İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri
Summary
Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.
Abstract
Janus kinaz (JAK) / sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) sinyal yolu, sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıtlara aracılık etmede çok önemli bir rol oynar. STAT proteinleri, esas olarak JAK’ların aracılık ettiği tirozin fosforilasyonu ile aktive edilir. STAT sinyal yolaklarının anormal aktivasyonu, birçok insan hastalığında, özellikle kanser ve bağışıklık ile ilgili koşullarda rol oynar. Bu nedenle, doğal hücre sinyal ortamında STAT protein fosforilasyonunu izleme yeteneği hem akademik hem de ilaç keşif araştırmaları için önemlidir. Fosforile STAT proteinlerini ölçmek için mevcut geleneksel tahlil formatları arasında batı lekelenmesi ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) bulunur. Bu heterojen yöntemler emek yoğun, düşük verimlidir ve batı lekelenmesi durumunda genellikle güvenilir (spesifik) değildir. Homojen (yıkamasız) yöntemler mevcuttur ancak pahalı olmaya devam etmektedir.
Burada, fosforile edilmiş STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) ve STAT6’nın (Y641) endojen seviyelerinin 384 kuyucuklu bir formatında, yeni THUNDER zaman çözümlü Förster rezonans enerji transferi (TR-FRET) platformu kullanılarak yapışkan veya süspansiyon hücrelerinden hücre lizatlarında hassas, sağlam ve uygun maliyetli ölçüm için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. Hücresel tahlil için iş akışı basit, hızlı ve yüksek verimli tarama (HTS) için tasarlanmıştır. Tahlil protokolü esnektir, düşük hacimli bir numune (15 μL) kullanır, yalnızca bir reaktif ekleme adımı gerektirir ve düşük verimli ve yüksek verimli uygulamalara uyarlanabilir. Her fosfo-STAT sandviç immünoassay, bilinen agonistler ve inhibitörler ile optimize edilmiş koşullar altında doğrulanır ve beklenen farmakoloji ve Z’-faktör değerlerini üretir. TR-FRET testleri orantılı olduğundan ve yıkama adımı gerektirmediğinden, geleneksel yaklaşımlardan çok daha iyi tekrarlanabilirlik sağlarlar. Birlikte, bu tahlil paketi, hücre tedavisini takiben spesifik fosforile STAT proteinlerinin daha kapsamlı bir analizi ve JAK / STAT sinyal yolunun spesifik ve seçici modülatörlerinin taranması ve karakterizasyonu için yeni uygun maliyetli araçlar sunmaktadır.
Introduction
JAK/STAT sinyal yolu, çeşitli sitokinlere, interferonlara, büyüme faktörlerine ve ilgili moleküllere hücresel yanıtlara aracılık etmede önemli bir rol oynar1,2. Bu ligandların spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanması, JAK’ların aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da spesifik tirozin kalıntılarının fosforilasyonu ile STAT proteinlerini aktive eder. STAT fosforilasyonu, dimerizasyonları ve çekirdeğe translokasyonları ile sonuçlanır, burada düzenlenmiş hedef genlerin transkripsiyonu üzerindeki etkilerini gösterirler. STAT ailesi yedi üyeden oluşur: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b ve STAT6. Üyeler, proliferasyon, farklılaşma, apoptoz, anjiyogenez ve bağışıklık sistemi regülasyonu dahil olmak üzere fizyolojik hücre süreçlerinin düzenlenmesinde karmaşık ve önemli bir rol oynamaktadır. STAT sinyal yolaklarının anormal aktivasyonu, başta kanser ve bağışıklıkla ilgili durumlar olmak üzere birçok insan hastalığında rol oynar3,4. Bu nedenle, doğal hücre sinyal ortamında STAT protein fosforilasyonunu değerlendirme yeteneği hem akademik hem de ilaç keşif araştırmaları için önemlidir.
Bugüne kadar, STAT’lar da dahil olmak üzere hücre içi fosforile protein seviyelerini ölçmek için kullanılan geleneksel yöntemler antikor bazlıdır ve batı lekelenmesi, ELISA ve fosfoflow sitometrisini içerir. Bu heterojen yöntemler, batı lekelenmesi durumunda emek yoğun, zaman alıcı, hataya eğilimli, düşük verimli ve genellikle güvenilmezdir (örneğin, özgüllük sorunları)5. Buna karşılık, homojen analizler daha az deneysel adım gerektirir, daha küçük numune hacimleri kullanır ve HTS’ye uygundur. Hücre lizatlarındaki STAT’ların JAK’a bağımlı fosforilasyonunu nicel olarak izlemek için kullanılabilecek beş homojen hücre bazlı immünoassay platformu vardır: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen ve Lumit. Bu platformların her birinin avantajları ve dezavantajları vardır.
SureFire, biri biyotinillenmiş bir çift antikoru özel olarak yakalamak için kaplanmış donör ve alıcı boncukları kullanan ışıldayan oksijen kanal teknolojisine dayanmaktadır. Fosforile protein varlığında, iki antikor donör ve alıcı boncukları birbirine yaklaştırarak kemilüminesan sinyalin üretilmesini sağlar6. Çok yönlü ve hassas olsa da, bu teknoloji pahalıdır, kültür ortamındaki biyotin’den etkilenir, ortam sıcaklığına ve ışığa karşı çok hassastır ve algılama için özel bir okuyucu gerektirir. HTRF ve LANCE, donör moleküller olarak uzun ömürlü ışıldayan lantanid iyon komplekslerini (Europium veya Terbiyum şelatları veya Europium kriptolatları) ve alıcı moleküller olarak çok kırmızı floroforları kullanan TR-FRET teknolojisine dayanmaktadır7. Donör veya alıcı moleküllerle etiketlenmiş iki proteine özgü antikor yakın bir yakınlığa getirildiğinde, FRET gerçekleşir ve alıcı floresansında bir artışa ve donör floresansında bir azalmaya neden olur. Bu uzun ömürlü floresan sinyalleri, tahlil parazitini azaltmak ve veri kalitesini artırmak için zamana bağlı ve oranmetrik bir şekilde ölçülebilir. TR-FRET’in diğer avantajları, ışığa duyarlı olmaması, tekrarlanan okumalara izin vermesi ve uzun sinyal kararlılığı sergilemesidir. TR-FRET çok yönlülüğü, hassasiyeti ve yüksek sağlamlığı nedeniyle HTS’de yaygın olarak uygulanmakla birlikte, tüm ticari TR-FRET tabanlı tahlil platformları pahalıdır ve bu nedenle akademik ve küçük endüstriyel laboratuvarlarda geniş çapta benimsenmesini engellemektedir. LanthaScreen testi ayrıca TR-FRET tabanlı bir okuma kullanır, ancak terbiyum etiketli fosfo-spesifik STAT1 antikoru ile birleştirilmiş yeşil floresan protein (GFP)-STAT1 füzyon proteinini istikrarlı bir şekilde ifade eden tasarlanmış bir U2OS hücre hattına dayanır8. Sinyal proteinlerinin seçimi açısından sınırlı olmasının yanı sıra, bu yöntem pahalı transfekte hücre hatları satın almayı, uygulanabilirliğini azaltmayı ve deneysel eserlerin olasılığını arttırmayı gerektirir. Lumit, NanoLuc Luciferase9’un küçük ve büyük NanoBit alt birimleri ile kimyasal olarak etiketlenmiş ikincil antikorları (fare ve tavşan karşıtı) kullanan jenerik bir biyolüminesan immünoassay platformudur. İki birincil antikorun hedef proteine bağlanması, ikincil antikorları, bir lüminesans sinyali üreten aktif bir enzim oluşturmak için yakınlaştırır. Lüminesans genellikle hassas ve sağlam bir okuma olsa da, iki farklı türde yetiştirilen birincil antikorlara duyulan gereksinim, tahlil tasarımı için seçenekleri sınırlar. Ek olarak, karmaşık numune matrislerinde ikincil antikorların kullanımı tahlil girişimine eğilimli olabilir.
Bu nedenle, bireysel fosforile ve toplam STAT proteinlerini HTS ile uyumlu bir şekilde ölçmek için güvenilir, hızlı, ancak uygun fiyatlı bir hücre bazlı tahlil platformuna hala ihtiyaç duyulmaktadır. Bu ihtiyacı karşılamak için, gelişmiş bir TR-FRET teknolojisine (THUNDER) dayanan yeni bir yüksek verimli hücre bazlı immünoassay platformu geliştirildi ve hücre lisatlarında endojen olarak eksprese edilen hücre içi proteinlerin (fosforile veya toplam) basit, hassas, sağlam ve uygun maliyetli ölçümünü sağlamak için tasarlandı. Bu teknolojinin avantajları, olağanüstü spektral uyumluluk ve TR-FRET sinyali, titizlikle doğrulanmış antikorlar ve optimize edilmiş lizis tamponları sergileyen bir donör / alıcı FRET çiftinin kombinasyonundan kaynaklanmaktadır. Bu testler sandviç immünotahlilleri olarak biçimlendirilir ve basit, üç adımlı bir iş akışı kullanır (Şekil 1). Hücreler önce protein fosforilasyonunu modüle etmek için muamele edilir ve daha sonra kit içinde sağlanan spesifik lizis tamponu ile lize edilir. Hücre lizatındaki hedef fosforile veya toplam STAT proteini, hedef protein üzerindeki farklı epitopları tanıyan bir çift florofor etiketli antikor ile tek bir reaktif ilavesi ve inkübasyon adımında tespit edilir (Şekil 2). Bir antikor bir Europium şelat donörü (Eu-Ab1) ile etiketlenirken, ikinci antikor çok kırmızı bir alıcı florofor (FR-Ab2) ile etiketlenir. İki etiketli antikor, çözeltideki proteine bağlanır ve iki etiketi birbirine yaklaştırır. Donör Europium şelatının 320 veya 340 nm’de uyarılması, alıcı için bir FRET’yi tetikler ve bu da hücre lizatındaki hedef protein (fosforile veya toplam) konsantrasyonuyla orantılı olarak 665 nm’de uzun ömürlü bir TR-FRET sinyali yayar.
Şekil 1: TR-FRET tahlil iş akışı. İş akışı üç adımdan oluşur: hücre tedavisi, hücre lizisi ve TR-FRET kullanarak protein tespiti. İki plakalı tahlil protokolünde, lizatlar beyaz bir 384 kuyucuklu algılama plakasına aktarılırken, tek plakalı protokolde, tüm adımlar aynı beyaz 384 kuyucuklu algılama plakasında (hepsi bir arada kuyu protokolü) gerçekleştirilir. Kullanılan tahlil protokolünden bağımsız olarak, protein tespiti aynı toplam hacimde (kuyu başına 20 μL) gerçekleştirilir. Kısaltma: TR-FRET = zaman çözümlü Förster rezonans enerji transferi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TR-FRET sandviç immünoassay prensibi. Bir antikor, Europium şelat donörü (Eu-Ab1) ve ikincisi çok kırmızı küçük florofor alıcısı (FR-Ab2) ile etiketlenir. İki etiketli antikor, hücre lizatındaki hedef protein (fosforile veya toplam) üzerindeki farklı epitoplara spesifik olarak bağlanır ve iki floroforu birbirine yaklaştırır. Donör Europium şelatının 320 veya 340 nm’de uyarılması, donörden alıcı moleküllere bir FRET tetikler ve bu da 665 nm’de bir sinyal yayar. Bu sinyal, hücre lizatındaki protein konsantrasyonu ile orantılıdır. Spesifik hedef proteinin yokluğunda, donör ve alıcı floroforlar FRET’nin gerçekleşmesi için birbirinden çok uzaktır. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; TR-FRET = zaman çözümlü FRET; Ab = antikor; FR = uzak kırmızı; AB – Europium şelat; P = fosforilasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada, THUNDER TR-FRET platformunu kullanarak yapışkan veya süspansiyon hücrelerinden gelen hücre lizatlarında fosforile STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) ve STAT6 (Y641) hücre içi seviyelerinin 384 kuyucuklu bir formatta ölçülmesi için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. Bu protokoller, iki plakalı bir transfer protokolü veya bir plakalı hepsi bir arada kuyu protokolü kullanarak hücre tedavisi, lizis ve TR-FRET tabanlı hedef protein tespiti için adımları tanımlar. Bu hücre bazlı testler, bilinen aktivatörlerin ve JAK/STAT yolunun inhibitörlerinin farmakolojik profilini belirlemek için uygulanır. HTS için seçilen tahlillerin sağlamlığı ve uygunluğu gösterilmiştir. Son olarak, tahlil optimizasyonu için temel deneyler ve tahlil sorun giderme önerileri tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Batı lekelenmesi ve ELISA tabanlı yöntemler gibi fosfoprotein analizi için geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, THUNDER TR-FRET hücresel tahlili için iş akışı basit ve hızlıdır, düşük hacimli bir numune (15 μL) kullanır, HTS için 384 kuyucuklu bir formatta tasarlanmıştır ve otomasyona oldukça uygundur. Tahlil protokolü esnektir ve hem orta hem de yüksek verimli uygulamalara kolayca uyarlanabilir. Tahliller, iki plakalı bir aktarım protokolü veya bir adet 384 kuyucuklu plaka pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
References
- Villarino, A., Kanno, Y., O’Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O’Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
