Summary
Nonostante i progressi nell'immunoistochimica multiplex e nell'imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l'imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell'endometrio.
Abstract
L'immunoistochimica è il metodo più comunemente usato per l'identificazione e la visualizzazione degli antigeni tissutali nella ricerca biologica e nella diagnostica clinica. Può essere utilizzato per caratterizzare vari processi biologici o patologie, come la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, il rigetto dei tessuti e le interazioni tessuto-biomateriale. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione di più antigeni (specialmente per le cellule immunitarie) in una singola sezione di tessuto utilizzando la colorazione immunoistochimica convenzionale (IHC) rimane insoddisfacente. Pertanto, negli ultimi anni sono state introdotte tecnologie multiplexed per identificare più marcatori biologici in un singolo campione di tessuto o in un insieme di diversi campioni di tessuto.
Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per differenziare i cambiamenti nelle interazioni immuno cellula-cellula all'interno dell'endometrio tra donne fertili e donne con aborti ricorrenti durante l'impianto. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la colorazione IHC a fluorescenza multiplexata per studiare la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie contemporaneamente in campioni endometriali temporizzati con precisione durante l'impianto dell'embrione. Il metodo prevede la preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per i sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati, con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali.
Utilizzando questo metodo, la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie nell'endometrio possono essere analizzati simultaneamente in una singola sezione di tessuto. Inoltre, questo documento discuterà i fattori critici e la risoluzione dei problemi per superare possibili interferenze fluoroforiche tra le sonde fluorescenti applicate. È importante sottolineare che i risultati di questa tecnica di colorazione multiplex possono aiutare a fornire una comprensione approfondita dell'interazione immunologica e della regolazione durante l'impianto dell'embrione.
Introduction
L'aborto spontaneo ricorrente (RM) può essere definito come la perdita di due o più gravidanze prima delle 24 settimane digestazione 1. Questa condizione riproduttiva frequente colpisce fino all'1% delle coppie in tutto il mondo2,3. La fisiopatologia è multifattoriale e può essere suddivisa in cause embriologicamente guidate (principalmente a causa di un cariotipo embrionale anormale) e cause guidate dalla madre che influenzano lo sviluppo dell'endometrio e / o della placenta. Questa manifestazione può derivare da anomalie genetiche parentali, anomalie uterine, condizioni protrombotiche, fattori endocrinologici e disturbi immunologici4.
Negli ultimi anni, la disfunzione delle cellule effettrici immunitarie è stata implicata nella patogenesi della perdita precoce della gravidanza5. Ciò ha ispirato molte indagini per chiarire le popolazioni specifiche di cellule immunitarie nell'endometrio durante il ciclo mestruale, l'impianto e la gravidanza precoce, con ruoli specifici all'inizio della gravidanza. Tra queste cellule immunitarie, le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale durante l'impianto dell'embrione e la gravidanza, in particolare nei processi di invasione trofoblastica e angiogenesi6. Gli studi hanno dimostrato un aumento della densità delle cellule uNK nell'endometrio delle donne con RM7,8, anche se questo risultato non è stato associato ad un aumentato rischio di aborto spontaneo9. Tuttavia, questo ha stimolato la ricerca valutando la densità di altri tipi di cellule immunitarie (come macrofagi, cellule dendritiche uterine) nell'endometrio nelle donne con RM10,11. Tuttavia, rimane incerto se vi sia un'alterazione significativa della densità delle cellule immunitarie nell'endometrio perimpianto nelle donne con RM.
Una possibile spiegazione per l'incertezza è che la valutazione della densità delle cellule immunitarie endometriali potrebbe essere difficile a causa dei rapidi cambiamenti nell'endometrio durante la finestra di impianto. Durante il lasso di tempo di 24 ore, cambiamenti significativi nell'endometrio alterano la densità delle cellule immunitarie e la secrezione di citochine, introducendo una fonte di variazione in questi risultati12. Inoltre, la maggior parte dei rapporti si basa principalmente sull'uso della colorazione a singola cellula (ad esempio, metodi IHC tradizionali) che non potrebbero esaminare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Sebbene la citometria a flusso possa essere utilizzata per rilevare più popolazioni cellulari in un singolo campione, le grandi quantità di cellule richieste e l'ottimizzazione dispendiosa in termini di tempo ostacolano la popolarità e l'efficienza di questo metodo. Quindi, il recente progresso nella colorazione IHC multiplex potrebbe risolvere questo problema immunocolorando più marcatori sullo stesso vetrino per valutare più parametri, tra cui il lignaggio cellulare e la localizzazione istologica delle singole sottopopolazioni immunitarie. Inoltre, questa tecnologia può massimizzare le informazioni ottenute in caso di limitata disponibilità di tessuti. In definitiva, questa tecnica può aiutare a chiarire le differenze nelle interazioni delle cellule immunitarie nell'endometrio tra donne fertili e donne con RM.
Due gruppi di donne sono stati reclutati dal Prince of Wales Hospital, tra cui donne fertili di controllo (FC) e donne con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile (RM). Il controllo fertile è stato definito come le donne che hanno avuto almeno un parto vivo senza alcuna storia di aborto spontaneo, e le donne RM sono state definite come quelle che hanno avuto una storia di ≥2 aborti consecutivi prima di 20 settimane di gestazione. I soggetti dei due gruppi soddisfacevano i seguenti criteri di inclusione: (a) età compresa tra 20 e 42 anni, (b) non fumatore, (c) ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e struttura uterina normale, (d) nessun uso di alcun regime ormonale per almeno 3 mesi prima della biopsia endometriale, (e) nessun idrosalpinx mediante istero-salpingogramma. Inoltre, tutti i soggetti reclutati avevano cariotipo normale, isterosalpingogramma ecografico a 3 dimensioni normale, ormone follicolo-stimolante del giorno 2 < 10 UI / L, progesterone medio-luteale > 30 nmol / L, normale funzione tiroidea e risultati negativi per gli anticorpi anticoagulante lupus e anticardiolipinA IgG e IgM.
Per comprendere meglio le basi immunologiche della RM, sarebbe più auspicabile quantificare e localizzare contemporaneamente i principali tipi di cellule immunitarie presenti nell'endometrio al momento dell'impianto. Questo articolo descrive l'intero protocollo dalla preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. Inoltre, questo documento descrive come determinare la densità e il raggruppamento dei tipi di cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dal Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali. Fare riferimento alla sezione introduttiva per i criteri di inclusione dei gruppi di controllo e RM.
1. Preparazione del campione
- Assicurarsi che tutte le donne in questo studio siano sottoposte a un test giornaliero dell'astina delle urine dal giorno 9 del ciclo mestruale in poi per identificare l'aumento dell'ormone luteinizzante (LH) per rilevare l'ovulazione e cronometrare le biopsie endometriali precisamente il 7° giorno dopo l'aumento di LH (LH + 7).
- Ottenere un frammento di biopsia endometriale di0,5 cm 2 utilizzando un campionatore Pipelle o Pipet Curet da donne fertili e donne con RM inspiegabile. Etichettare il contenitore e posizionare immediatamente il campione in formalina tamponata neutra al 10% (pH 7) per la fissazione notturna a temperatura ambiente.
NOTA: Il volume del fissativo dovrebbe essere 5-10 volte quello del tessuto. - Posizionare il tessuto in una cartuccia per la disidratazione in una macchina per la lavorazione dei tessuti prima di incorporarlo in cera di paraffina fusa. Incorporare i tessuti in paraffina a 58-60 °C.
- Lasciare raffreddare il blocco di paraffina durante la notte a temperatura ambiente. Utilizzare un microtomo per tagliare i blocchi di paraffina ad uno spessore di 3 μm.
NOTA: L'uso di acqua distillata aiuta nel corretto montaggio dei tessuti e nell'aderenza durante la colorazione multiplex. - Mettere il nastro di paraffina a bagnomaria a 40-45 °C per 30 s.
- Montare le sezioni su vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina (0,1% p/v). Posizionare i vetrini con il tessuto rivolto verso l'alto e lasciare asciugare a 37 °C durante la notte. Conservare le diapositive in una scatola di scorrimento lontano da temperature estreme fino a nuovo utilizzo.
2. Determinare la concentrazione ideale di anticorpi per multiplex IHC utilizzando IHC convenzionale.
NOTA: Questo è importante per identificare il livello di espressione e il modello di ciascun marcatore immunitario nel campione di endometrio e determinare la sequenza di colorazione di ciascun marcatore e i loro associati accoppiamenti fluoroforici di amplificazione del segnale di tiroamide (TSA).
- Testare gli anticorpi per la loro idoneità per multiplex IHC utilizzando manuale convenzionale IHC13.
- Utilizzare tessuti endometriali per il test di singoli anticorpi.
- Includere un controllo positivo (ad esempio, la milza) e un controllo negativo (controllo dell'isotipo) per ottimizzare la condizione di colorazione di ciascun anticorpo.
- Eseguire la colorazione utilizzando la diluizione raccomandata dalla scheda tecnica dell'anticorpo.
- Eseguire una colorazione aggiuntiva utilizzando concentrazioni superiori e inferiori alla diluizione raccomandata utilizzata nel passaggio 2.3.
NOTA: Un patologo clinico dovrebbe valutare ciecamente i vetrini colorati per confermare la localizzazione del sondaggio anticorpale e l'integrità cellulare.
3. Metodo di colorazione multiplex
- Preparazione e fissaggio delle diapositive
- Stendere i vetrini (dal punto 1.6) in piano con il fazzoletto rivolto verso l'alto in un forno e cuocere a 60 °C per almeno 1 ora.
- Togliere le diapositive dal forno e lasciarle raffreddare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente prima di metterle in una griglia verticale.
- Deceratare e reidratare i vetrini fissati in formalina e incorporati in paraffina con 10 minuti assegnati a ciascuno dei seguenti passaggi: xilene (2x), 100% etanolo (2x), 95% etanolo (1x), 70% etanolo (2x) e acqua distillata (2x).
- Posizionare il rack di vetrini in una scatola di plastica e immergerli in soluzione salina tamponata tris (TBS, pH 7,6).
NOTA: Le diapositive devono rimanere umide a partire da questa fase di reidratazione fino al montaggio nella fase finale. - Fissare i campioni immergendo i vetrini in una scatola di plastica riempita con una miscela di formaldeide diluita in metanolo (1:9) per 30 minuti al buio.
- Lavare i vetrini due volte in acqua deionizzata per 2 minuti e quindi procedere al recupero dell'antigene.
- Recupero dell'epitopo
- Posizionare il rack di vetrini in una scatola resistente al calore e riempirlo con tampone di acido citrico (pH 6.0) per coprire i vetrini.
- Posizionare la scatola nel microonde e riscaldare i vetrini per 50 s al 100% di potenza seguita da 20 minuti al 20% di potenza per mantenere la stessa temperatura.
- Lasciare raffreddare le diapositive per circa 15 minuti a temperatura ambiente.
- Risciacquare i vetrini in acqua per 2 minuti seguiti da TBS-Tween 20 (TBST) per 2 minuti.
NOTA: TBST è composto da 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl e 0,05% Tween 20 (v/v).
- Inceppamento
- Bloccare l'attività della perossidasi endogena nel tessuto immergendo il vetrino su un barattolo contenente soluzione bloccante la perossidasi (vedi tabella dei materiali)per 10 min.
- Lavare le diapositive con TBST per 5 min.
- Utilizzare una penna barriera idrofoba per segnare un limite attorno alla sezione del tessuto sul vetrino.
- Coprire le sezioni di tessuto con un tampone bloccante (vedi tabella dei materiali)o albumina sierica bovina (5%, p/v), e incubare i vetrini in una camera umidificata per 15 min.
- Applicazione di anticorpi e segnali
- Rimuovere i reagenti bloccanti.
- Incubare con l'anticorpo primario di interesse (ad esempio, CD3, diluizione 1:100 in diluente anticorpale, vedere Tabella 1) in una camera umidificata a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere l'anticorpo primario. Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta.
- Incubare con l'anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (HRP) polimerico(Tabella 1)per 15 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta.
- Applicare la soluzione di lavoro TSA al fluoroforo opalino (1:100 nel diluente di amplificazione) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la coniugazione del fluoroforo al campione di tessuto nei siti primari di legame degli anticorpi. Lavare con TBST in triplice copia per 5 minuti ogni volta.
- Stripping a base di microonde
- Risciacquare con il tampone di recupero dell'antigene (soluzione tampone di citrato, pH 6,0).
- Eseguire lo stripping a base di microonde per rimuovere il complesso primario-secondario-HRP per introdurre il prossimo anticorpo primario (ad esempio, CD20).
- Posizionare i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene, cuocerli a microonde al 100% di potenza per 50 s seguiti dal 20% di potenza per 20 minuti in contenitori sicuri per microonde e raffreddarli a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Ripetere i passaggi da 3.2.4 a 3.5.2 fino a quando i campioni di tessuto non sono stati sondati con tutti gli anticorpi primari.
- Controsuperazione e montaggio
- Dopo lo stripping a microonde e il raffreddamento del tampone di recupero dell'antigene, sciacquare i vetrini in acqua distillata e TBST.
- Incubare con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) soluzione (1,0 μg/mL) per 5 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta. Lavare con acqua una volta per 5 minuti.
- Asciugare all'aria la slitta e montarla con il mezzo di montaggio appropriato (vedere la Tabella dei materiali).
NOTA: la controcolorazione non sarà necessaria per le diapositive monoplex da utilizzare per lo sviluppo di librerie spettrali.
4. Immagine e analisi
- Preparazione di diapositive della libreria Spectral
- Crea diapositive di libreria (immagini di riferimento a macchia singola) per ogni fluoroforo, DAPI e autofluorescenza con lo stesso tessuto di controllo per l'analisi di immagini multispettrali.
- Utilizzando i vetrini dei campioni di biopsia endometriale di donne con RM e donne fertili, eseguire i passaggi da 1.1 a 3.6.4 per il rilevamento di singoli anticorpi per ogni vetrino (senza ulteriore aggiunta di anticorpi o fluorofori).
- Per ogni rilevazione di anticorpi, colorare uno dei vetrini con DAPI (come nel passaggio 3.6.2) e lasciare un vetrino non macchiato per il rilevamento di qualsiasi possibile autofluorescenza tissutale nello spettro.
- Utilizzare i filtri appropriati nella workstation per ottenere l'immagine per questo set di diapositive per ciascun anticorpo e caricarli nella libreria di analisi delle immagini (come descritto nel passaggio 4.2).
- Una volta acquisita l'immagine, selezionare inForm come sorgente della libreria spettrale e creare la libreria spettrale.
- Quando vengono utilizzati fluorofori, selezionare Macchie/Fluor... dal menu.
- Durante la scelta delle macchie o dei fluorofori, restringere le scelte selezionando uno o più gruppi. Selezionare Tutto per visualizzare tutti gli spettri compatibili con le immagini.
- Imaging spettrale
NOTA: le immagini sono state acquisite utilizzando la Mantra Workstation con la libreria spettrale stabilita utilizzando il software inForm Image Analysis.- Acquisire l'immagine dei vetrini colorati con anticorpi singoli con gli opportuni filtri di epifluorescenza come proposto nella Tabella 2 (ad esempio, DAPI, isotiocianato di fluoresceina [FITC], CY3, Texas Red e CY5) utilizzando la workstation.
NOTA: i filtri consigliati per i fluorofori specifici utilizzati in questo protocollo sono mostrati nella Tabella 2. - Identificare un tempo di esposizione adatto per un segnale ottimale esaminando ciascun marcatore nel corrispondente canale di fluorescenza.
NOTA: Il segnale ottimale viene determinato in base al riferimento sulla positività e localizzazione ottenuta nella colorazione a singolo anticorpo. - Determinare un tempo di esposizione fisso per ciascun analita (combinazione anticorpo-fluoroforo) per standardizzare un confronto tra campioni.
NOTA: La determinazione dell'esposizione fissa dipende dall'intensità del campione di interessi. - Scansiona le diapositive colorate multiplex nella modalità di scansione appropriata con l'algoritmo di messa a fuoco automatica incorporato.
NOTA: la libreria spettrale stabilita verrebbe utilizzata per differenziare il cubo di immagine multispettrale in singoli singoli componenti (unmixing spettrale). Ciò consentirebbe di elaborare l'identificazione basata sul colore per tutti i marcatori di interesse utilizzando le seguenti due fasi principali: sessione di allenamento e sessione di analisi delle immagini.
- Acquisire l'immagine dei vetrini colorati con anticorpi singoli con gli opportuni filtri di epifluorescenza come proposto nella Tabella 2 (ad esempio, DAPI, isotiocianato di fluoresceina [FITC], CY3, Texas Red e CY5) utilizzando la workstation.
- Analisi delle immagini
- Conteggio cellulare di tipi di cellule immunitarie selezionati nell'endometrio
- Cattura un minimo di 10 campi per l'analisi con ingrandimento 200x.
NOTA: i campi sono stati acquisiti eseguendo la scansione dell'intera sezione senza alcuna selezione. Ciò può garantire la cattura simultanea di tutti i componenti cellulari dell'endometrio, ad esempio il bordo epiteliale luminale, lo stroma e le ghiandole. - Per contare le celle, fare clic sul pulsante Conta oggetti nella barra dei passaggi per visualizzare il pannello Impostazioni conteggio oggetti.
- Selezionare la casella Elimina oggetto se tocco un bordo per l'esclusione di qualsiasi oggetto che tocchi il bordo dell'immagine, l'area di processo o la regione del tessuto.
- Se il tessuto è stato segmentato, selezionare la categoria di tessuto in cui si trovano gli oggetti. Non contare gli oggetti al di fuori della categoria di tessuto selezionata.
- Selezionare l'approccio desiderato per identificare gli oggetti: Object-Based o Pixel-Based (Soglia).
NOTA: l'approccio Basato su pixel (soglia) deve essere selezionato in caso di una macchia affidabile o coerente per la quale l'applicazione di una soglia semplice produrrà pixel dell'oggetto. L'approccio Object-Based è raccomandato quando sono richiesti approcci più avanzati basati sulla morfometria in caso di mancanza di coerenza e specificità della colorazione degli oggetti. - Selezionare il Signal Scalingdesiderato: Scala automatica o Scala fissa.
NOTA: se si sceglie Scala automatica, il ridimensionamento automatico di ciascun piano componente prima di eseguire la segmentazione degli oggetti. L'opzione Scala fissa è consigliata quando sono richieste migliori prestazioni di segmentazione e i segnali di macchia sono coerenti e affidabili. - Selezionare il componente primario per la segmentazione degli oggetti dall'elenco a discesa.
- Regolare il valore del segnale minimo per il componente primario in base al valore di soglia desiderato.
- Per riempire automaticamente i fori negli oggetti, selezionate Riempi fori ( Fill Holes) .
- Per rilevare oggetti che toccano altri oggetti come singoli oggetti, anziché come un unico oggetto, selezionare la casella di controllo Perfeziona divisione dopo aver selezionato la casella di controllo Dimensione massima (pixel).
- Per escludere gli oggetti in base all'rotondità dell'oggetto, selezionate la casella Rotondità (Roundness) e specificate la circolarità minimadesiderata.
- Contare tutte le cellule stromali (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−e DAPI+),comprese le cellule che circondano i vasi sanguigni.
- Contare le cellule immunitarie separatamente, comprese le cellule T (CD3+ e DAPI+), le cellule B (CD20+ e DAPI+), i macrofagi (CD68+ e DAPI+) e le cellule uNK (CD56+ e DAPI+).
- Esprimere i dati come percentuali delle cellule immunitarie rispetto al numero totale di cellule stromali per ogni immagine catturata e riportare il conteggio finale delle cellule come media di tutti i campi.
- Utilizzare l'Editor viste per visualizzare le tabelle di dati risultanti dopo l'elaborazione. Esportare la tabella Count Data.
- Quantificazione della distribuzione spaziale delle cellule immunitarie endometriali
- Sotto l'ingrandimento di 200x, stimare la funzione L utilizzando il programma R per un intervallo di 0-20 μm considerato una distanza massima di contatto cellula-cella14.
NOTA: la casella degli strumenti del linguaggio R 'spatstat' è stata utilizzata per misurare la funzione L.- Denotare il livello di raggruppamento di diverse coppie di cellule immunitarie in base all'area sotto la curva (AUC) della loro funzione L.
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Representative Results
Il processo schematico complessivo di esecuzione di un test multiplex a 4 colori per il rilevamento di 4 tipi di cellule immunitarie endometriali è mostrato nella Figura 1. In breve, il protocollo per questa colorazione di immunofluorescenza multiplex ha richiesto 8 passaggi chiave: 1. Preparazione del vetrino, 2. Recupero dell'epitopo, 3. Blocco, 4. Applicazione dell'anticorpo primario, 5. Applicazione dell'anticorpo secondario, 6. Amplificazione del segnale, 7. Rimozione dell'anticorpo e 8. Controcolorazione e montatura. Il rendering e l'analisi delle immagini sono stati poi condotti utilizzando la Mantra Workstation con la libreria spettrale generata utilizzando il software inForm Image Analysis per differenziare i 4 tipi di cellule immunitarie nel campione di endometrio (Figura 2).
Quattro tipi di cellule immunitarie endometriali possono essere identificati in campioni di endometrio umano utilizzando questa tecnica di colorazione multiplex: cellule T CD3 +, cellule B CD20 +, macrofagi CD68 + e cellule uNK CD56 + (Figura 3). Tuttavia, l'interferenza fluoroforica deve essere attentamente considerata per ottenere un'immagine chiara e utilizzabile. Sebbene questa tecnologia multispettrale che utilizza la Mantra Workstation possa supportare fino a 8-plex, l'applicazione dei 4 fluorofori utilizzati in questo protocollo ha dimostrato prestazioni ottimali senza interferenze fluoroforiche dovute alle differenze negli spettri di emissione dei fluorofori. Al contrario, la colorazione multiplex che coinvolge 5-8 fluorofori spesso richiede maggiore attenzione verso l'interferenza fluoroforica derivante dall'emittanza dalle lunghezze d'onda condivise.
Per superare questo inconveniente, la colorazione monoplex sarebbe necessaria per determinare l'ordine di ciascun anticorpo nel multiplex e identificare il livello di espressione e il modello di ciascun marcatore immunitario nel campione di endometrio. Questo può aiutare a determinare la sequenza di colorazione dei marcatori e i loro accoppiamenti di fluorofori TSA associati. Una volta completato il test monoplex per determinare l'ordine degli anticorpi da applicare, il passo successivo sarà quello di selezionare il fluoroforo per il rilevamento dopo la colorazione multiplex. Un fluoroforo unico deve essere scelto per ogni anticorpo di interesse. Il numero relativo a ciascun fluoroforo sarebbe approssimativamente la lunghezza d'onda fluorescente emessa durante l'eccitazione (Tabella 1 e Tabella 2). Un approccio per prevenire l'interferenza del fluoroforo è quello di scegliere coppie di fluorofori con lunghezze d'onda il più lontano possibile l'una dall'altra (specialmente per gli anticorpi co-localizzati). Ciò può aiutare a ridurre l'eccessiva sovrapposizione spettrale e fornire un'immagine nitida e una fenotipizzazione più affidabile. Inoltre, la valutazione meticolosa attivando e disattivando i laser dall'immagine composita multiplex nel software inForm può anche aiutare a riconoscere i modelli di colorazione per ridurre al minimo la saturazione del fluoroforo (Figura 4).
Per l'analisi delle immagini, il numero di cellule CD3+ T, cellule CD20+ B, macrofagi CD68+, cellule CD56+ uNK e cellule stromali nello stroma endometriale (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− e da dapi-macchiati) può essere contato automaticamente utilizzando il software inForm Tissue Finder 14.0 (Figura 5). Ogni densità del tipo di cellule immunitarie è stata espressa in percentuale rispetto al numero totale di cellule stromali (Figura 5). Allo stesso modo, la quantificazione della distribuzione spaziale delle cellule immunitarie endometriali si basava sulla posizione X e Y di ogni singola cellula immunitaria ottenuta dal sistema InForm (Figura 6). Utilizzando il linguaggio R, è quindi possibile distinguere il livello di raggruppamento di diverse coppie di cellule immunitarie in base all'AUC.
Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro di colorazione. Abbreviazioni: BSA = albumina sierica bovina; HRP = perossidasi di rafano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Workstation per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) immagine spettrale non elaborata, (C) immagine composita, (D) segmentazione tissutale (compartimenti epiteliali e stromali), (E) immagine composita del tessuto endometrio che mostra quattro marcatori colorati per identificare diverse popolazioni cellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging spettrale. L'immunocolorazione multiplex di 4 diversi tipi di cellule immunitarie è stata eseguita sulle biopsie endometriali da(A)una donna di controllo fertile e(B)una donna con RM inspiegabile presentata come singola imaging multispettrale. A seguito della produzione di una libreria monocolore, lo smixing spettrale potrebbe rivelare l'imaging di singoli fluorofori che rappresentano (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. È stata quindi creata un'immagine composita incorporando tutti i fluorofori dopo l'imaging multispettrale (H). Barre di scala = 50 μm (A, B). Abbreviazioni: LE = epitelio luminale; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; RM = aborto spontaneo ricorrente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Strumento InForm Counts. Lo strumento conteggio software inForm si attiva selezionando l'icona della casella beige (indicata da ↓). (A) Preparazione dell'immagine, (B, C) segmentazione del tessuto per l'allenamento e l'automazione disegnati a mano, (D) segmentazione delle singole cellule, (E) fenotipizzazione delle cellule in base all'intensità del fluoroforo, (F) analisi per l'intensità del fluoroforo (la casella rossa che mostra il numero di cellule positive nell'intensità del fluoroforo selezionata) e (G) esportazione dei risultati per l'uso (la casella rossa indica le opzioni di esportazione). Abbreviazione: IHC = immunoistochimico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conteggio delle cellule. (A) Fenotipizzazione delle cellule per il conteggio automatico delle cellule e (B) output delle cellule macchiate positivamente nella regione segmentata (ad esempio, stromale) per ulteriori confronti e analisi statistiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Misurazione della densità spaziale. (A) Rilevamento automatico della posizione delle cellule immunitarie macchiate positivamente nella regione segmentata (ad esempio, stromale), (B) visualizzazione in uscita della coordinata di ciascuna cellula immunitaria CD20+ macchiata positivamente e (C) determinazione della densità spaziale e localizzazione tra cellule CD20+ e altre cellule immunitarie nelle regioni tissutali segmentate utilizzando Spatstat. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ordine | Anticorpo | Clone | Clonalità | Fattore di diluizione anticorpale | Opali | Fattore di diluizione opale |
| 1 | CD3 · | SP7 · | Monoclonale | 1 su 100 | Opale 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 · | L26 · | Monoclonale | 1 su 100 | Opale 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 · | SP251 · | Monoclonale | 1 su 100 | Opale 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 · | CD564 · | Monoclonale | 1 su 100 | Opale 690 | 0.111111111 |
Tabella 1: Elenco di anticorpi, cloni e concentrazioni utilizzate.
| Tingere | Eccitazione massima (nm) | Emissione massima (nm) | Rilevamento previsto nel set di filtri (nome) | Colore previsto |
| DAPI · | 350 | 470 | DAPI · | Blu |
| Opale 520 | 494 | 525 | FITC · | Verde |
| Opale 620 | 588 | 616 | Cy3 e Texas Red | Ambra |
| Opale 650 | 627 | 650 | Texas Red e Cy5 | Arancia |
| Opale 690 | 676 | 694 | Texas Red e Cy5 | Chiaro |
Tabella 2: Elenco dei fluorofori con le loro lunghezze d'onda massime di eccitazione ed emissione, rilevamento previsto in set di filtri appropriati e colori osservabili.
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Discussion
Passaggi critici all'interno del protocollo
È importante notare che la colorazione multiplex richiede un'ottimizzazione diligente. Il recupero dell'antigene, utilizzando il tampone citrato e la tecnologia a microonde, richiede l'ottimizzazione per garantire la completa rimozione degli anticorpi e mantenere la vitalità dei tessuti. Poiché i reagenti TSA si legano covalentemente ai siti che circondano l'antigene, possono potenzialmente inibire il legame di un successivo anticorpo primario attraverso l'ostacolo sterico (noto anche come "effetto ombrello"). Ciò tende a verificarsi quando più marcatori immunitari risiedono in un compartimento cellulare singolo e causano interferenze fluoroforiche. Per identificare se ci sarà un effetto, sarebbe fondamentale eseguire in anticipo IHC / IF monoplex per identificare eventuali sovrapposizioni nella localizzazione delle cellule immunitarie. Poiché la colorazione a campione singolo sarebbe necessaria per generare la libreria spettrale, le librerie di spettri convalidate possono facilitare la discriminazione dei singoli segnali per prevenire ulteriormente l'interferenza del fluoroforo. Se necessario, le concentrazioni di anticorpi primari e i tempi di incubazione, l'accoppiamento fluoroforo-anticorpo, le concentrazioni di fluoroforo TSA e l'ordine di colorazione possono essere modificati per ridurre al minimo l'interferenza fluoroforica. Allo stesso modo, è importante bilanciare correttamente le concentrazioni di HRP al fine di prevenire la formazione di dimeri TSA. Ciò può essere ottenuto mediante la titolazione di anticorpi primari e secondari. Inoltre, è di vitale importanza ricordare che le concentrazioni e i tempi di incubazione degli anticorpi primari utilizzati per la colorazione multiplex possono variare da quelli utilizzati nella colorazione singola cromogenica convenzionale. Pertanto, la determinazione della concentrazione e dell'ordine degli anticorpi da applicare per la colorazione multiplex deve essere effettuata in anticipo.
Modifiche e risoluzione dei problemi
In questo studio, abbiamo impiegato la colorazione immunoistochimica a fluorescenza multiplex per rilevare contemporaneamente l'interazione di quattro principali tipi di cellule immunitarie nelle biopsie dell'endometrio da donne con e senza RM. Questa tecnica utilizza anticorpi contro CD3 per le cellule T, CD20 per le cellule B, CD68 per i macrofagi e CD56 per le cellule uNK per distinguere tra questi tipi di cellule. Sulla base di questo metodo, abbiamo scoperto che i valori mediani di densità cellulareCD3+,CD68+ e CD56 + nelle donne RM erano significativamente più alti di quelli dei controlli fertili15. Il raggruppamento tra cellule CD56+ uNK e macrofagi CD68+ era significativamente più alto nel gruppo RM rispetto ai controlli fertili. Inoltre, l'uso di questo metodo ha rivelato che le cellule CD56+ uNK sembravano avere una correlazione sia numerica che spaziale con i macrofagi CD68+ in entrambi i gruppi di donne. Al contrario, le cellule CD56+ uNK hanno una correlazione numerica significativa ma non spaziale con le cellule CD3+ T nelle donne con RM15. Questo metodo determina anche la relazione spaziale di più tipi di cellule immunitarie nell'endometrio. Tuttavia, la positività per un marcatore specifico può essere borderline in alcuni casi. Per superare questo problema, è consigliabile includere un controllo positivo e un controllo negativo per determinare la soglia di positività durante la costruzione della libreria spettrale. Inoltre, la valutazione meticolosa attivando e disattivando i laser dall'immagine composita multiplex nel software inForm può anche aiutare a riconoscere i modelli di colorazione per ridurre al minimo la saturazione del fluoroforo.
Limitazioni della tecnica
L'identificazione dell'interferenza fluoroforica durante l'interpretazione dei dati è essenziale per distinguere tra la colocalizzazione genuina dei marcatori e gli artefatti non miscelanti. Questa metodologia di colorazione multiplex utilizza reagenti basati su TSA guidati dall'amplificazione enzimatica, che possono aumentare l'intensità del marcatore antigenico di 10-100 volte rispetto ai metodi IF indiretti convenzionali. Ciò genera un rischio di deposizione iperattiva di tiroamide, potenzialmente con conseguente effetto ombrello e / o sanguinamento del segnale. Per identificare la sovracolorazione, i livelli del segnale possono essere valutati visivamente dismixando le immagini in inForm e passando il cursore su aree luminose e positive in un'immagine di tessuto multiplex. I livelli del segnale dovrebbero di solito rimanere al di sotto di 30 e idealmente entro un fattore 3 l'uno dall'altro, in particolare per i fluorofori spettralmente adiacenti. Oltre 5 volte le differenze nei segnali per i fluorofori spettralmente adiacenti possono portare a interferenze fluorofore e causare artefatti non miscelanti. Se i livelli di segnale di qualsiasi fluoroforo mostrano oltre 3 volte la differenza dal fluoroforo adiacente, le concentrazioni di fluoroforo TSA devono essere regolate per raggiungere l'equilibrio del segnale. Una volta confermato che il segnale si trova nell'intervallo corretto, il rapporto segnale-sfondo deve essere mantenuto a <1:10 per garantire che la colorazione positiva non venga rilevata falsamente dallo sfondo non specifico.
Poiché la diafonia spettrale può anche creare significative interferenze fluoroforiche, l'ordine di colorazione deve essere regolato per separare i coloranti spettralmente adiacenti sia nella sequenza che nell'espressione dei marcatori. Sebbene questa tecnologia multispettrale che utilizza la Mantra Workstation supporti fino a 8 test plex, l'applicazione di 4 fluorofori, ovvero Opal 520, 540, 620 e 690, dimostra le migliori prestazioni senza interferenze fluoroforiche. L'uso di fluorofori ≥5 richiede spesso una maggiore ottimizzazione e convalida per evitare la diafonia spettrale a causa dei profili spettrali dei fluorofori che condividono lunghezze d'onda vicine. In altre parole, il numero di bersagli che possono essere rilevati simultaneamente da questo approccio è limitato solo dal numero di bande di lunghezza d'onda e dai set di filtri di eccitazione/ emissione disponibili. Quindi, per escludere una potenziale sovracolorazione di un fluoroforo TSA che blocca l'ulteriore applicazione di altri fluorofori TSA e/o per identificare la diafonia del segnale, è essenziale essere meticolosi accendendo e spegnendo gli strati dall'immagine composita multiplex nel software inForm; interpretare correttamente i modelli di colorazione della singola colorazione IHC; e alla ricerca di evidenti perdite, guadagni o segnali identici in un piano corrispondente alla localizzazione in un altro piano.
La colorazione multispettrale richiede anticorpi abbinati a fluorofori specifici per rilevare contemporaneamente più marcatori. Questo accoppiamento fluoroforo-anticorpo segue due regole: i) i fluorofori assegnati per i marcatori co-espressi dovrebbero essere spettralmente separati e ii) i bersagli più abbondanti dovrebbero essere accoppiati con fluorofori con luminosità inferiore o viceversa. Anche l'ordine di colorazione deve essere organizzato in modo che gli anticorpi sequenziali non co-localizzino negli stessi compartimenti cellulari nelle cellule colorate. Pertanto, oltre alle concentrazioni di anticorpi e ai tempi di incubazione, che sono fattori critici nei metodi di colorazione convenzionali, parametri aggiuntivi, come l'appropriato accoppiamento fluoroforo-anticorpo, le concentrazioni di fluoroforo TSA, la sequenza di colorazione e l'esposizione di un anticorpo specifico a uno o più trattamenti a microonde, devono essere considerati per una colorazione multiplex di successo. A causa dell'elevata variabilità nei campioni di studio, un determinato protocollo multiplex potrebbe non generare lo stesso risultato in altri tipi di campioni di studio.
L'intero processo di colorazione sequenziale multiplex opale può richiedere da uno a diversi giorni a seconda del numero di marcatori coinvolti nel pannello e dei tempi di incubazione degli anticorpi primari. Al contrario, i metodi IF standard in genere consentono la visualizzazione di 4-5 marcatori in un singolo ciclo di colorazione. Va notato che le condizioni ottimizzate utilizzando il metodo IHC convenzionale necessitano di un'ulteriore ottimizzazione prima di procedere alle procedure di colorazione multiplex, che comportano ulteriori trattamenti a microonde multipli e l'applicazione di fluorofori TSA che alla fine influenzeranno l'intensità della colorazione di ciascun anticorpo. Attualmente, gli approcci di imaging che utilizzano tecnologie multispettrali possono richiedere strumentazione costosa e dedicata. Inoltre, può essere limitato solo alle regioni di interesse selezionate dall'immagine. Quindi, questo potrebbe non essere ottimale per i laboratori con risorse limitate e lo scouting di tessuti con bersagli antigenici incerti.
Importanza rispetto ai metodi esistenti
Un particolare punto di forza di questo metodo attuale è la capacità di misurare la densità di più tipi di cellule immunitarie nell'endometrio contemporaneamente a differenza dei metodi IHC convenzionali che possono etichettare solo uno o due tipi di cellule in una singola sezione di tessuto. La citometria a flusso è un altro metodo in grado di analizzare le proporzioni relative di diversi tipi di cellule immunitarie nel campione endometriale; tuttavia, non sarebbe in grado di fornire informazioni spaziali tra vari tipi di cellule immunitarie e la distribuzione specifica all'interno di diversi compartimenti endometriali. Inoltre, l'esaurimento dei tessuti è una seria preoccupazione nella pratica clinica, specialmente durante gli studi clinici e quando si utilizzano campioni di biopsia. Questi due metodi convenzionali richiederebbero un gran numero di campioni (sezioni o cellule) per ottimizzare la procedura e per rilevare più tipi di cellule immunitarie nell'endometrio delle donne con e senza RM.
Come descritto in questo protocollo, il flusso di lavoro Opal è progettato per il rilevamento di un massimo di sette marcatori nella stessa sezione di tessuto utilizzando la Mantra Workstation. Inoltre, la cross-reattività delle specie durante la selezione degli anticorpi non è una limitazione di questa tecnologia. In effetti, un vantaggio di questa tecnologia è che consente l'uso di anticorpi allevati nella stessa specie per rilevare fino a sette marcatori. Questo approccio prevede il rilevamento con reagenti fluorescenti TSA seguiti da un trattamento a microonde per rimuovere qualsiasi colorazione non specifica. Dopo lo stripping a base di microonde, è possibile eseguire un altro ciclo di colorazione per un ulteriore rilevamento del bersaglio senza il rischio di cross-reattività anticorpale. Inoltre, questo metodo di rilevamento TSA può essere eseguito in un minimo di 3 giorni per combinare fino a 7 fluorocromi pur producendo risultati affidabili per il rilevamento di bersagli proteici a bassa espressione. Un altro vantaggio della colorazione multiplex rispetto al tradizionale studio IHC è la sua maggiore efficienza in quanto la misurazione è automatizzata, il che può eliminare i pregiudizi soggettivi. I dati quantitativi generati rappresentano i risultati finali del test.
Applicazioni future
La gamma di applicazione di questo protocollo multiplex è immensa. È importante sottolineare che questo è il primo documento a descrivere il metodo per il rilevamento dell'espressione di marcatori di immunofluorescenza multiplexed utilizzando la Mantra Workstation e l'analisi delle immagini utilizzando il software InForm 2.2.1 per fornire risultati accurati e riproducibili nella differenziazione di più popolazioni di cellule immunitarie nelle donne con e senza RM. È importante sottolineare che la localizzazione di più bersagli nella stessa sezione di tessuto può fornire una visione unica delle loro interazioni cellulari. In definitiva, questo porterà a una migliore comprensione del microambiente delle cellule immunitarie durante l'impianto dell'embrione nelle donne con RM per stabilire un trattamento mirato specifico.
Inoltre, i nostri metodi attuali hanno contribuito a dimostrare che diverse cellule immunitarie e le loro interazioni possono essere importanti per la funzione dell'endometrio. Ciò è dimostrato dai cambiamenti significativi nella densità di tre tipi di cellule immunitarie endometriali su quattro e da un aumento significativo del clustering tra cellule CD68+ e CD56+. Al contrario, le interazioni anomale di questi tipi di cellule immunitarie possono essere fattori predisponenti per RM. È importante sottolineare che, a differenza del rilevamento di un singolo sottotipo di cellule immunitarie endometriali, l'applicazione di questa colorazione IHC multiplex può fornire una comprensione approfondita della regolazione immunologica dell'impianto embrionale. Inoltre, la quantificazione e l'ulteriore comprensione delle caratteristiche spaziali nel microambiente immunitario possono aiutare a far luce sulla biologia di questa malattia nel contesto delle immunoterapie.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dall'Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund nel 2018 e dall'Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
