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Biology

Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de Staphylococcus aureus y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar el alcance de la internalización de Staphylococcus aureus y su capacidad para sobrevivir dentro de la célula huésped humana, así como la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos.

Abstract

Staphylococcus aureus expresa factores de virulencia para desencadenar su internalización en células eucariotas y para sobrevivir dentro de diferentes compartimentos subcelulares. Este artículo describe un ensayo de protección enzimática para estudiar el alcance de la internalización de S. aureus y su supervivencia intracelular en células fagocíticas no profesionales adherentes (NPCC), así como la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos. Los NPPC se cultivan en una placa de múltiples pocillos hasta que alcanzan el 100% de confluencia. Los cultivos de S. aureus se cultivan durante la noche en medio de cultivo celular. La suspensión bacteriana se diluye de acuerdo con el número de células por pocillo para inocular las células a una multiplicidad controlada de infección. Las células inoculadas se incuban durante 2 h para permitir que las bacterias sean internalizadas por los NPPC, después de lo cual se agrega lisostafina al medio de cultivo para matar selectivamente las bacterias extracelulares. La lisostafina está presente en el medio de cultivo durante el resto del experimento.

En este punto, las células infectadas podrían incubarse con compuestos antimicrobianos para evaluar sus actividades intracelulares contra S. aureus. A continuación, las células se lavan tres veces para eliminar los medicamentos, y la carga intracelular de S. aureus se cuantifica mediante el cultivo en placas de agar. Alternativamente, para estudiar los factores de virulencia estafilocócica involucrados en la supervivencia intracelular y la toxicidad celular, la lisostafina podría inactivarse con proteinasa K para eliminar la necesidad de pasos de lavado. Este consejo mejora la fiabilidad de la cuantificación de la carga bacteriana intracelular, especialmente si las células tienden a desprenderse de la placa de cultivo cuando se infectan gravemente debido a la multiplicación de S. aureus intracelular. Estos protocolos se pueden utilizar con prácticamente todos los tipos de NPPC adherentes y con modelos de cultivo celular 3D como los organoides.

Introduction

Staphylococcus aureus es a la vez un patógeno potencialmente mortal y una bacteria comensal de la piel y la mucosa que coloniza dos mil millones de individuos en todo el mundo1. En los seres humanos, los portadores nasales de S. aureus tienen un mayor riesgo de infección con su propia cepa de transporte; sin embargo, los determinantes multifactoriales del transporte de la mucosa de S. aureus aún no están claros1,2. Además de las infecciones agudas, los pacientes también pueden desarrollar infecciones crónicas por S. aureus que a menudo son difíciles de curar3. Una mejor comprensión de las interacciones huésped-patógeno durante la colonización y la infección es crucial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y mejorar el manejo del paciente.

In vitro, S. aureus puede desencadenar su internalización en células huésped expresando la integrina α5β14. La interacción tripartita entre las proteínas de unión a fibronectina estafilocócicas ancladas a la pared celular de S. aureus, la fibronectina y la integrina β1 expresada en la superficie de la célula huésped es bien conocida como la vía principal de internalización de S. aureus en NPPC como queratinocitos, osteoblastos, fibroblastos y células epiteliales y endoteliales4. Estudios recientes muestran que S. aureus se puede encontrar dentro de las células humanas durante la colonización nasal5,6 y la infección7. Sin embargo, el papel del reservorio intracelular en la patogénesis de la infección por S. aureus sigue sin estar claro. Las células huésped podrían actuar como refugio para S. aureus, que está protegido tanto del sistema inmune8 como de la mayoría de los compuestos antimicrobianos6,9.

El ensayo de protección de lisostafina, descrito por Proctor10 a principios de la década de 1980, permite el estudio de los factores bacterianos y del huésped involucrados en la internalización de los aislados de S. aureus. La lisostafina es una bacteriocina producida por Staphylococcus simulans, que exhibe una potente actividad contra casi todos los aislados de S. aureus, incluidas las cepas resistentes a los antibióticos11. La lisostafina se ha utilizado para destruir sólo S. aureus extracelular para permitir el recuento de sólo bacterias intracelulares viables12. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada y ha contribuido al descubrimiento de varios factores de virulencia de S. aureus. La gentamicina, sola y combinada con lisostafina, también se usa ampliamente para estudiar bacterias intracelulares.

Sin embargo, un estudio reciente mostró que la gentamicina entra en las células eucariotas y llega a las bacterias internalizadas de una manera dependiente del tiempo y la concentración13. Este estudio también demostró que la lisostafina no entra en las células eucariotas, confirmando que un ensayo de protección enzimática (EPA) basado en lisostafina es el ensayo más preciso para cuantificar la carga intracelular de S. aureus mediante cultivo13. Independientemente del compuesto que se use para destruir bacterias extracelulares (por ejemplo, lisostafina o gentamicina), debe eliminarse lavando las células antes de enchapar S. aureus intracelular en placas de agar. Los lavados sucesivos pueden resultar en el desprendimiento de células, especialmente células poco adherentes (por ejemplo, células muy infectadas), lo que conduciría a una subestimación de la carga intracelular de S. aureus . Este artículo describe en detalle cómo se puede utilizar epa para cuantificar la carga intracelular de S. aureus y para medir la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos utilizando un modelo in vitro . Cabe destacar que se ha propuesto un método simple para mejorar la fiabilidad de la cuantificación de la carga intracelular evitando los lavados intensivos.

Protocol

1. Cultivo de células epiteliales humanas

  1. Prepare el medio de cultivo completo con el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de fenol rojo, complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% sin antibióticos.
  2. Cultivar células epiteliales A549 en medio de cultivo completo a 36 ± 1 °C en 5% de CO2. Asegúrese de utilizar un recipiente de cultivo del tamaño adecuado para tener suficientes células para los pasos posteriores (ver paso 1.10).
    NOTA: Un matraz de 75 cm2 (T-75) es suficiente para sembrar dos placas de 24 pocillos y subcultivar las células.
  3. Dos días antes de la infección, prepare una sola placa de 24 pocillos.
  4. Retire y deseche el medio de cultivo gastado del matraz T-75 y lave las células una vez con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  5. Añadir 5 ml de tripsina-EDTA e incubar las células durante 5 min a 36 ± 1 °C en un 5% de CO2.
  6. Agregue 5 ml de medio de cultivo completo y transfiera las células a un tubo.
  7. Centrifugar las células durante 5 min a 300 × g.
  8. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio de cultivo completo fresco.
  9. Cuente las celdas con un contador de celdas automático (o una cámara de conteo).
  10. Diluir las células en medio de cultivo completo para preparar 30 ml de suspensión celular a una concentración de 2,0 × 105 células/ml.
  11. Agregue 1 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, lo que corresponde a una densidad celular de aproximadamente 1.0 × 105 celdas / cm² para un área de pozo de 2 cm².
  12. Incubar las células durante 48 h a 36 ± 1 °C en 5% de CO2 hasta que alcancen el 100% de confluencia.
    NOTA: Además de las condiciones a probar, se deben reservar tres pocillos para el recuento de células el día de la infección (ver paso 3.1.4). De acuerdo con el número de condiciones a probar, se pueden preparar hasta dos placas de 24 pocillos simultáneamente. Los volúmenes indicados en el protocolo deben aumentarse en consecuencia.

2. Cultivo de cepas de S. aureus

  1. Dos días antes de la infección, prepare el medio de infección completo con DMEM glucosa alta sin rojo fenol, complementado con 10% fbS sin antibióticos.
  2. Descongelar las cepas de S. aureus para ser probadas en placas de agar.
  3. Incubar las placas de agar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
  4. El día antes de la inoculación, inocular una colonia de la cepa de S. aureus para ser analizada en 10 ml de medio de infección completo.
  5. Incubar las bacterias durante 18-24 h a 36 ± 1 °C con agitación a 160 rpm. Use tubos de 50 ml mantenidos a 45 ° para evitar que las bacterias se asienten.
    NOTA: Antes de comenzar con una nueva cepa, se recomienda verificar su susceptibilidad a la lisostafina en las mismas condiciones de cultivo que se utilizarán para experimentos posteriores (medios, cargas bacterianas y concentración de lisostapina y tiempo de incubación). También es importante determinar la carga bacteriana correspondiente a un OD600nm de 0.5 porque podría variar ligeramente de una cepa a otra. Las condiciones de cultivo de las cepas bacterianas podrían adaptarse de acuerdo con el objetivo experimental.

3. Ensayo de infección con S. aureus

  1. Determinación de la densidad celular y viabilidad
    1. Retire y deseche el medio de cultivo gastado de los tres pocillos dedicados al conteo de células A549.
    2. Añadir 1 ml de medio de infección completo que contenga 5 μg/ml de Hoechst 33342 y 1 μg/ml de yoduro de propidio.
      NOTA: Hoechst 33342 es un mutágeno conocido y debe manejarse con cuidado. El yoduro de propidio, un mutágeno potencial, debe manipularse con cuidado y eliminarse de manera segura de acuerdo con las regulaciones aplicables.
    3. Incubar las células durante 30 min a 36 ± 1 °C en 5% de CO2.
    4. Cuente el número de células y calcule la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia de campo de empuñadura.
      NOTA: Si no se dispone de un microscopio de fluorescencia, la densidad celular y la viabilidad se pueden calcular con tinción azul tripano mediante el uso de una cámara de recuento de células.
  2. Preparación de la suspensión bacteriana
    1. Dispensar 25 ml de medio de infección completo en un tubo y precalentar a 36 ± 1 °C.
    2. Ajuste la suspensión de S. aureus a anOD600nm de 0.5 en medio de infección completo utilizando un densímetro celular.
    3. Preparar 20 mL de suspensión bacteriana para la inoculación celular diluyendo el 0.5 OD600nm en medio de infección completo para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 1 según el número de células por pocillo.
      NOTA: El MOI corresponde al número de bacterias añadidas por célula en cada pozo. Por ejemplo, para lograr un MOI de 1 con 1.0 × 106 células por pozo, prepare una suspensión bacteriana a 2.0 × 106 UFC/ml para que se puedan agregar 106 UFC en un volumen de 500 μL (ver paso 3.3.3). El MOI se puede ajustar de acuerdo con los tipos de células y las cepas bacterianas que se van a probar.
    4. Utilice un plato en espiral automático para determinar la carga de S. aureus de la suspensión bacteriana diluida que se utilizará para la etapa de inoculación celular.
    5. Incubar las placas de agar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    6. Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular el MOI preciso para cada cepa probada.
      NOTA: Si no hay una placa espiral automática disponible, la carga bacteriana podría determinarse mediante dilución en serie en una placa de agar. Consulte el manual analítico bacteriológico para más detalles14.
  3. Inoculación celular
    1. Observe cada pocillo de la placa de 24 pocillos mediante microscopía de bajo aumento para asegurarse de que las células estén sanas y creciendo como se esperaba.
    2. Retire y deseche el medio de cultivo celular gastado de la placa de 24 pocillos.
    3. Añadir 500 μL de la suspensión bacteriana para la inoculación a cada pocillo con células 100% confluentes.
    4. Incubar las células durante 2 h a 36 ± 1 °C y 5% de CO2.
      NOTA: se recomienda utilizar tres pocillos de la placa para cada condición a probar (triplicado) y realizar al menos tres experimentos independientes. El retraso de la incubación se puede adaptar de acuerdo con el objetivo experimental.
  4. Cuantificación de bacterias intracelulares con ensayo de protección enzimática mejorada (iEPA)
    1. Preparar 7 mL de tampón de lisis 4x con 3.5 mL de Tritón X-100 al 2% en agua estéril y 3.5 mL de tripsina-EDTA.
    2. Preparar una solución madre de lisostafina a 10 mg/ml en tampón de acetato y alícuota 25 μL en crioviales. Conservar a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
    3. Preparar 250 μL de una solución de trabajo de lisostafina fresca a 1 mg/ml mezclando 25 μL de la solución madre de lisostafina (10 mg/ml) y 225 μL de 0,1 M Tris-HCl. Conservar a 4 °C durante un máximo de 48 h.
    4. Preparar 6,25 ml de medio de infección completo suplementado con lisostafina agregando 6 ml de medio de infección completo a 250 μL de la solución de trabajo de lisostafina.
    5. Agregue 250 μL de medio de infección completo suplementado con lisostafina en cada pocillo y agite suavemente la placa girando la placa a mano.
    6. Incubar las células durante 1 h a 36 ± 1 °C en 5% de CO2 para dejar que la lisostafina mate las bacterias extracelulares.
    7. Al final del tiempo de incubación, agregue 10 μL de proteinasa K a 20 mg / ml en cada pozo para inactivar la lisostafina.
    8. Incubar las células durante 2 min a temperatura ambiente.
    9. Agregue 250 μL de tampón de lisis 4x para lisar las células por choque osmótico.
    10. Incubar las células durante 10 min a 36 ± 1 °C.
    11. Mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo diez veces en todo el fondo del pozo para asegurarse de que las células estén completamente lisadas y homogeneizadas.
    12. Utilice un plato en espiral automático para determinar la carga de S. aureus de cada pozo.
    13. Incubar las placas de agar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    14. Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular la carga intracelular de S. aureus de cada pozo.
  5. Medición de la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos con ensayo de protección enzimática (EPA)
    1. Prepare 25 ml de tampón de lisis 1x con 3.125 ml de Tritón X-100 al 2% en agua estéril, 6.25 ml de tripsina-EDTA y 15.625 ml de agua estéril.
    2. Preparar 250 μL de una solución de trabajo de lisostafina fresca a 1 mg/ml mezclando 25 μL de una solución madre de lisostafina (10 mg/ml) y 225 μL de 0,1 M Tris-HCl.
    3. Preparar 25 ml de medio de infección completo suplementado con lisostafina agregando 24,75 ml de medio de infección completo a 250 μL de la solución de trabajo de lisostafina.
    4. Para cada compuesto antimicrobiano que se va a ensayar, preparar 3,1 ml de medio de infección completo suplementado con lisostafina y el compuesto antimicrobiano a la concentración que se va a estudiar.
    5. Retire y deseche el medio de cultivo celular gastado de la placa de 24 pocillos.
    6. Añadir 1 ml de medio de infección completo suplementado con lisostafina.
    7. Incubar las células durante 1 h a 36 ± 1 °C en 5% de CO2 para dejar que la lisostafina mate las bacterias extracelulares.
    8. Retire y deseche el medio suplementado con lisostafina de la placa de 24 pocillos.
    9. Llene tres pocillos con 1 ml de medio suplementado con lisostafina más el compuesto antimicrobiano que se va a probar.
    10. Repita el paso 3.5.9 para cada compuesto antimicrobiano que se vaya a probar.
    11. Para la condición de control, llene tres pocillos con 1 ml de medio suplementado con lisostafina sin ningún compuesto antimicrobiano.
    12. Incubar las células durante 24 h a 36 ± 1 °C en 5% de CO2.
    13. Al final del período de incubación, retire y deseche el medio gastado y lave suavemente cada pozo tres veces con DPBS estériles con CaCl2 y MgCl2.
    14. Agregue 1 ml de tampón de lisis 1x a cada pocillo para separar y lisar las células por choque osmótico.
    15. Incubar las células durante 10 min a 36 ± 1 °C.
    16. Mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo diez veces por todo el pozo para asegurarse de que las células estén completamente lisadas y homogeneizadas.
    17. Utilice un plato en espiral automático para determinar la carga de S. aureus de cada pozo.
    18. Incubar las placas de agar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    19. Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular la carga intracelular de S. aureus de cada pozo.
      NOTA: La actividad intracelular de cada compuesto antimicrobiano debe calcularse de acuerdo con la carga bacteriana de la condición de control. También es importante comprobar la citotoxicidad de todos los compuestos antimicrobianos para demostrar que las diferencias observadas entre el control y los compuestos no se deben a la muerte celular.

Representative Results

Los resultados de la internalización de S. aureus por células epiteliales A549 se representan en la Figura 1A. Las células A549 fueron inoculadas con S. aureus SF8300 WT y SF8300 ΔfnbA/B, que carece de proteínas de unión a fibronectina A y B, a un MOI de 1 durante 2 h. Para destruir S. aureus extracelular, se agregó lisostafina al medio de cultivo y las células se incubaron durante 1 h. A continuación, la lisostafina se eliminó mediante lavado para EPA o se inactivó con proteinasa K para iEPA. Luego, las células se interrumpieron en el tampón de lisis y la carga bacteriana se cuantificó mediante cultivo. Mediante el uso de EPA, las cargas intracelulares medias fueron de 4,46 y 0,49 Log CFU/mL para SF8300 WT y SF8300 ΔfnbA/B, respectivamente (Figura 1A, barras verdes). Utilizando iEPA, las cargas intracelulares medias fueron de 4,53 y 0,56 Log CFU/mL para SF8300 WT y SF8300 ΔfnbA/B, respectivamente (Figura 1A, barras rojas). Es interesante observar que tanto EPA como iEPA mostraron resultados similares, lo que puede explicarse por la facilidad de realizar los lavados cuando las células están en buenas condiciones y porque la citotoxicidad inducida por S. aureus es muy baja en estos entornos experimentales (datos no mostrados).

Los resultados de la actividad intracelular de la vancomicina, la rifampicina y la levofloxacina contra S. aureus se representan en la Figura 1B. Para medir la actividad intracelular de estos antibióticos, las células HaCaT fueron inoculadas con S. aureus ATCC 29213 a un MOI de 1 durante 2 h. Las células se incubaron con lisostafina, con o sin los compuestos antimicrobianos a ensayar, durante 24 h. A continuación, la lisostafina y los compuestos antimicrobianos se eliminaron mediante lavado. Las células se interrumpieron en el tampón de lisis, y la carga bacteriana se cuantificó mediante cultivo. Las cargas intracelulares medias fueron 4,57, 4,51, 3,03 y 2,91 log UFC/ml para el control, vancomicina (50 μg/mL), rifampicina (7 μg/mL) y levofloxacina (10 μg/mL), respectivamente (Figura 1B).

Figure 1
Figura 1: Carga intracelular de Staphylococcus aureus en células epiteliales. (A) Ensayo de protección enzimática (barras verdes) y ensayo de protección enzimática mejorada (barras rojas) en células A549 infectadas con S. aureus SF8300 WT y ΔfnbA/B. (B) Actividad intracelular de compuestos antimicrobianos en células HaCaT infectadas con S. aureus EXPEDIENTE ATCC 29213. Las barras representan los valores medios de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error representan las desviaciones estándar. p < 0,0001. Abreviaturas: Ctrl = control; ufc = unidades formadoras de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los ensayos aquí descritos son valiosos para estudiar el grado de internalización y la supervivencia intracelular de S. aureus en NPCC, así como la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos6,15,16. Algunos pasos en ambos protocolos de ensayo pueden ser críticos. El estado de salud y la densidad de las células deben estar perfectamente controlados y consistentes entre experimentos independientes. El inóculo bacteriano debe estandarizarse cuidadosamente para obtener un MOI real cercano al MOI teórico objetivo. En general, se debe tener cuidado de no separar ninguna de las celdas mientras se pipetea. Los lavados para eliminar la lisostafina y los antibióticos son pasos críticos en la EPA. Se ha encontrado que el uso de la proteinasa K mejora este paso cuando no se usa ningún antibiótico (ver más abajo). Por último, pero no menos importante, las células deben estar completamente separadas en cada pozo y homogeneizadas completamente después de la incubación con el tampón de lisis para cuantificar de manera confiable la carga intracelular de S. aureus.

En algunos casos, se pueden encontrar problemas y primero se deben verificar varios puntos. En caso de falta de reproducibilidad, hay que tener en cuenta que S. aureus puede formar grumos, haciendo inexacta la cuantificación por absorbancia. La aglomeración de bacterias puede aumentar mediante centrifugación y pasos de lavado si se va a reemplazar el medio de cultivo (por ejemplo, para eliminar una proteína secretada). La suspensión bacteriana debe usarse rápidamente porque las bacterias continúan creciendo a temperatura ambiente. La eficacia de la lisostafina podría disminuir debido a condiciones de almacenamiento incorrectas, pH subóptimo para la actividad enzimática en los medios de cultivo, variabilidad en la actividad enzimática entre lotes y proveedores, y falta de sensibilidad a la lisostafina de algunas cepas en condiciones de crecimiento específicas. El rojo fenol podría tener un ligero efecto bacteriostático, especialmente cuando el medio de cultivo es relativamente pobre en nutrientes en comparación con los caldos típicos utilizados para el cultivo de bacterias. Por lo tanto, es recomendable utilizar un medio de cultivo celular sin rojo fenol, que también mejora las observaciones microscópicas de fluorescencia al reducir el ruido de fondo.

Aunque este método es una herramienta valiosa para estudiar el destino intracelular de diferentes cepas, se deben considerar algunos límites del método. El uso de un MOI muy alto puede sobrecargar la capacidad de internalización por parte de los NPPC y nivelar las diferencias entre las diferentes cepas probadas. El grado de internalización de la mayoría de las cepas citotóxicas puede subestimarse porque la lisostafina (o antibióticos) destruye rápidamente S. aureus que es liberado por las células dañadas. Por lo tanto, los experimentos con duraciones prolongadas (es decir, para estudiar la supervivencia intracelular o la actividad intracelular de los antibióticos) son más fáciles de establecer con cepas con baja citotoxicidad. Por lo tanto, el tiempo de incubación y el MOI deben ajustarse con precisión de acuerdo con la virulencia de la cepa, el tipo de célula y el objetivo experimental.

El método aquí descrito con el uso de lisostafina es más fiable que los basados en gentamicina porque, a diferencia de la lisostafina, la gentamicina tiende a ser internalizada por las células huésped13. La otra ventaja es la posibilidad de inactivar la lisostafina. La inhibición de la actividad de la lisostafina fue reportada por Kim et al.13 con el uso de EDTA para quelar iones de zinc o 1,10-fenantrolina; sin embargo, todavía se requieren lavados intensivos para eliminar la enzima antes de enchapar las bacterias. Aquí, la proteinasa K permite una rápida inactivación de la lisostafina. Observamos que las células tienden a desprenderse de la placa de cultivo cuando se infectan en gran medida debido a la multiplicación de S. aureus intracelular. Al omitir el paso de lavado final, el método iEPA simplificó en gran medida el manejo técnico y permitió la recuperación de las bacterias internalizadas en células poco adherentes o ya desprendidas.

Los reactivos y tampones más concentrados utilizados en iEPA también ayudaron a reducir el esfuerzo de pipeteo y minimizar la pérdida de células. Además, iEPA se puede utilizar con células en suspensión, así como con organoides que son difíciles de lavar. En conclusión, los ensayos de protección enzimática permiten estudiar el grado de internalización y el destino intracelular de S. aureus, así como la actividad intracelular de fármacos antimicrobianos con diferentes modelos in vitro . Se deben hacer mejoras para caracterizar mejor la relación entre internalización y citotoxicidad para apreciar mejor la importancia de desarrollar fármacos capaces de llegar a S. aureus dentro de la célula.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Las cepas S. aureus SF8300 WT y SF8300 ΔfnbA/B fueron generosamente regaladas por el Prof. Binh Diep (Universidad de California, San Francisco, EE.UU.). Este trabajo fue apoyado por una subvención de la asociación FINOVI (#AO13 FINOVI) bajo los auspicios de la Fundación para la Universidad de Lyon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Número 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de <em>Staphylococcus aureus</em> y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos
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Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

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