Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedret enzymbeskyttelsesanalyse til undersøgelse af Staphylococcus aureus internalisering og intracellulær effekt af antimikrobielle forbindelser

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol har til formål at beskrive, hvordan man studerer omfanget af Staphylococcus aureus internalisering og dens evne til at overleve inde i den menneskelige værtscelle, samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser.

Abstract

Staphylococcus aureus udtrykker virulensfaktorer for at udløse dens internalisering i eukaryoteceller og for at overleve inde i forskellige subcellulære rum. Dette papir beskriver en enzymbeskyttelsesanalyse for at studere omfanget af S. aureus internalisering og dens intracellulære overlevelse i klæbende ikke-professionelle fagocytiske celler (NPPCs) samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser. NPPCs dyrkes i en multi-brønd plade, indtil de når 100% sammenløb. S. aureus kulturer dyrkes natten over i cellekultur medium. Bakterieopsengedningen fortyndes i henhold til antallet af celler pr. brønd for at vaccinere cellerne ved en kontrolleret mangfoldighed af infektion. Podede celler inkuberes i 2 timer for at gøre det muligt at internalisere bakterierne af NPPC'erne, hvorefter lysostaphin tilsættes kulturmediet for selektivt at dræbe ekstracellulære bakterier. Lysostaphin er til stede i kulturmediet for resten af eksperimentet.

På dette tidspunkt kunne de inficerede celler inkuberes med antimikrobielle forbindelser for at vurdere deres intracellulære aktiviteter mod S. aureus. Dernæst vaskes cellerne tre gange for at fjerne stofferne, og intracellulær S. aureusbelastning kvantificeres derefter ved dyrkning på agarplader. Alternativt, for at studere stafylokok virulens faktorer, der er involveret i intracellulær overlevelse og celletoksicitet, lysostaphin kunne inaktiveres med proteinase K for at fjerne behovet for vasketrin. Dette tip forbedrer pålideligheden af den intracellulære bakteriebelastning kvantificering, især hvis celler har tendens til at løsne sig fra kulturpladen, når de bliver stærkt inficeret på grund af multiplikationen af intracellulær S. aureus. Disse protokoller kan bruges med stort set alle typer af klæbende NPPCs og med 3D-cellekultur modeller såsom organoider.

Introduction

Staphylococcus aureus er både et livstruende patogen og en commensal bakterie i huden og slimhinden, der koloniserer to milliarder individer rundt om i verden1. Hos mennesker har næsebærere af S. aureus en øget risiko for infektion med deres egen transportstamme; De multifaktoriske determinanter for S. aureus slimhindevogn er dog stadig uklare1,2. Ud over akutte infektioner, patienter kan også udvikle kroniske S. aureus infektioner, der ofte udfordrende at helbrede3. En bedre forståelse af værtspatogeninteraktioner under kolonisering og infektion er afgørende for at udvikle nye terapeutiske strategier og forbedre patientstyringen.

In vitro, S. aureus kan udløse sin internalisering i værtsceller, der udtrykker α5β1 integrin4. Trepartsinteraktionen mellem de stafylokok-fibrøstoktinbindende proteiner, der er forankret i cellevæggen af S. aureus, fibronectinen og β1-integrin udtrykt ved værtscelleoverfladen, er velkendt som hovedvejen for S. aureus internalisering i NPPCs såsom keratinocytter, osteoblaster, fibroblaster og epitelale og endotelceller4. Nylige undersøgelser viser, at S. aureus kan findes inde i menneskelige celler under nasal kolonisering5,6 og infektion7. Det intracellulære reservoirs rolle i patogenesen af S. aureus-infektion er dog fortsat uklar. Værtscellerne kunne fungere som et husly for S. aureus, som er beskyttet mod både immunsystemet8 og de fleste antimikrobielle forbindelser6,9.

Lysostaphin beskyttelse assay, beskrevet af Proctor10 tidligere i 1980'erne, gør det muligt at studere bakterielle og værtsfaktorer involveret i internalisering af S. aureus isolater. Lysostaphin er en bakteriedræbende produceret af Staphylococcus simulans, som udviser potent aktivitet mod næsten alle S. aureus isolater, herunder antibiotikaresistente stammer11. Lysostaphin er blevet brugt til kun at ødelægge ekstracellulære S. aureus at gøre det muligt at tælle kun levedygtige intracellulære bakterier12. Denne teknik har været meget udbredt og har bidraget til opdagelsen af flere virulens faktorer af S. aureus. Gentamycin, alene og kombineret med lysostaphin, er også meget udbredt til at studere intracellulære bakterier.

Men, en nylig undersøgelse viste, at gentamycin kommer ind eukaryote celler og når internaliserede bakterier i en tid- og koncentration-afhængige måde13. Denne undersøgelse viste også, at lysostaphin ikke kommer ind i eukaryote celler, bekræfter, at en lysostaphin-baseret enzymbeskyttelse assay (EPA) er den mest præcise analyse til kvantificering intracellulære S. aureus belastning af kultur13. Uanset hvilken forbindelse der anvendes til at ødelægge ekstracellulære bakterier (f.eks. lysostaphin eller gentamycin), skal det fjernes ved at vaske cellerne, før de plating intracellulære S. aureus på agarplader. Successive vasker kan resultere i løsrivelse af celler, især dårligt klæbende celler (f.eks stærkt inficerede celler), hvilket ville føre til en undervurdering af den intracellulære S. aureus belastning. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan EPA kan bruges til at kvantificere den intracellulære S. aureus belastning og til at måle den intracellulære effekt af antimikrobielle stoffer ved hjælp af en in vitro-model . Bemærk, at der er foreslået en simpel metode til at forbedre pålideligheden af intracellulære belastningskvantificeringer ved at undgå intensive vaske.

Protocol

1. Kultur af menneskelige epitelceller

  1. Forbered komplet kulturmedium med Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) høj glukose med phenolrød, suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS) uden antibiotika.
  2. Dyrk A549 epitelceller i komplet kulturmedium ved 36 ± 1 °C i 5% CO2. Sørg for, at der anvendes et kulturbeholder i passende størrelse til at have nok celler til efterfølgende trin (se trin 1.10).
    BEMÆRK: En 75 cm2 (T-75) kolbe er tilstrækkelig til at så to 24-brønds plader og subkultur cellerne.
  3. To dage før infektion, forberede en enkelt 24-brønd plade.
  4. Fjern og kassér det brugte kulturmedium fra T-75-kolben, og vask cellerne én gang med 10 mL Dulbeccos fosfatbuffered saltvand (DPBS).
  5. Der tilsættes 5 mL trypsin-EDTA, og cellerne inkuberes i 5 min ved 36 ± 1 °C i 5 % CO2.
  6. Tilsæt 5 mL komplet kulturmedium og overfør cellerne til et rør.
  7. Centrifugere cellerne i 5 min ved 300 × g.
  8. Kassér supernatanten og genbrug cellerne i 10 mL frisk komplet kulturmedium.
  9. Tæl cellerne med en automatisk celletæller (eller et tællekammer).
  10. Fortynd cellerne i komplet kulturmedium for at forberede 30 mL celleaffjedring i en koncentration på 2,0 × 105 celler/mL.
  11. Tilsæt 1 mL af celleaffjedringen til hver brønd af en 24-brønds plade, hvilket svarer til en celletæthed på ca. 1,0 × 105 celle / cm² for et brøndareal på 2 cm².
  12. Inkuberes cellerne i 48 timer ved 36 ± 1 °C i 5% CO2 , indtil de når 100% sammenløb.
    BEMÆRK: Ud over de betingelser, der skal testes, bør der reserveres tre brønde til celletælling på infektionsdagen (se trin 3.1.4). I henhold til antallet af betingelser, der skal testes, kan op til to 24-brønds plader fremstilles samtidigt. De mængder, der er angivet i protokollen, bør forhøjes i overensstemmelse hermed.

2. Kultur af S. aureus stammer

  1. To dage før infektion, forberede komplet infektion medium med DMEM høj glukose uden phenol rød, suppleret med 10% FBS uden antibiotika.
  2. Optø S. aureus stammer, der skal testes på agar plader.
  3. Agarpladerne inkuberes i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
  4. Dagen før podning, vaccinere en koloni af S. aureus stamme, der skal testes i 10 mL af komplet infektion medium.
  5. Inkuberes bakterierne i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C med rysten ved 160 omdrejninger. Brug 50 mL rør holdt på 45 ° for at undgå bakterier afregning.
    BEMÆRK: Før du starter med en ny stamme, anbefales det at kontrollere dens lysostaphin modtagelighed under de samme kulturbetingelser, der vil blive brugt til yderligere eksperimenter (medier, bakteriebelastninger og lysostaphin koncentration og inkubationstid). Det er også vigtigt at bestemme bakteriebelastningen svarende til en OD600nm på 0,5, fordi det kan variere lidt fra en stamme til en anden. Kulturbetingelserne for bakteriestammer kan tilpasses i henhold til det eksperimentelle mål.

3. Infektion assay med S. aureus

  1. Bestemmelse af celletæthed og levedygtighed
    1. Fjern og kassér det brugte kulturmedium fra de tre brønde, der er dedikeret til at tælle A549-celler.
    2. Der tilsættes 1 mL komplet infektionsmedium, der indeholder 5 μg/mL Hoechst 33342 og 1 μg/mL propidiumiodid.
      BEMÆRK: Hoechst 33342 er et kendt mutagen og skal håndteres med omhu. Propidium jod, en potentiel mutagen, skal håndteres med omhu og bortskaffes sikkert i henhold til gældende regler.
    3. Inkuberes cellerne i 30 min ved 36 ± 1 °C i 5% CO2.
    4. Tæl cellenummeret, og beregn celle levedygtigheden ved hjælp af et fluorescensmikroskop i svingfelt.
      BEMÆRK: Hvis der ikke er et fluorescensmikroskop tilgængeligt, kan celletætheden og levedygtigheden beregnes med trypanblå farvning ved hjælp af et celletællingskammer.
  2. Forberedelse af bakterieaffjedringen
    1. Dispenser 25 mL komplet infektionsmedium i et rør og forvarm ved 36 ± 1 °C.
    2. S . aureus suspension til anOD600nm på 0,5 i komplet infektion medium ved hjælp af en celletæthed meter.
    3. Forbered 20 mL bakteriel suspension for celle podning ved at fortynde 0,5 OD600nm i fuldstændig infektion medium for at opnå en mangfoldighed af infektion (MOI) på 1 i henhold til antallet af celler pr brønd.
      BEMÆRK: MOI svarer til antallet af bakterier tilsat pr. celle i hver brønd. For eksempel at opnå en MOI på 1 med 1,0 × 106 celler pr. brønd, skal du forberede en bakteriel suspension ved 2,0 × 106 CFU/mL, så der kan tilsættes 106 CFU i et volumen på 500 μL (se trin 3.3.3). MOI kan justeres i henhold til de celletyper og bakteriestammer, der skal testes.
    4. Brug en automatisk spiral plater til at bestemme S. aureus belastning af den fortyndede bakteriel suspension, der skal anvendes til cellen podning trin.
    5. Agarpladerne inkuberes i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    6. Den næste dag skal du tælle antallet af kolonier med en kolonitæller for at beregne den nøjagtige MOI for hver testet stamme.
      BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen automatisk spiralplade til rådighed, kan bakteriebelastningen bestemmes ved seriel fortynding på en agarplade. Se den bakteriologiske analysemanual for nærmere oplysninger14.
  3. Celle podning
    1. Overhold hver brønd af 24-brønd plade ved lav forstørrelse mikroskopi for at sikre, at cellerne er sunde og vokser som forventet.
    2. Fjern og kassér det brugte cellekulturmedie fra 24-brøndpladen.
    3. Der tilsættes 500 μL af bakterieaffjedringen til podning til hver brønd med 100% sammenløbsceller.
    4. Inkuberes cellerne i 2 timer ved 36 ± 1 °C og 5% CO2.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge tre brønde af pladen for hver tilstand, der skal testes (tre gange) og at udføre mindst tre uafhængige eksperimenter. Forsinkelsen af inkubation kan tilpasses i henhold til det eksperimentelle mål.
  4. Kvantificering af intracellulære bakterier med forbedret enzymbeskyttelsesanalyse (iEPA)
    1. Klargør 7 mL 4x lysis buffer med 3,5 mL 2% Triton X-100 i sterilt vand og 3,5 mL trypsin-EDTA.
    2. Der fremstilles en lysostaphin-lageropløsning ved 10 mg/ml i acetatbuffer og aliquot 25 μL i kryovialer. Opbevares ved -80 °C i op til 6 måneder.
    3. Der fremstilles 250 μL frisk lysostaphin-arbejdsopløsning ved 1 mg/mL ved blanding af 25 μL af lysostaphinlageropløsningen (10 mg/mL) og 225 μL på 0,1 M Tris-HCl. Opbevares ved 4 °C i op til 48 timer.
    4. Der fremstilles 6,25 mL komplet infektionsmedium suppleret med lysostaphin ved at tilsætte 6 mL komplet infektionsmedium til 250 μL af lysostaphin-arbejdsopløsningen.
    5. Der tilsættes 250 μL komplet infektionsmedium suppleret med lysostaphin i hver brønd og omrør pladen forsigtigt ved at dreje pladen i hånden.
    6. Inkuberes cellerne i 1 time ved 36 ± 1 °C i 5% CO2 for at lade lysostaphin dræbe de ekstracellulære bakterier.
    7. Ved inkubationstidens afslutning tilsættes 10 μL proteinase K ved 20 mg/mL i hver brønd for at inaktivere lysostaphin.
    8. Inkuber cellerne i 2 min ved stuetemperatur.
    9. Der tilsættes 250 μL 4x lysis buffer for at lyse cellerne ved osmotisk stød.
    10. Inkuberes cellerne i 10 min ved 36 ± 1 °C.
    11. Bland grundigt ved pipetter op og ned ti gange over hele bunden af brønden for at sikre, at cellerne er fuldt lys og homogeniseret.
    12. Brug en automatisk spiral plater til at bestemme S. aureus belastning af hver brønd.
    13. Agarpladerne inkuberes i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    14. Den næste dag tælle antallet af kolonier med en koloni tæller til at beregne den intracellulære S. aureus belastning af hver brønd.
  5. Måling af intracellulær effekt af antimikrobielle forbindelser med enzymbeskyttelsesanalyse (EPA)
    1. Klargør 25 mL 1x lysis buffer med 3.125 mL 2% Triton X-100 i sterilt vand, 6,25 mL trypsin-EDTA og 15.625 mL sterilt vand.
    2. Der fremstilles 250 μL frisk lysostaphin-arbejdsopløsning ved 1 mg/mL ved blanding af 25 μL af en lysostaphinlageropløsning (10 mg/mL) og 225 μL på 0,1 M Tris-HCl.
    3. Der tilbereds 25 mL komplet infektionsmedium suppleret med lysostaphin ved at tilsætte 24,75 mL komplet infektionsmedium til 250 μL af lysostaphin-arbejdsopløsningen.
    4. For hver antimikrobiel forbindelse, der skal testes, fremstilles 3,1 mL komplet infektionsmedium suppleret med lysostaphin og den antimikrobielle forbindelse i den koncentration, der skal undersøges.
    5. Fjern og kassér det brugte cellekulturmedie fra 24-brøndpladen.
    6. Tilsæt 1 mL af komplet infektion medium suppleret med lysostaphin.
    7. Inkuberes cellerne i 1 time ved 36 ± 1 °C i 5% CO2 for at lade lysostaphin dræbe de ekstracellulære bakterier.
    8. Fjern og kassér mediet suppleret med lysostaphin fra 24-brøndspladen.
    9. Fyld tre brønde med 1 mL medium suppleret med lysostaphin plus den antimikrobielle forbindelse, der skal testes.
    10. Gentag trin 3.5.9 for hver antimikrobiel forbindelse, der skal testes.
    11. For kontrol tilstand, fylde tre brønde med 1 ML medium suppleret med lysostaphin uden antimikrobielle sammensatte.
    12. Inkuberes cellerne i 24 timer ved 36 ± 1 °C i 5% CO2.
    13. Ved inkubationsperiodens afslutning fjernes og kasseres det brugte medium og vask forsigtigt hver brønd tre gange med sterile DPBS med CaCl2 og MgCl2.
    14. Tilsæt 1 mL 1x lysis buffer til hver brønd for at løsne og lyse cellerne ved osmotisk chok.
    15. Inkuberes cellerne i 10 min ved 36 ± 1 °C.
    16. Bland grundigt ved pipetter op og ned ti gange over hele brønden for at sikre, at cellerne er fuldt lys og homogeniseret.
    17. Brug en automatisk spiral plater til at bestemme S. aureus belastning af hver brønd.
    18. Agarpladerne inkuberes i 18-24 timer ved 36 ± 1 °C.
    19. Den næste dag tælle antallet af kolonier med en koloni tæller til at beregne den intracellulære S. aureus belastning af hver brønd.
      BEMÆRK: Den intracellulære aktivitet af hver antimikrobiel forbindelse skal beregnes i henhold til den bakterielle belastning af kontroltilstanden. Det er også vigtigt at kontrollere cytotoksiciteten af alle antimikrobielle forbindelser for at bevise, at de forskelle, der observeres mellem kontrollen og forbindelserne, ikke skyldes celledød.

Representative Results

Resultaterne af S. aureus internalisering af A549 epitelceller er afbildet i figur 1A. A549 celler blev podet med S. aureus SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B, som mangler fibronectinbindende proteiner A og B, ved en MOI på 1 i 2 timer. For at ødelægge ekstracellulær S. aureus blev lysostaphin tilføjet til kulturmediet, og cellerne blev inkuberet i 1 time. Dernæst blev lysostaphin enten fjernet ved vask for EPA eller inaktiveret med proteinase K til iEPA. Derefter blev cellerne forstyrret i lysisbufferen, og bakteriebelastningen blev kvantificeret af kultur. Ved at bruge EPA var de gennemsnitlige intracellulære belastninger henholdsvis 4,46 og 0,49 Log CFU/mL for SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, grønne bjælker). Ved hjælp af iEPA var de gennemsnitlige intracellulære belastninger henholdsvis 4,53 og 0,56 Log CFU/mL for SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA/B (figur 1A, røde bjælker). Det er interessant at bemærke, at både EPA og iEPA viste lignende resultater, hvilket kan forklares ved den lette udførelse af vaskene, når cellerne er i god stand, og fordi S. aureus-induceret cytotoksicitet er meget lav i disse eksperimentelle indstillinger (data ikke vist).

Resultaterne af intracellulære aktiviteter af vancomycin, rifampicin og levofloxacin mod S. aureus er afbildet i figur 1B. For at måle disse antibiotikas intracellulære aktivitet blev HaCaT-celler podet med S. aureus ATCC 29213 ved en MOI på 1 i 2 timer. Cellerne blev inkuberet med lysostaphin, med eller uden de antimikrobielle forbindelser, der skulle testes, i 24 timer. Dernæst blev lysostaphin og antimikrobielle forbindelser fjernet ved vask. Cellerne blev forstyrret i lysis buffer, og bakteriebelastningen blev kvantificeret af kultur. De gennemsnitlige intracellulære belastninger var henholdsvis 4,57, 4,51, 3,03 og 2,91 log CFU/mL til kontrol, vancomycin (50 μg/mL), rifampicin (7 μg/mL) og levofloxacin (10 μg/mL) (figur 1B).

Figure 1
Figur 1: Intracellulær Staphylococcus aureus belastning i epitelceller. (A) Enzymbeskyttelsesanalyse (grønne stænger) og forbedret enzymbeskyttelsesanalyse (røde stænger) i A549-celler inficeret med S. aureus SF8300 WT og ΔfnbA/B. (B) Intracellulære aktiviteter af antimikrobielle forbindelser i HaCaT-celler inficeret med S. aureus ATCC 29213. Søjler repræsenterer gennemsnitsværdierne for tre uafhængige eksperimenter udført i tredotel. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne. p < 0,0001. Forkortelser: Ctrl = control; cfu = kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De analyser, der er beskrevet her, er værdifulde for at studere omfanget af internalisering og den intracellulære overlevelse af S. aureus i NPPCs, samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser6,15,16. Nogle trin i begge assay protokoller kan være kritisk. Cellernes sundhedstilstand og massefylde skal være perfekt kontrolleret og konsistent mellem uafhængige eksperimenter. Bakterieinoculum skal omhyggeligt standardiseres for at opnå en reel MOI tæt på den målrettede teoretiske MOI. Generelt skal man passe på ikke at løsne nogen af cellerne under pipettering. Vaskene for at fjerne lysostaphin og antibiotika er kritiske skridt i EPA. Brugen af proteinase K har vist sig at forbedre dette trin, når der ikke anvendes antibiotika (se nedenfor). Sidst men ikke mindst skal cellerne være helt løsrevet i hver brønd og grundigt homogeniseret efter inkubationen med lysisbufferen for pålideligt at kvantificere S. aureus intracellulær belastning.

I nogle tilfælde kan der opstå problemer, og flere punkter skal kontrolleres først. I tilfælde af manglende reproducerbarhed skal det huskes, at S. aureus kan danne klumper, hvilket gør kvantificering ved absorbans unøjagtig. Klumpning af bakterier kan øges ved centrifugering og vasketrin, hvis kulturmediet skal udskiftes (f.eks. for at eliminere et udskillet protein). Bakterieophænget bør anvendes hurtigt, fordi bakterierne fortsætter med at vokse ved stuetemperatur. Lysostaphin-effekten kan falde på grund af ukorrekte opbevaringsforhold, suboptimal pH for enzymaktivitet i kulturmedierne, variabilitet i den enzymatiske aktivitet mellem partier og udbydere og manglende lysostaphinfølsomhed af nogle stammer under specifikke vækstbetingelser. Phenol rød kunne have en lille bakteriostatisk effekt, især når kulturmediet er relativt dårlig i næringsstoffer i forhold til de typiske bouillon, der anvendes til dyrkning af bakterier. Således er det tilrådeligt at bruge et cellekulturmedium uden phenolrødt, hvilket også forbedrer fluorescens mikroskopiske observationer ved at reducere baggrundsstøjen.

Selvom denne metode er et værdifuldt værktøj til at studere den intracellulære skæbne af forskellige stammer, bør nogle grænser for metoden overvejes. Brugen af en meget høj MOI kan overbelaste kapaciteten af NPPCs og udjævne forskellene mellem de forskellige testede stammer. Omfanget af internalisering af de mest cytotoksiske stammer kan undervurderes, fordi lysostaphin (eller antibiotika) hurtigt ødelægger S. aureus , der frigives af beskadigede celler. Forsøg med længere varigheder (dvs. at studere intracellulær overlevelse eller intracellulær aktivitet af antibiotika) er således lettere at etablere med stammer med lav cytotoksicitet. Derfor bør inkubationstiden og MOI justeres nøjagtigt i henhold til stammevirulensen, celletypen og forsøgsmålet.

Den metode, der er beskrevet her med brug af lysostaphin er mere pålidelig end dem, der er baseret på gentamicin, fordi gentamicin i modsætning til lysostaphin har tendens til at blive internaliseret af værtsceller13. Den anden fordel er muligheden for at inaktivere lysostaphin. Hæmning af lysostaphin aktivitet blev rapporteret af Kim et al.13 ved brug af EDTA til chelate zinkioner eller 1,10-phenanthroline; Der kræves dog stadig intensive vasker for at fjerne enzymet før plating af bakterierne. Her muliggør proteinase K hurtig inaktivering af lysostaphin. Vi observerede, at celler har tendens til at løsne sig fra kulturpladen, når de bliver stærkt inficeret på grund af multiplikationen af intracellulær S. aureus. Ved at springe det sidste vasketrin over forenklede iEPA-metoden i høj grad teknisk håndtering og muliggjorde genopretningen af de internaliserede bakterier i løst klæbende eller allerede løsrevne celler.

De mere koncentrerede reagenser og buffere, der anvendes i iEPA, hjalp også med at reducere rørarbejdet og minimere tabet af celler. Derudover kan iEPA bruges med celler i suspension, såvel som med organoider, der er vanskelige at vaske. Afslutningsvis muliggør enzymbeskyttelsesanalyser undersøgelsen af omfanget af internalisering og S. aureus' intracellulære skæbne samt den intracellulære aktivitet af antimikrobielle lægemidler med forskellige in vitro-modeller . Der bør foretages forbedringer for bedre at karakterisere forholdet mellem internalisering og cytotoksicitet for bedre at forstå vigtigheden af at udvikle lægemidler, der er i stand til at nå S. aureus inde i cellen.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

S. aureus stammer SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA / B blev generøst begavet af Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra FINOVI-foreningen (#AO13 FINOVI) under ledelse af Instituttet for Universitetet i Lyon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

Biologi udgave 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Forbedret enzymbeskyttelsesanalyse til undersøgelse af <em>Staphylococcus aureus</em> internalisering og intracellulær effekt af antimikrobielle forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter