Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Förbättrad enzymskyddsanalys för att studera Staphylococcus aureus Internalisering och intracellulär effekt av antimikrobiella föreningar

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll syftar till att beskriva hur man studerar omfattningen av Staphylococcus aureus internalisering och dess förmåga att överleva inuti den mänskliga värdcellen, liksom den intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar.

Abstract

Staphylococcus aureus uttrycker virulensfaktorer för att utlösa dess internalisering i eukaryoteceller och för att överleva inuti olika subcellulära fack. Detta dokument beskriver en enzym skydd analys för att studera omfattningen av S. aureus internalisering och dess intracellulära överlevnad i vidhäftande icke-professionella fagocytic celler (NPPCs) samt intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar. NPPCs odlas i en multi-well plate tills de når 100% sammanflöde. S. aureuskulturer odlas över en natt i cellodlingsmedium. Bakteriesuspensionen späds ut enligt antalet celler per brunn för att inokulera cellerna vid en kontrollerad multiplicitet av infektion. Inokulerade celler inkuberas i 2 timmar för att bakterierna ska kunna internaliseras av NPPCs, varefter lysostaphin tillsätts till odlingsmediet för att selektivt döda extracellulära bakterier. Lysostaphin finns i odlingsmediet för resten av experimentet.

Vid denna tidpunkt kan de infekterade cellerna inkuberas med antimikrobiella föreningar för att bedöma deras intracellulära aktiviteter mot S. aureus. Därefter tvättas cellerna tre gånger för att ta bort drogerna, och intracellulär S. aureusbelastning kvantifieras sedan genom odling på agarplattor. Alternativt, för att studera stafylokock virulensfaktorer som är involverade i intracellulär överlevnad och celltoxicitet, lysostaphin kan inaktiveras med proteinas K för att eliminera behovet av tvätt steg. Detta tips förbättrar tillförlitligheten hos intracellulär bakteriell belastning kvantifiering, särskilt om celler tenderar att lossna från odlingsplattan när de blir kraftigt infekterade på grund av multiplikation av intracellulära S. aureus. Dessa protokoll kan användas med praktiskt taget alla typer av vidhäftande NPPCs och med 3D-cellkulturmodeller som organoider.

Introduction

Staphylococcus aureus är både en livshotande patogen och en kommensal bakterie av huden och slemhinnan som koloniserar två miljarder individer runt om i världen1. Hos människor har nasala bärare av S. aureus en ökad risk för infektion med sin egen stam av transport; De multifaktoriella bestämningsfaktorerna för S. aureus mucosal carriage är dock fortfarande oklara1,2. Förutom akuta infektioner kan patienter också utveckla kroniska S. aureusinfektioner som ofta är utmanande att bota3. En bättre förståelse för värd-patogen interaktioner under kolonisering och infektion är avgörande för att utveckla nya terapeutiska strategier och förbättra patienthantering.

In vitro kan S. aureus utlösa dess internalisering i värdceller som uttrycker α5β1 integrin4. Trepartsinteraktion mellan stafylokockfiboccal fibronectin-bindande proteiner förankrade i cellväggen av S. aureus, fibronektin och β1 integrin uttryckt på värdcellens yta är välkänd som den viktigaste vägen för S. aureus internalisering i NPPCs såsom keratinocyter, osteoblaster, fibroblaster och epitelial och endotel celler4. Nyligen genomförda studier visar att S. aureus kan hittas inuti mänskliga celler under nasal kolonisering5,6 och infektion7. Rollen av intracellulära reservoaren i patogenesen vid S. aureus infektion är dock oklart. Värdcellerna kan fungera som ett skydd för S. aureus, som är skyddad från både immunsystemet8 och de flesta antimikrobiella föreningar6,9.

Lysostaphin skyddsanalysen, som beskrevs av Proctor10 tidigare på 1980-talet, möjliggör studier av bakteriella och värdfaktorer involverade i internaliseringen av S. aureus isolat. Lysostaphin är en bakteriin som produceras av Staphylococcus simulaner, som uppvisar potent aktivitet mot nästan alla S. aureus isolat, inklusive antibiotikaresistenta stammar11. Lysostaphin har använts för att förstöra endast extracellulärA S. aureus för att möjliggöra räkning av endast livskraftiga intracellulära bakterier12. Denna teknik har använts i stor utsträckning och har bidragit till upptäckten av flera virulensfaktorer av S. aureus. Gentamycin, ensam och kombinerad med lysostaphin, används också ofta för att studera intracellulära bakterier.

En ny studie visade dock att gentamycin kommer in i eukaryota celler och når internaliserade bakterier på ett tids- och koncentrationsberoende sätt13. Denna studie visade också att lysostaphin inte kommer in i eukaryota celler, vilket bekräftar att en lysostaphinbaserad enzymskyddsanalys (EPA) är den mest exakta analysen för kvantifiering av intracellulär S. aureus belastning av kultur13. Oavsett vilken förening som används för att förstöra extracellulära bakterier (t.ex. lysostaphin eller gentamycin) ska den avlägsnas genom att cellerna tvättas innan de pläterar intracellulärA S. aureus på agarplattor. Successiva tvättar kan leda till att celler, särskilt dåligt vidhäftande celler (t.ex. kraftigt infekterade celler), vilket skulle leda till en underskattning av den intracellulära S. aureusbelastningen . Detta dokument beskriver i detalj hur EPA kan användas för att kvantifiera intracellulära S. aureus belastning och för att mäta intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar föreningar med hjälp av en in vitro-modell . Observera att en enkel metod har föreslagits för att förbättra tillförlitligheten hos intracellulär belastning kvantifiering genom att undvika intensiva tvättar.

Protocol

1. Kultur av mänskliga epitelceller

  1. Förbered komplett odlingsmedium med Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) hög glukos med fenolrött, kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS) utan antibiotika.
  2. Odla A549 epitelceller i komplett odlingsmedium vid 36 ± 1 °C i 5% CO2. Se till att ett odlingskärl av lämplig storlek används för att ha tillräckligt med celler för efterföljande steg (se steg 1.10).
    OBS: En 75 cm2 (T-75) kolv är tillräcklig för att så två 24-brunnsplattor och subkultura cellerna.
  3. Två dagar före infektion, förbered en enda 24-brunnsplatta.
  4. Ta bort och kassera det använda odlingsmediet från T-75-kolven och tvätta cellerna en gång med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
  5. Tillsätt 5 ml trypsin-EDTA och inkubera cellerna i 5 min vid 36 ± 1 °C i 5% CO2.
  6. Tillsätt 5 ml komplett odlingsmedium och överför cellerna till ett rör.
  7. Centrifugera cellerna i 5 min vid 300 × g.
  8. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 10 ml färskt komplett odlingsmedium.
  9. Räkna cellerna med en automatisk cellräknare (eller en räknekammare).
  10. Späd cellerna i fullständigt odlingsmedium för att förbereda 30 ml cell suspension vid en koncentration av 2,0 × 105 celler/ml.
  11. Tillsätt 1 ml cellfjädring till varje brunn på en 24-välplatta, vilket motsvarar en celltäthet på cirka 1,0 × 105 cell/ cm² för ett brunnsområde på 2 cm².
  12. Inkubera cellerna i 48 timmar vid 36 ± 1 °C i 5% CO2 tills de når 100% sammanflöde.
    OBS: Utöver de villkor som ska testas bör tre brunnar reserveras för cellräkning på infektionsdagen (se steg 3.1.4). Enligt antalet villkor som ska testas kan upp till två 24-brunnsplattor beredas samtidigt. De volymer som anges i protokollet bör ökas i enlighet med detta.

2. Kultur av S. aureus stammar

  1. Två dagar före infektion, förbereda komplett infektion medium med DMEM hög glukos utan fenol röd, kompletterad med 10% FBS utan antibiotika.
  2. Tina S. aureusstammar som ska testas på agarplattor.
  3. Inkubera agarplattorna i 18-24 timmar vid 36 ± 1 °C.
  4. Dagen före inokulering, inokulera en koloni av S. aureus stam som ska testas i 10 ml fullständig infektion medium.
  5. Inkubera bakterierna i 18-24 timmar vid 36 ± 1 °C med skakningar vid 160 varv/min. Använd 50 ml rör som hålls vid 45° för att undvika att bakterierna sätter sig.
    OBS: Innan du börjar med en ny stam rekommenderas att kontrollera dess lysostaphin mottaglighet i samma odlingsförhållanden som kommer att användas för ytterligare experiment (media, bakteriella belastningar och lysostaphinkoncentration och inkubationstid). Det är också viktigt att bestämma bakteriebelastningen som motsvarar en OD600nm på 0,5 eftersom den kan variera något från en stam till en annan. Odlingsförhållandena för bakteriestammar skulle kunna anpassas efter det experimentella syftet.

3. Infektionsanalys med S. aureus

  1. Bestämning av celltäthet och livskraft
    1. Ta bort och kassera det använda odlingsmediet från de tre brunnarna avsedda att räkna A549-celler.
    2. Tillsätt 1 ml komplett infektionsmedium som innehåller 5 μg/ml Hoechst 33342 och 1 μg/ml propidiumjodid.
      OBS: Hoechst 33342 är en känd mutagen och bör hanteras varsamt. Propidiumjodid, en potentiell mutagen, måste hanteras varsamt och kasseras på ett säkert sätt enligt gällande föreskrifter.
    3. Inkubera cellerna i 30 min vid 36 ± 1 °C i 5% CO2.
    4. Räkna cellnumret och beräkna cellens livskraft med hjälp av ett fluorescensmikroskop med hjälp av ett fluorescensmikroskop med hjälp av ett fluorescensmikroskop med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
      OBS: Om ett fluorescensmikroskop inte är tillgängligt kan celltätheten och livskraften beräknas med trypanblå färgning med hjälp av en cellräkningskammare.
  2. Beredning av bakteriesuspensionen
    1. Dispensera 25 ml komplett infektionsmedium i ett rör och förvärmt vid 36 ± 1 °C.
    2. Justera S. aureus suspension till anOD600nm på 0,5 i komplett infektionsmedium med hjälp av en celldensitetsmätare.
    3. Förbered 20 ml bakteriell suspension för cellinokulering genom att späda ut 0, 5 OD600nm i fullständigt infektionsmedium för att uppnå en multiplicitet av infektion (MOI) på 1 beroende på antalet celler per brunn.
      OBS: MOI motsvarar antalet bakterier som tillsätts per cell i varje brunn. Till exempel, för att uppnå en MOI på 1 med 1,0 × 106 celler per brunn, förbered en bakterie suspension vid 2,0 × 106 CFU / ml så att 106 CFU kan läggas till i en volym av 500 μL (se steg 3.3.3). MOI kan justeras efter de celltyper och bakteriestammar som ska testas.
    4. Använd en automatisk spiralplämma för att bestämma S. aureusbelastningen av den utspädda bakteriesläddan som ska användas för cellinokuleringssteget.
    5. Inkubera agarplattorna i 18-24 timmar vid 36 ± 1 °C.
    6. Nästa dag räknar du antalet kolonier med en koloniräknare för att beräkna den exakta MOI för varje testad stam.
      OBS: Om det inte finns någon automatisk spiralplätering kan bakteriebelastningen bestämmas genom seriell utspädning på en agarplatta. Se den bakteriologiska analyshandboken för detaljer14.
  3. Cellinokulering
    1. Observera varje brunn på 24-brunnsplattan genom mikroskopi med låg förstoring för att säkerställa att cellerna är friska och växer som förväntat.
    2. Ta bort och kassera det använda cellodlingsmediet från 24-brunnsplattan.
    3. Tillsätt 500 μL av bakteriesuspensionen för inokulering till varje brunn med 100% sammanflödesceller.
    4. Inkubera cellerna i 2 timmar vid 36 ± 1 °C och 5% CO2.
      OBS: Det rekommenderas att använda tre brunnar på plattan för varje tillstånd som ska testas (tre exemplar) och att utföra minst tre oberoende experiment. Inkubationsfördröjningen kan anpassas efter försöksmålet.
  4. Kvantifiering av intracellulära bakterier med förbättrad enzymskyddsanalys (iEPA)
    1. Förbered 7 ml 4x lysbuffert med 3,5 ml 2% Triton X-100 i sterilt vatten och 3,5 ml trypsin-EDTA.
    2. Förbered en lysostaphinbuljonglösning vid 10 mg/ml i acetatbuffert och alikvot 25 μL i kryovialer. Förvara vid -80 °C i upp till 6 månader.
    3. Förbered 250 μL av en färsk lysostapinarbetslösning vid 1 mg/ml genom att blanda 25 μL av lysostaphinbuljonglösningen (10 mg/ml) och 225 μL 0,1 M Tris-HCl. Förvara vid 4 °C i upp till 48 timmar.
    4. Förbered 6,25 ml komplett infektionsmedium kompletterat med lysostaphin genom att tillsätta 6 ml komplett infektionsmedium till 250 μL av lysostaphinarbetslösningen.
    5. Tillsätt 250 μL komplett infektionsmedium kompletterat med lysostapin i varje brunn och rör försiktigt plattan genom att svänga plattan för hand.
    6. Inkubera cellerna i 1 h vid 36 ± 1 °C i 5% CO2 för att låta lysostaphin döda de extracellulära bakterierna.
    7. Tillsätt 10 μL proteinas K vid 20 mg/ml i varje brunn vid inkubationstiden för att inaktivera lysostapin.
    8. Inkubera cellerna i 2 min vid rumstemperatur.
    9. Tillsätt 250 μL 4x lysbuffert för att lysera cellerna genom osmotisk chock.
    10. Inkubera cellerna i 10 min vid 36 ± 1 °C.
    11. Blanda noggrant genom pipettering upp och ner tio gånger över hela botten av brunnen för att säkerställa att cellerna är helt lysade och homogeniserade.
    12. Använd en automatisk spiralplämma för att bestämma S. aureusbelastningen för varje brunn.
    13. Inkubera agarplattorna i 18-24 timmar vid 36 ± 1 °C.
    14. Nästa dag, räkna antalet kolonier med en koloniräknare för att beräkna den intracellulära S. aureusbelastningen för varje brunn.
  5. Mätning av intracellulär effekt av antimikrobiella föreningar med enzymskyddsanalys (EPA)
    1. Förbered 25 ml 1x lysbuffert med 3,125 ml 2% Triton X-100 i sterilt vatten, 6,25 ml trypsin-EDTA och 15,625 ml sterilt vatten.
    2. Förbered 250 μL av en färsk lysostaphinarbetslösning vid 1 mg/ml genom att blanda 25 μL av en lysostaphinbuljonglösning (10 mg/ml) och 225 μL 0,1 M Tris-HCl.
    3. Förbered 25 ml komplett infektionsmedium kompletterat med lysaphin genom att tillsätta 24,75 ml komplett infektionsmedel till 250 μL av lysostaphin arbetslösningen.
    4. För varje antimikrobiell förening som ska testas, bered 3, 1 ml komplett infektionsmedium kompletterat med lysostapin och den antimikrobiella föreningen vid den koncentration som ska studeras.
    5. Ta bort och kassera det använda cellodlingsmediet från 24-brunnsplattan.
    6. Tillsätt 1 ml komplett infektion medium kompletterat med lysostaphin.
    7. Inkubera cellerna i 1 h vid 36 ± 1 °C i 5% CO2 för att låta lysostaphin döda de extracellulära bakterierna.
    8. Ta bort och kassera mediet kompletterat med lysostaphin från 24-brunnsplattan.
    9. Fyll tre brunnar med 1 ml medium kompletterat med lysostaphin plus den antimikrobiella förening som ska testas.
    10. Upprepa steg 3.5.9 för varje antimikrobiell förening som ska testas.
    11. För kontroll villkor, fyll tre brunnar med 1 ml medium kompletterat med lysostaphin utan någon antimikrobiell förening.
    12. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 36 ± 1 °C i 5% CO2.
    13. I slutet av inkubationstiden, ta bort och kassera det förbrukade mediet och tvätta försiktigt varje brunn tre gånger med steril DPBS med CaCl2 och MgCl2.
    14. Tillsätt 1 ml 1x lysbuffert till varje brunn för att lossa och lysa cellerna genom osmotisk chock.
    15. Inkubera cellerna i 10 min vid 36 ± 1 °C.
    16. Blanda noggrant genom pipettering upp och ner tio gånger över hela brunnen för att säkerställa att cellerna är helt lysda och homogeniserade.
    17. Använd en automatisk spiralplämma för att bestämma S. aureusbelastningen för varje brunn.
    18. Inkubera agarplattorna i 18-24 timmar vid 36 ± 1 °C.
    19. Nästa dag, räkna antalet kolonier med en koloniräknare för att beräkna den intracellulära S. aureusbelastningen för varje brunn.
      OBS: Den intracellulära aktiviteten hos varje antimikrobiell förening bör beräknas enligt kontrolltillståndets bakteriebelastning. Det är också viktigt att kontrollera cytotoxiciteten hos alla antimikrobiella föreningar för att bevisa att de skillnader som observerats mellan kontrollen och föreningarna inte beror på celldöd.

Representative Results

Resultaten av S. aureus internalisering av A549 epitelial celler visas i figur 1A. A549 celler var inokuleras med S. aureus SF8300 WT och SF8300 ΔfnbA/B, som saknar fibronectin-bindande proteiner A och B, vid en MOI på 1 för 2 h. För att förstöra extracellulära S. aureus, lades lysostaphin till odlingsmediet, och cellerna inkuberades i 1 h. Därefter avlägsnades lysostaphin antingen genom tvättning för EPA eller inaktiverades med proteinas K för iEPA. Sedan stördes cellerna i lysbufferten, och bakteriebelastningen kvantifierades av kultur. Genom att använda EPA var de genomsnittliga intracellulära belastningarna 4,46 respektive 0,49 Log CFU/mL för SF8300 WT respektive SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, gröna staplar). Med hjälp av iEPA var de genomsnittliga intracellulära belastningarna 4,53 respektive 0,56 Log CFU/mL för SF8300 WT respektive SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, röda staplar). Det är intressant att notera att både EPA och iEPA visade liknande resultat, vilket kan förklaras av hur lätt det är att utföra tvättarna när cellerna är i gott skick och eftersom den S. aureus-inducerade cytotoxiciteten är mycket låg i dessa experimentella inställningar (data visas inte).

Resultaten av intracellulära aktiviteten av vankomycin, rifampicin och levofloxacin mot S. aureus visas i figur 1B. För att mäta den intracellulära aktiviteten hos dessa antibiotika, HaCaT celler vaccinerades med S. aureus ATCC 29213 vid en MOI på 1 för 2 h. Cellerna inkuberades med lysostaphin, med eller utan de antimikrobiella föreningar som skulle testas, i 24 timmar. Därefter avlägsnades lysostaphin och de antimikrobiella föreningarna genom tvätt. Cellerna stördes i lysbufferten och bakteriebelastningen kvantifierades av kulturen. De genomsnittliga intracellulära belastningarna var 4,57, 4,51, 3,03 och 2,91 stock CFU/mL för kontroll, vankomycin (50 μg/mL), rifampicin (7 μg/mL) respektive levofloxacin (10 μg/mL).

Figure 1
Figur 1: Intracellulär Staphylococcus aureusbelastning i epitelceller. (A) Enzymskyddsanalys (gröna staplar) och förbättrad enzymskyddsanalys (röda stänger) i A549-celler infekterade med S. aureus SF8300 WT och ΔfnbA/B. (B) Intracellulär aktivitet hos antimikrobiella föreningar i HaCaT-celler infekterade med S. aureus ATCC 29213. Staplar representerar medelvärdena för tre oberoende experiment som utförs i tre exemplar. Felstaplar representerar standardavvikelserna. p < 0,0001. Förkortningar: Ctrl = kontroll; cfu = kolonibildande enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

De analyser som beskrivs här är värdefulla för att studera omfattningen av internalisering och intracellulär överlevnad av S. aureus i NPPCs, liksom den intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar6,15,16. Vissa steg i båda analysprotokollen kan vara kritiska. Cellernas hälsotillstånd och densitet måste vara perfekt kontrollerade och konsekventa mellan oberoende experiment. Bakteriell inokulat måste noggrant standardiseras för att få en riktig MOI nära den riktade teoretiska MOI. I allmänhet måste man vara försiktig så att ingen av cellerna lossnar under pipettering. Tvättar för att ta bort lysostaphin och antibiotika är kritiska steg i EPA. Användningen av proteinas K har visat sig förbättra detta steg när inget antibiotikum används (se nedan). Sist men inte minst bör cellerna vara helt fristående i varje brunn och noggrant homogeniseras efter inkubationen med lysbufferten för att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera S. aureus intracellulär belastning.

I vissa fall kan problem uppstå och flera punkter måste kontrolleras först. Vid brist på reproducerbarhet måste man komma ihåg att S. aureus kan bilda klumpar, vilket gör kvantifiering genom absorbans felaktig. Klumpar av bakterier kan ökas genom centrifugering och tvättsteg om odlingsmediet ska bytas ut (t.ex. för att eliminera ett utsöndrat protein). Bakteriesuspensionen bör användas snabbt eftersom bakterier fortsätter att växa i rumstemperatur. Lysostaphin effekt kan minska på grund av felaktiga lagringsförhållanden, suboptimala pH för enzym aktivitet i odlingsmediet, variabilitet i enzymatisk aktivitet mellan partier och leverantörer och brist på lysostaphin känslighet av vissa stammar i specifika tillväxtförhållanden. Fenolrött kan ha en liten bakteriostatisk effekt, särskilt när odlingsmediet är relativt dåligt i näringsämnen jämfört med de typiska buljonger som används för odling av bakterier. Således är det lämpligt att använda ett cellodlingsmedium utan fenolrött, vilket också förbättrar fluorescens mikroskopiska observationer genom att minska bakgrundsljudet.

Även om denna metod är ett värdefullt verktyg för att studera det intracellulära ödet för olika stammar, bör vissa gränser för metoden övervägas. Användningen av en mycket hög MOI kan överbelasta förmågan till internalisering av NPPCs och utjämna skillnaderna mellan de olika stammar som testas. Omfattningen av internalisering av de mest cytotoxiska stammarna kan underskattas eftersom lysostaphin (eller antibiotika) snabbt förstör S. aureus som frigörs av skadade celler. Således är experiment med förlängd varaktighet (dvs. att studera intracellulär överlevnad eller intracellulär aktivitet av antibiotika) lättare att sätta upp med stammar med låg cytotoxicitet. Därför bör inkubationstiden och MOI justeras noggrant efter stammen virulens, celltyp och experimentellt syfte.

Metoden som beskrivs här med användning av lysostaphin är mer tillförlitlig än de som är baserade på gentamicin eftersom gentamicin, till skillnad från lysostaphin, tenderar att internaliseras av värdceller13. Den andra fördelen är möjligheten att inaktivera lysostaphin. Hämning av lysostaphin aktivitet rapporterades av Kim et al.13 med användning av EDTA för att kelatera zinkjoner eller 1,10-fenantropolin; Intensiva tvättar krävs dock fortfarande för att avlägsna enzymet före plätering av bakterierna. Här möjliggör proteinas K snabb inaktivering av lysostaphin. Vi observerade att celler tenderar att lossna från kulturplattan när de blir kraftigt smittade på grund av multiplikation av intracellulära S. aureus. Genom att hoppa över det sista tvättsteget förenklade iEPA-metoden den tekniska hanteringen avsevärt och möjliggjorde återvinning av de internaliserade bakterierna i löst vidhäftande eller redan fristående celler.

De mer koncentrerade reagenserna och buffertarna som används i iEPA bidrog också till att minska pipetteringsinsatsen och minimera förlusten av celler. Dessutom kan iEPA användas med celler i suspension, liksom med organoider som är svåra att tvätta. Sammanfattningsvis möjliggör enzymskyddsanalyser studien av internaliseringens omfattning och S. aureus intracellulära öde, liksom intracellulär aktivitet av antimikrobiella läkemedel med olika in vitro-modeller . Förbättringar bör göras för att bättre karakterisera förhållandet mellan internalisering och cytotoxicitet för att bättre förstå vikten av att utveckla läkemedel som kan nå S. aureus inuti cellen.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

S. aureus stammar SF8300 WT och SF8300 ΔfnbA/B var generöst begåvade av Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Detta arbete stöddes av ett bidrag från FINOVI-föreningen (#AO13 FINOVI) under ledning av stiftelsen för universitetet i Lyon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

Biologi nummer 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Förbättrad enzymskyddsanalys för att studera <em>Staphylococcus aureus</em> Internalisering och intracellulär effekt av antimikrobiella föreningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter