Summary
Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.
Abstract
A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador.
Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.
Introduction
O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo 1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratamentos cirúrgicos, como transplante de pele perfurado e transplante de melanócitos autólogos 3,4,5. No entanto, pacientes que usam terapia medicamentosa e fototerapia são propensos a recaídas, e esses tratamentos têm efeitos terapêuticos de longo prazo ruins. O tratamento cirúrgico é traumático e apenas moderadamente eficaz 2,6. Portanto, uma nova e eficaz estratégia terapêutica é necessária para o vitiligo.
A reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reverte essas células de seu estado terminal para um estado pluripotente, um processo mediado pelos fatores de transcrição, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. No entanto, devido à possibilidade de tumorigenicidade e ao longo tempo de produção, essa tecnologia tem sido recebida com ceticismo quando aplicada aos cenários clínicos8. Reprogramação direta é uma tecnologia que faz com que um tipo de célula terminal se transforme em outro tipo de célula terminal9. Esse processo é alcançado por fatores adequados de transcrição. Várias células já foram diretamente reprogramadas com sucesso, incluindo cardiomiócitos10, neurônios11 e células ciliadas cocleares12. Alguns pesquisadores até reprogramaram tecido da pele diretamente in situ, que pode ser usado para reparação de feridas13. As vantagens da reprogramação direta incluem redução do tempo de espera e custos, menor risco de câncer, menos problemas éticos e uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à determinação do destinocelular 9.
Embora o método de reprogramação direta seja amplamente utilizado, atualmente não há um método definido para a reprogramação direta das células da pele em melanócitos, especialmente por causa dos numerosos fatores de transcrição a serem considerados14,15. Os fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e Pax3, têm sido usados para reprogramação direta de células da pele em melanócitos14. Em contraste, a combinação de MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 também tem sido usada para reprogramação direta de células da pele em melanócitos humanos em outro estudo15. Neste protocolo, apesar do uso de um método de triagem diferente, o mesmo resultado foi obtido com a combinação de Mitf, Sox10 e Pax3 para reprogramação direta de células da pele em melanócitos como descrito anteriormente14. Desenvolver um sistema para gerar melanócitos de outras células da pele pode fornecer um esquema para transformar outras células da pele de pacientes com vitiligo em melanócitos. Por isso, é fundamental construir um método simples e eficiente para essa reprogramação direta para gerar melanócitos com sucesso.
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Protocol
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes.
1. Construção de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para fatores de transcrição
- Produção do vírus concentrado (Figura 1A, B)
- Placa 1,5 × 10células HEK-293T em um prato de 60 mm e cultivar essas células com meio normal (ver Tabela 1) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
NOTA: Se o vírus precisar ser embalado em lotes, um prato de cultura celular de 100 mm pode ser usado (para detalhes, consulte Tabela 2). - Após 24 horas, certifique-se de que as células HEK-293T atingiram 80-90% de confluência no dia da transdução, e substitua o meio por 3,5 mL de DMEM (150 μL de DMEM por 1 cm2). Deixe as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 2 h.
NOTA: O meio de substituição deve ser livre de soro, para que as células possam ficar "famintas" para uma melhor transfecção plasmíida. - Prepare a mistura de plasmídeos (mix A) contendo 3 μg dos plasmídeos alvos de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 μg da embalagem plasmid PMD2. G e 2 μg da embalagem plasmid PSPAX2. Coma o volume da mistura de A a 150 μL com DMEM sem soro. Prepare a mistura do reagente de transfecção (mix B) adicionando 12 μL do reagente de transfecção (o volume é o dobro da massa total de todos os plasmídeos), e compor o volume da mistura B a 150 μL com DMEM sem soro.
NOTA: Ao preparar as misturas, é importante adicionar líquido lentamente para evitar bolhas de ar. - Misture a mistura A e misture B depois de deixá-los ficar em pé por 5 minutos à temperatura ambiente. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min para formar o complexo de transfecção.
- Retire as células HEK-293T da incubadora, substitua o meio por DMEM + 2% FBS, adicione a mistura da etapa 1.1.4 dropwise e misture o líquido suavemente.
- Após 8h, troque o meio com 3,5 mL de meio normal. Depois de mudar o meio, colete o vírus sobrenante a cada 24h e 48 h.
- Misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Passe o supernatante através de filtros de 0,45 μm e colete-o em um tubo cônico estéril de 50 mL.
NOTA: O vírus coletado às 24h pode ser armazenado a 4 °C e misturado com o vírus coletado às 48h. - Concentre o vírus sobrenante por centrifugação a 6000 × g a 4 °C durante a noite (~16 h). Certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico após a centrifugação.
- Despeje o supernatante lentamente. Dissolva a pelota do vírus em um volume de meio normal que é 1/100do volume do vírus supernante. Usando uma micropipette P1000, pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea seja obtida. Divida o vírus concentrado em tubos de microcentrifuuagem conforme necessário. Armazenar a −80 °C.
NOTA: O vírus está concentrado 100x com este método. O vírus concentrado (100x) pode ser armazenado por >1 ano a −80 °C. Evite o congelamento repetido e o descongelamento do vírus.
- Placa 1,5 × 10células HEK-293T em um prato de 60 mm e cultivar essas células com meio normal (ver Tabela 1) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- Detecção de titulação de vírus concentrado (Figura 1C)
- Placa 1 × 10células HEK-293T em um poço de uma placa de 6 poços. Lembre-se de adicionar um bem como um controle negativo. Cultura essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- Adicione 0,1 μL ou 0,2 μL de vírus concentrado fluorescente (100x) a cada poço após 24 horas, e adicione 4 ng/μL do reagente de transfecção polimérica cationic a cada poço. Cerca de 8-12 h após a infecção, substitua o meio por meio normal.
NOTA: Para garantir a precisão e eficiência da detecção de fluorescência, a taxa de infecção deve ser de 10 a 30%. Adicionar 0,1 μL ou 0,2 μL do vírus concentrado fluorescente pode manter a eficiência da infecção dentro desta faixa. O titulador de vírus concentrado pode atingir 1 × 108 unidades transdutoras (TU)/mL pelo menos. - Aproximadamente 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) para remover células mortas.
- Trypsinize essas células usando 250 μL de 0,05% de trypsin-EDTA por poço em uma placa de 6 poços para 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C e, em seguida, remover o sobrenatante.
- Resuspenque a pelota celular em 1 mL de PBS, adicione a suspensão a um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e detecte a eficiência da infecção da fluorescência do vírus (proteína fluorescente verde, GFP+) usando citometria de fluxo.
- Calcule o titulador concentrado do vírus usando a seguinte fórmula: 105 (volume celular) × taxa de infecção (GFP+%)/volume de vírus adicionado (0,1 μL ou 0,2 μL).
2. Reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos (Figura 2A)
- Cubra um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 15-30 min. Certifique-se de que o poço está completamente coberto com a solução de gelatina de 0,1%. Aspire a solução de gelatina de 0,1% após o revestimento.
NOTA: Prepare 0,1% solução de gelatina (100 mL) da seguinte forma: 0,1 g de gelatina em pó é dissolvido em 100 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro autoclaved e depois armazenado a 4 °C por no máximo 2 meses. - Placa 5 × 104 MEFs em um poço de uma placa de 6 poços revestida com 0,1% de gelatina (como na etapa 2.1), e cultivar essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 durante a noite.
- Após 24 h, confirme que os MEFs atingiram 40-50% de confluência. Substitua o meio por meio normal.
- No dia 0, retire o vírus concentrado do congelador e derreta o vírus no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando eq. (1). Adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de acordo com o volume calculado, e depois adicione 4 μg/mL do agente de transfecção polimérica cáfônica.
Número celular (5 × 104) × 30 (multiplicidade de infecção, MOI)/titulante de vírus (1) - No dia 1, 8-12 h após a infecção, remova o meio contendo o vírus e substitua-o por um meio normal fresco, adicionando 0,5 μg/mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.
- No dia 2, 48 h após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Primeiro, altere 1/4 do volume médio total e adicione 3 μM CHIR99021.
- Do dia 3 ao dia 7, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-se por uma maior proporção de meio de reprogramação (ver Tabela 1) gradualmente, e mude para meio de reprogramação completa dentro de 5 dias.
NOTA: Durante este período, a puromicina e CHIR99021 devem ser utilizadas todos os dias. Muitas células mortas aparecerão no primeiro e segundo dia de mudança do meio de reprogramação. Isso é normal à medida que as células gradualmente se adaptam à transformação. Portanto, o meio precisa ser alterado gradualmente para garantir a proliferação saudável das células. - Para passar as células, adicione 500 μL de 0,05% de trypsin-EDTA para digerir as células por 3 minutos à temperatura ambiente. Quando ~60% das células flutuarem para cima, pare a digestão adicionando meio normal 2x o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL, centrífuga a 200 × g por 5 min a 4 °C, remova o supernasce, resuspenque a pelota celular com o meio de reprogramação e coloque as células em um prato estéril de 60 mm a uma densidade de 3 × 104/cm2. Cultume essas células a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .
NOTA: Do dia 8 ao dia 21, essas células são subculturadas a cada 3-5 dias e cultivadas em pratos estéreis de 60 mm para expandir. Eles podem ser cultivados para alcançar pelo menos a passagem 5.
3. Otimização para reprogramação direta e identificação
- Triagem para os fatores de transcrição otimizados
- Repita as etapas 2.1-2.7, reduzindo um dos seis fatores de transcrição de cada vez. Infecte os MEFs com o vírus com combinações de cinco fatores de transcrição.
- Sete dias após a infecção, extrair o RNA dessas células16 e analisar os níveis de expressão de seus genes melanócitos usando PCR de transcrição reversa (RT-PCR)17 para testar os fatores de transcrição com maior impacto na conversão para melanócitos, removendo-os um a um (Figura 3A).
- Use os três principais fatores de transcrição que afetam a conversão para melanócitos para infectar os MEFs. Repetir as etapas 2.1-2.7.
NOTA: Sete dias após a infecção, os genes melanocíticos devem ser detectáveis nessas células transformadas (Figura 3B). As informações de primer para caracterização de iMels estão incluídas na Tabela 3.
- Identificação de melanócitos induzidos (iMels)
- Use a coloração de imunofluorescência18 para verificar se os iMels expressam proteínas melanocíticas, incluindo TYRP-1 e DCT (Figura 4A).
- Mancha específica de melanina 3,4-dihidroxyfenylalanina (DOPA) (Figura 4B)
- Prepare 4% paraformaldeído (10 mL) da seguinte forma: dissolver 0,4 g de pó de paraformaldeído em 10 mL PBS. Coloque a solução em forno a 56 °C por 2h para promover a dissolução.
NOTA: A solução pode ser mantida a 4 °C por no máximo um mês. - Cultura os iMels em um prato de 30 mm e lavar o prato duas vezes com PBS pré-aquecido. Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído para fixar as células por 20 minutos, e lave o prato 3 vezes com PBS.
- Prepare 0,1% solução de mancha DOPA (10 mL) pouco antes de usar dissolvendo 0,01 g de pó L-DOPA em 10 mL de PBS. Coloque a solução em um banho de água a 37 °C por 30 min; sacudi-lo várias vezes para promover a dissolução.
- Adicione 1 mL de solução de coloração DOPA recém-preparada de 0,1%. Incubar em forno a 37 °C por 2-5 h. Se não houver partículas marrom-pretas, continue a incubar a 37 °C por mais 2 h, mas não por >5 h. Verifique as amostras a cada 30 minutos.
- Lave o prato 3 vezes com PBS por 1 min cada vez. Manche o núcleo com 1 mL de solução de coloração de hematoxilina por 2 min.
- Para armazenamento a longo prazo, desidratar as amostras usando 95% de etanol por 3 min e depois 100% etanol por 5 min. Sele o prato com xileno e bálsamo neutro.
- Prepare 4% paraformaldeído (10 mL) da seguinte forma: dissolver 0,4 g de pó de paraformaldeído em 10 mL PBS. Coloque a solução em forno a 56 °C por 2h para promover a dissolução.
- Mancha masson-fontana específica de melanina (Figura 4B)
- Placa iMels em um prato de 30 mm e fixar as células com 4% de paraformaldeído por 20 min; lave o prato 3 vezes com PBS.
- Adicione 1 mL de solução A (solução prata amônia) do kit de coloração Masson-Fontana (ver Tabela de Materiais), coloque o prato em uma caixa escura e coloque a caixa escura em um forno a 56 °C por 15-40 min.
NOTA: Se as partículas marrom-pretas não forem visíveis após 15 minutos no forno, devolva as amostras ao forno de 56 °C para continuar incubando, mas não por >40 min. Um pouco de água pode ser adicionada à caixa escura para evitar a secagem. - Solução aspirada A e lave o prato 5-6 vezes com água destilada, 1-2 min cada vez.
- Adicione 1 mL de solução B (solução hipo) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.
- Aspirar solução B e lavar o prato com água da torneira 3 vezes, 1 min cada vez.
- Adicione 1 mL de solução C (corante vermelho neutro) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.
- Aspirar solução C e lavar o prato 3 vezes com água destilada, 1 min cada vez.
- Adicione 1 mL de 100% de etanol para desidratação rápida, e aspire o etanol após 3 min.
NOTA: As amostras manchadas podem ser armazenadas por muito tempo após a vedação com xileno e bálsamo neutro.
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Representative Results
Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs.
O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (Figura 1B) após infectar células HEK-293T por 48 h com lentivírus não percentrado (1x) e lentivírus concentrado (100x). O título do vírus concentrado foi de 108 TU/mL ou mais, que é relativamente alto (Figura 1C).
A reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos é alcançada através da infecção com fator de transcrição lentivírus e transformação com o meio de reprogramação otimizado. O esquema para a geração de iMels de MEFs é mostrado na Figura 2A. A morfologia celular muda gradualmente durante a reprogramação direta. As sinapses celulares se alongam, e os núcleos celulares aumentam. No entanto, essas células envelhecem gradualmente após ~Dia 20 (~5 passagens) (Figura 2B).
Um fator de transcrição foi removido de cada vez do conjunto original de seis fatores de transcrição (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2) para determinar o fator de transcrição com o maior impacto na reprogramação. A remoção de Mitf, Pax3 ou Sox10 resultou no silenciamento da expressão dos genes melanócticos Tyr, Tyrp1 e Mlana (Figura 3A), indicando que esses três fatores de transcrição tiveram o maior impacto na conversão do fibroblasto em melanócitos. A expressão de genes melanóciticos induzidos pela reprogramação direta com três fatores de transcrição foi maior do que a de todos os seis fatores de transcrição (Figura 3B).
Por fim, foram identificadas as características dos iMels obtidos utilizando-se este sistema otimizado de reprogramação direta. A expressão de marcadores melanocíticos (TYR, TYYP1) foi detectada utilizando manchas imunofluorescentes (Figura 4A). Os métodos de coloração específicos de melanina, incluindo a coloração DOPA e Masson-Fontana, também apresentaram resultados positivos (Figura 4B).
Figura 1: Produção de vírus concentrado e estimativa de titer. (A) Intensidade de fluorescência de GFP após infectar células HEK-293T com lentivírus não concentração (1x) e lentivírus concentrado (100x) (B) Comparação das taxas de infecção de lentivírus não mitigados (1x) e lentivírus concentrado (100x) detectado pela citometria de fluxo. (C) Estimativa de Titer de lentivírus concentrados. Barras de escala = 250 μm. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; TU = unidades transdutoras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de iMels de MEFs. (A) Diagrama esquemático da geração iMels. (B) Alterações na morfologia celular durante a conversão de MEFs para iMels em reprogramação direta no dia 0, dia 3, dia 10 e dia 20+. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: iMels = melanócitos induzidos; MEFs = fibroblastos embrionários de camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Triagem para fatores de transcrição otimizados. (A) qRT-PCR dos níveis de Tyr, Tyrp1 e Mlana mRNA em células transduzidas com cinco fatores de transcrição (um dos seis fatores originais de transcrição foi removido). MEF + EV e MEF + 6F são usados como controle negativo e controle positivo, respectivamente. A expressão mRNA é normalizada à expressão Gapdh. (B) qRT-PCR dos níveis de Tyr,Tyrp1 e Mlana mRNA em células transduzidas com os seis fatores originais de transcrição e com três fatores de transcrição. MEF, MEF + EV e MMC são usados como um controle em branco, negativo e positivo, respectivamente. Os níveis de mRNA são normalizados para os níveis gapdh. Todos os valores são ± SD de três experimentos independentes. As sequências de primer são mostradas na Tabela 3. Abreviaturas: qRT-PCR = PCR de transcrição reversa quantitativa; MEF = fibroblastos embrionários de camundongos; MEF+EV = fibroblastos embrionários do camundongo + vetor vazio; MMC = melanócito do rato; 6F = seis fatores de transcrição compostos por Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2; 3F: três fatores de transcrição que compreendem Mitf, Pax3 e Sox10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação funcional de iMels. (A) Imunostaining de marcadores melanocíticos (TYR, TYYP1) em iMels. Barra de escala = 50 μm. Consulte a Tabela de Materiais para a diluição de anticorpos utilizados neste estudo. (B) Coloração de Masson-Fontana e coloração do DOPA. Mef e a linha celular Melan-a são usados como controle negativo e controle positivo, respectivamente. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: iMels = melanócitos induzidos; DOPA = 3,4-dihidroxifenylalanina; MEF = fibroblasto embrionário de camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes | Dose (concentração, volume) | Concentração Final | |
| Meio Normal (100 mL) | DMEM/ALTA GLICOSE | 89 mL | |
| FBS inativados pelo calor | 10 mL | ||
| Antibióticos (Caneta/Estreptococos) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| Meio de reprogramação (100 mL) | RPMI-1640 | 88 mL | |
| FBS inativados pelo calor | 10 mL | ||
| SCF Humano Recombinante | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| BFGF humano recombinante | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| Insulina humana recombinante | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 humano | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Toxina da cólera | 0,3 mg/mL, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetato (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hidrocortisona | 100 μg/mL, 500 μL | 0,5 μg/mL | |
| Adenina | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
Tabela 1: Componentes de mídia normal e reprogramação.
| Prato de Cultura | Densidade de semeadura (células/prato) | Médio (mL) | Sistema Plasmid | Reagente de transfecção (μL) | ||
| Plasmid alvo (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabela 2: Detalhes do sistema de embalagem de lentivírus.
| RT-PCR Primers | |
| Alvo | Conjuntos de primer |
| Gapdh | Avanço: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Reverso: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Avante: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Reverso: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Avante: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Reverso: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Avante: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Reverso: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabela 3: Informações do primer.
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Discussion
A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortalizadas, as células usadas para fazer o vírus concentrado devem ser células saudáveis dentro de 10 passagens (o titer diminui com passagens mais altas).
Outro ponto crítico é a proporção do reagente de transfecção (neste caso, lipofectamina) utilizado. Como as células são danificadas após a adição do reagente de transfecção, a razão do reagente para plasmídeos deve ser verificada repetidamente para garantir a condição ideal das células e a qualidade do vírus. A razão 2:1 de reagente de transfecção para plasmídeos é mais adequada para células HEK-293T para embalar o vírus neste sistema. Além disso, todas as etapas requerem manuseio suave durante todo o processo. Como as partículas de vírus podem ser absorvidas após o revestimento, o que afeta o titulante do vírus, não é aconselhável revestir o prato com qualquer matriz ao embalar o vírus. Devido à possibilidade de desprendimento do HEK-293T, o supernante deve ser substituído cuidadosamente, especialmente quando o meio fresco é adicionado após a coleta do vírus sobrenatante após 24 horas. Algumas outras considerações incluem a densidade celular, o tempo de transfecção e o teor de soro no meio. São questões importantes que afetam a eficiência da transfecção. As condições apresentadas neste protocolo são as mais adequadas, com base nos resultados obtidos após muitos experimentos repetidos.
No processo de reprogramação direta aos melanócitos, é importante considerar o estado dos MEFs originais da célula e a densidade de MEFs utilizados para reprogramação direta. Antes de iniciar a reprogramação direta, os MEFs devem ser cultivados em pratos de cultura celular não revestidos. As células na fase de proliferação (confluência de 40-50%) devem ser selecionadas para reprogramação direta; a eficiência da infecção diminui com o aumento da densidade celular. As células reprogramadas precisam ser banhadas em pratos de cultura revestidos de gelatina.
O tempo necessário para o vírus infectar células também é crítico; muito tempo um tempo de infecção prejudicará a sobrevivência celular, enquanto um tempo de infecção muito curto reduzirá a eficiência. Oito horas foram consideradas apropriadas para o vírus concentrado infectar MEFs neste protocolo. O último ponto crítico é a maneira correta de mudar o meio de reprogramação. Os MEFs precisam se adaptar a um novo meio. O estado das células deve ser verificado todos os dias, e o meio deve ser alterado cuidadosamente de acordo com o estado celular. Mudar o meio de reprogramação muito rapidamente fará com que um grande número de células morra.
Ao cultivar e subculturar iMels, a densidade de passagem das células é crítica. Os iMels precisam de uma densidade relativamente alta para manter o crescimento. As sinapses celulares devem estar em contato entre si para a proliferação normal dessas células. Se a densidade for muito baixa, as células podem parar de proliferar. Aqui, a densidade de 3 × 104/cm2 foi encontrada como uma densidade de passagem adequada para iMels. Após 5 passagens, os iMels começam a envelhecer (Figura 2B); a melanina é mais madura neste momento, e as células resultantes podem ser usadas para a imunofluorescência, doPA ou coloração de Masson-Fontana. Passagens anteriores de células podem ser usadas para RT-PCR porque a expressão dos genes mudará em um estágio relativamente inicial.
Embora a reprogramação direta seja amplamente estudada, há pouca pesquisa sobre a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos. Diferentes estudos têm utilizado diferentes fatores de transcrição14,15, levando a muita confusão. Este protocolo explica como produzir vírus concentrados de alta qualidade e selecionar vários fatores de transcrição para selecionar os mais importantes para reprogramação direta aos melanócitos. O meio foi complementado com fatores nutricionais para a reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo (Tabela 2). Finalmente, iMels funcionais foram identificados com sucesso. O sistema de reprogramação direta de melanócitos claro e otimizado poderia fornecer novas estratégias de tratamento para doenças despigmentação, como o vitiligo.
No entanto, ainda existem algumas limitações à tecnologia apresentada neste artigo. Em primeiro lugar, é desafiador estimar a eficiência deste protocolo. A edição de genes CRISPR-Cas9 poderia ser combinada com este protocolo para bater em genes melanocióticos, como Tyr ou Tyrp-1, nas células iniciais para observar a porcentagem de células induzidas durante o processo de reprogramação. Além disso, o sistema de introdução de lentivírus utilizado neste protocolo pode levar ao risco de recombinação genética e mutação de inserção19. No futuro, métodos de introdução mais eficientes e seguros poderiam ser usados, como vetores de expressão de proteína recombinante não-virais ou vetores de mRNA. O experimento neste protocolo ainda está em fase in vitro . O próximo passo é reprogramar os melanócitos diretamente in vivo, fazendo com que a pele não pigmentada fique pigmentada e use o sistema de reprogramação direta para projetar um tratamento eficaz do vitiligo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi parcialmente apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (82070638 e 81770621) e da Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
