекарств, способных достигать S. aureus внутри клетки.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Штаммы S. aureus SF8300 WT и SF8300 ΔfnbA/B были щедро подарены профессором Бинь Дипом (Калифорнийский университет, Сан-Франциско, США). Эта работа была поддержана грантом ассоциации FINOVI (#AO13 FINOVI) под эгидой Фонда Лионского университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

Биология выпуск 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Улучшенный анализ защиты ферментов для изучения интернализации <em>золотистого стафилококка</em> и внутриклеточной эффективности антимикробных соединений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter