Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודל דימום טרנסקציה של וריד זנב בהמופיליה מורדמת לחלוטין עכברים

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

מודל הדימום של זנב זנב מעודן (TVT) בעכברים מורדמים הוא שיטת in vivo רגישה להערכת דימום המופילי. מודל דימום TVT ממוטב זה משתמש באובדן דם ובזמן דימום כנקודות קצה, תוך זיקוק מודלים אחרים והימנעות ממוות כנקודת קצה.

Abstract

מודלים של דימום זנב הם כלים חשובים בחקר המופיליה, במיוחד להערכת השפעות פרו-קרישיות. מודל ההישרדות של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) הועדף במסגרות רבות בשל רגישות למינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של FVIII, בעוד שמודלים מבוססים אחרים, כגון מודל קליפ הזנב, דורשים רמות גבוהות יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות. כדי להימנע משימוש בהישרדות כנקודת קצה, פיתחנו מודל TVT המבסס איבוד דם וזמן דימום כנקודות קצה והרדמה מלאה במהלך הניסוי כולו. בקצרה, עכברים מורדמים ממוקמים כאשר הזנב שקוע במי מלח ממוזגים (37 מעלות צלזיוס) ומנונים עם תרכובת הבדיקה בווריד הזנב הצדדי הימני. לאחר 5 דקות, וריד הזנב הצדדי השמאלי עובר טרנסקט באמצעות מדריך תבנית, הזנב מוחזר למלח, וכל פרקי הדימום מנוטרים ומתועדים במשך 40 דקות תוך כדי איסוף הדם. אם לא מתרחש דימום במשך 10 דקות, 20 דקות או 30 דקות לאחר הפציעה, הקריש מאותגר בעדינות על ידי ניגוב החתך פעמיים עם ספוגית גזה רטובה. לאחר 40 דקות, איבוד הדם מכמת על ידי כמות המוגלובין שמדמם לתוך המלח. הליך מהיר ופשוט יחסית זה גורם לדימומים עקביים הניתנים לשחזור. בהשוואה למודל ההישרדות של TVT, הוא משתמש בהליך הומני יותר מבלי לפגוע ברגישות להתערבות פרמקולוגית. יתר על כן, ניתן להשתמש בשני המינים, מה שמקטין את המספר הכולל של בעלי החיים שיש לגדל, תוך שמירה על עקרונות ה-3R's. מגבלה פוטנציאלית במודלים של דימום היא האופי הסטוכסטי של המוסטזיס, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול של המודל. כדי להתמודד עם זה, הפרעה ידנית לקריש מוודאת שהקריש מאותגר במהלך הניטור, ומונעת מהמוסטזיס ראשוני (טסיות דם) לעצור את הדימום. תוספת זו לקטלוג מודלים של פציעה מדממת מספקת אפשרות לאפיין השפעות פרו-קרישיות באופן סטנדרטי והומני.

Introduction

מודלים של בעלי חיים חיוניים להבנת הפתוגנזה של המופיליה ולפיתוח ובדיקה של משטרי טיפול וטיפולים. עכבר הנוק-אאוט פקטור VIII (F8-KO) הוא מודל נפוץ לחקר המופיליה A 1,2. עכברים אלה מסכמים תכונות מרכזיות של המחלה ונמצאים בשימוש נרחב לפיתוח טיפולים, כגון מוצרי FVIII רקומביננטיים 3,4,5 ואסטרטגיות ריפויגנטי 6,7.

ישנם מודלים שונים של פציעת דימום להערכת ההשפעות הפרמקולוגיות של תרכובות המוסטטיות שונות in vivo. אחד ממודלים אלה של קרישה הוא מודל ההישרדות של טרנסאקציה של ורידי זנב בעכברים 8,9,10,11,12,13,14, המודד את יכולתם של עכברים המופיליים לשרוד אקסנגווינציה לאחר טרנסקציה של הזנב. שיטה זו הוצגה לפני יותר מארבעה עשורים לפני15 ועדיין נעשה בה שימוש 9,16,17. עם זאת, המודל מנצל את ההישרדות כנקודת קצה ודורש תצפית על בעלי החיים במשך תקופה של עד 24 שעות, שבמהלכה בעלי החיים בהכרה ולכן יכולים לחוות כאב ומצוקה.

מודלים של דימום של משך זמן קצר יותר ותחת הרדמה מלאה תוארו בעבר, כגון מודל קליפ הזנב (הידוע גם בשם קצה הזנב)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . עם זאת, לצורך נורמליזציה מלאה של אובדן הדם לאחר אתגר הדימום, מודלים אלה דורשים מינונים של תרכובות פרו-קרישיות (למשל, FVIII) גבוהות בהרבה מאלו שניתנו קלינית29. מודל פציעה אחר בהרדמה, שיטת הדימום של הווריד saphena, רגיש למינונים נמוכים יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות30 אך דורש רמה גבוהה של התערבות נסיינית מכיוון שיש לשבש את הקרישים לעתים קרובות (בניגוד ל-3 פעמים במודל המוצג).

סטנדרטיזציה לקראת פרוטוקול משותף לבדיקת תרכובות פרוקו-קרישיות חדשות תקל מאוד על השוואת נתונים בין מעבדות 31,32,33. במודלים של TVT, אין עדיין הסכמה משותפת על נקודות קצה שנחקרו (איבוד דם 7,26, זמן דימום 9,34 ושיעור הישרדות35,36), ואורך הניסוי משתנה בין מחקרים13.

המטרה העיקרית שלנו היא לתאר ולאפיין מודל אופטימלי עם יכולת שכפול גבוהה, את האפשרות ללמוד לפי דרישה כמו גם טיפול מניעתי, רגישות להתערבות פרמקולוגית המקבילה למודל ההישרדות, אך לא להשתמש במוות או כמעט מוות כנקודות קצה. על מנת להפחית את הכאב והמצוקה, בעלי החיים לא צריכים להיות בהכרה במהלך הדימום ויש ליישם נקודת קצה אתית יותר37.

דגמי קליפס זנב נערכים בדרך כלל באחת משתי גרסאות, או קטיעת קצה הזנב, למשל, קטיעה של 1-5 מ"מ 18,19,20,20,21,23,24 או, בגרסה חמורה יותר, קטיעת קוטר זנב סביב 1-3 מ"מ 8,22,25 . זה גורם לדימום עורקי משולב, שכן הוורידים הצדדיים והגבריים והעורק הגחוני מנותקים בדרך כלל, ובאופן כללי, ככל שהקטיעה גדולה יותר, כך הרגישות לתרכובת פרוקו-קרישית נמוכה יותר. יתר על כן, מכיוון שקצה הזנב נקטע, הפגיעה העורקית נחשפת ללא כל רקמה מנוגדת; לכן, לפחות בתיאוריה, הוא שונה מהדימומים ההמופיליים הנפוצים ביותר.

כפי שהשם מרמז, רק הווריד נפגע במודלים של טרנסקציה של וריד זנב כמו המתואר במאמר זה, וכתוצאה מכך נוצר דימום ורידי בלבד. מכיוון שהכלי אינו מנותק לחלוטין, הפציעה צפויה להיות קטנה יותר מאשר במודלי הקטיעה, והרקמה סביב החתך, שקריש עשוי לדבוק בה, נשמרת. בנוסף, יש לחץ דם נמוך יותר בווריד לעומת העורק. גורמים אלה תורמים לרגישות מוגברת ביחס למודלים של קטיעה, כך שניתן להשיג נורמליזציה של דימום עם מינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של טיפול חלופי, למשל, עם rFVIII בהמופיליה A, אשר שימושי להערכת הגודל והעמידות של ההשפעות של טיפול פרוקו-קרישי 26,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הגוף לרווחת בעלי חיים ב- Novo Nordisk A/S, והפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים, משרד המזון, החקלאות והדיג הדני. שיטת 40 הדקות הממוטבת כוללת הרדמה וזמן מינון בתכנון (איור 1). עכברים המופיליים משני המינים בין 10-16 שבועות נדרשים להליך זה.

1. הכנות לפני המחקר

  1. הכן את פתרונות המינון בריכוזים הנכונים.
  2. התחילו את אמבט המים וחממו עד 37 מעלות צלזיוס. מלאו את צינורות הצנטריפוגה של 15 מ"ל לאיסוף דם במי מלח (0.9% NaCl).
  3. מניחים את צינורות המלח של 15 מ"ל בחורים בלוח הבסיס המחומם לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי.
  4. זהה את העכברים ותעד את משקלם. הימנעו מטיפול בעכברים יותר מהנדרש מכיוון שהדבר עלול לגרום ללחץ ולהשפיע על המחקר.
  5. הכינו את תחנת העבודה במכסה האדים לפני שתמשיכו כך שהכל יהיה בהישג יד: מפיות, מחזיק זנב, גזה, מזרקים, אזמלים, שעוני עצר ונייר סימון זרימת דם.
  6. מניחים את סימן הזנב וחותכים בלוקים על צלחת החימום - בלוקים קרים יגרמו לוורידים להתכווץ ובכך להשפיע על הדימום.

2. הרדמה

  1. לבצע את הליך ההרדמה איזופלורן בתוך מכסה אדים.
  2. הגדר את מכשיר אידוי הגז ל-5% איזופלורן בתחילה ב-30% O2/70% N2O בתא ההרדמה עם זרימה של 1 ליטר לדקה. אפשר מספיק זמן עד שתא ההרדמה יתמלא (כ-5 דקות בהתאם לנפח התא ולקצב זרימת הגז). הקפידו על אינדוקציה מהירה (פחות מדקה אחת).
  3. מניחים את העכברים בתא ההרדמה עד שהם מאבדים את הכרתם.
    הערה: זה אמור להתרחש תוך דקה או פחות אם החדר מלא מספיק.
  4. הבטיחו הרדמה נכונה על ידי היעדר תגובה כואבת לרפלקס הדוושה (צביטה חזקה בבוהן).
  5. הניחו את העכברים על צלחת החימום, וודאו שהאף נמצא בקונוס האף.
  6. הפחיתו את ההרדמה לרמת תחזוקה של 2% איזופלורן ב-30% O2/70% N2O והניחו כיסוי פלסטיק מעל העכברים כדי להפחית את אובדן החום. יש למרוח משחה מתאימה לעיניים כדי למנוע יובש בהרדמה.
  7. סמן את הזנב בקוטר של 2.5 מ"מ באמצעות בלוק סימן הזנב. אל תכריחו את הזנב לתוך החריץ שבגוש - הוא חייב להתאים בנוחות (איור משלים 1)
  8. מניחים את הזנב בצינור המלוח למשך 5 דקות לפחות כדי להבטיח וריד זנב חם האופטימלי למינון תוך ורידי (כלומר).

3. מינון של פתרון בדיקה

  1. מניחים עכבר אחד במחזיק הזנב עם האף במסכת הרדמה.
  2. מנה את החיה עם תרכובת העניין (במקרה זה, rFVIII) ומיד להפעיל את שעון העצר (t = 0).
  3. הניחו את העכבר בחזרה על צלחת החימום עם הזנב בצינור המלוח. חזור על ההליך עם העכברים האחרים.

4. ביצוע טרנסקציה של ורידים בזנב

  1. בצע את הטרנסקציה של וריד הזנב בדיוק 5 דקות לאחר המינון. מניחים את הזנב בבלוק החיתוך ומסובבים 90° כדי לחשוף את הווריד (איור משלים 2).
  2. בצעו את החתך בצד הנגדי/וריד שממנו הונחה תמיסת הבדיקה.
  3. ציירו את להב האזמל מספר 11 דרך החריץ של גוש החיתוך המחזיק את הזנב כדי ליצור דימום. אפס את שעון העצר והחזיר את הזנב מיד למלח.

5. זמן תצפית ואתגרים

  1. שימו לב לדימום וביארו את ההתחלה והעצירה של הדימום במשך 40 דקות; לבאר אותו על נייר סימון זרימת הדם.
    הערה: הערכה חזותית זו של דימום עשויה להשתנות מעט עקב הסובייקטיביות.
  2. הדימום הראשוני חייב להיפסק תוך 3 דקות לאחר ביצוע החתך. אם זה לא המקרה, לפסול את העכבר, להרדים ולהחליף (אי עצירת הדימום הראשוני יכול להצביע על פציעה חמורה מדי או היעדר המוסטזיס ראשוני, כמו בעכברי vWF KO).
  3. אם אין דימום ב-10 דקות, 20 דקות ו-30 דקות לאחר הפציעה, קראו תיגר על חתך הזנב כמתואר בשלבים 4-5.
  4. השתמשו במטוש גזה ספוג במי מלח חמים מצינור נפרד שנשמר באמבט המים. הרימו את הזנב מתוך המלוח ונגבו ברכות פעמיים עם הגזה הרטובה בכיוון דיסטלי מעל חתך הזנב.
  5. לאחר כל אתגר, מיד להטביע מחדש את הזנב לתוך צינור מלוח שוב.
  6. בשעה 40 דקות, עצרו את איסוף הדם על ידי הסרת הזנב מהצינור המלוח.

6. דגימת דם

  1. לאחר t = 40 דקות, קבל דגימות דם מהווריד הסופראורביטלי.

7. המתת חסד

  1. להרדים את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם בעודם עדיין בהרדמה מלאה.

8. טיפול בדגימות

  1. צנטריפוגה צינורות איסוף הדם 15 מ"ל עם מלח ב 4000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. השליכו את הסופרנאטנט מצינורות ה-15 מ"ל, החזירו את הכדור ב-2-14 מ"ל של תמיסת ליסינג אריתרוציטים (RBC), ואז דיללו אותה עד שתגיע לצבע קפה בהיר.
  3. שים לב לנפח הכולל (נפח הדם + נפח של אריתרוציטים (RBC) תמיסת שינון שנוספו באמצעות סימני הסיום על הצינור).
  4. מעבירים 2 מ"ל של הדילול לצינור המוגלובין ומכניסים אותו למקרר עד לניתוח ההמוגלובין.
  5. קבע את אובדן הדם על ידי מדידת ריכוז ההמוגלובין במי מלח. מדוד את הספיגה ב- 550 ננומטר על קורא מיקרו-פלטה (טבלת חומרים).
  6. המר את הספיגה להמוגלובין nmol באמצעות עקומה סטנדרטית שהוכנה מהמוגלובין אנושי (טבלת חומרים) ונכונה לדילול עם תמיסת ליסינג RBC.

9. ניתוחים סטטיסטיים

  1. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. כאן נעשה שימוש בתוכנת פריזמה GraphPad. על פני מגוון מחקרים, השיטות הסטטיסטיות הבאות נמצאו כבעלות ביצועים טובים.
    הערה: כדי לנתח אובדן דם, זמן דימום, חשיפה, ספירת טסיות דם והמטוקריט; נעשה שימוש במבחן בראון-פורסייט ו-ANOVA וולש, (מכיוון שהנתונים היו רציפים אך ללא הומוגניות שונות של השאריות) תוך יישום המבחן של דאנט כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. בדיקה של פירסון שימשה לבדיקת קורלציות בין זמן הדימום, איבוד הדם והמינונים. כדי לקבוע ערכי ED50 , משוואת תגובה של ארבעה פרמטרים של יומן הפוך (מינון) הותאמה לנתוני דימום ואיבוד דם. כדי לנתח את האפקט המגדרי, נעשה שימוש במבחן ANOVA דו-כיווני, תוך יישום תיקון בונפרוני כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. רמת המובהקות הוגדרה כ-P < 0.05. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להעריך את הישימות של המודל הממוטב, בוצע מחקר בעכברי F8-KO (רקע גנטי C57BL) שניתנו עם טיפול חלופי של גורם רקומביננטי VIII הזמין מסחרית (rFVIII); נבדקו ארבעה מינונים שונים: 1 IU/kg, 5 IU/kg, 10 IU/kg ו-20 IU/kg. יתר על כן, בדקנו את בקרת הרכב המתאימה (שלילית) בעכברי F8-KO ובקבוצות מסוג פרא (WT) תוך שימוש בעכברי C57BL כקבוצת ביקורת חיובית כדי להעריך את טווח התגובה בדגם.

בעקבות הפרוטוקול הממוטב, חלה ירידה משמעותית באיבוד הדם עבור קבוצות טיפול rFVIII בהשוואה לקבוצת הרכב. בנוסף, נצפתה ירידה בזמן הדימום ב-5 קבוצות טיפול של יב"ל/ק"ג, 10 יחב"ל/ק"ג ו-20 קבוצות טיפול ביב"א/ק"ג בהשוואה לקבוצת הרכב (איור 2). בעכברי WT, אובדן הדם הכולל נע בין 201.8-841.9 ננומול Hgb (95% CI) ובעכברי הרכב נע בין 5335 ל-7148 ננומול Hgb (95% CI). לאחר שקילות משוערת של 1000 ננומטר Hgb ~ 125 μL של דם שלם, הדימום הממוצע בעכברים שטופלו ברכב היה 780.25 μL, בעוד בקבוצת 20 IU / kg היה 89.95 μL. לפיכך, מינון של 20 יחב"ל/ק"ג נרמל לחלוטין את הדימום, ומתן של 10 יחב"ל/ק"ג גרם להשפעה משמעותית, והפחית את אובדן הדם כמעט עד לגבול העליון של טווח ה-WT (איור 3). זמן הדימום של עכברי WT נע בין 0.98-9.16 דקות (95% CI), ורמות המינון של 10 יחב"ל/ק"ג ו-20 יחב"ל/ק"ג הפחיתו את זמן הדימום לטווח זה. מתאם חזק בין איבוד דם לזמן דימום נצפה בנתונים המשולבים (r = 0.9357, P < 0.0001) (איור 4).

כדי להעריך את הרגישות של המודל, הותקנה משוואת תגובה הפוכה בת ארבעה פרמטרים של לוג(מינון) לתצפיות אובדן דם וזמן דימום, ונצפתה השפעה ברורה של מתן rFVIII על מתן rFVIII על אובדן הדם ועל זמן הדימום (איור 3). ערכי ה-ED50 המשוערים לאיבוד דם וזמן דימום היו 2.41 ±-1.69 יחב"ל/ק"ג ו-2.55 ±-2.80 יחב"ל/ק"ג, בהתאמה.

כדי להמחיש כיצד מתרחש דימום במודל, כל פרקי הדימום המתועדים תוכננו כדי לספק הדמיה של אורך ומספר הדימומים עבור כל עכבר בנפרד (איור 5). הדימום הראשוני דומה מאוד בכל הקבוצות. רוב קבוצת הרכב ההמופילית מתחילה לדמם מחדש לפני האתגר השני ב-20 דקות, ובמשך כמחצית מהחיות הללו, הדימום אינו נעצר לאחר האתגר הראשון. לבסוף, כפי שתואר, טיפול rFVIII הפחית את אורך אפיזודות הדימום בעכברי F8-KO שטופלו בהשוואה לרכב, עם שינוי שכבר ניתן היה להבחין בו במינון הנמוך ביותר. ברמות המינון הגבוהות ביותר, רוב העכברים דיממו רק לזמן קצר לאחר שאותגרו.

ריכוז ה-rFVIII בפלזמה נמדד על-ידי בדיקת תיעול חמצן זוהרת (LOCI) שגילתה hFVIII ואנלוגיות כדי לוודא שההשפעה שנצפתה בהפחתת איבוד הדם וזמן הדימום הייתה תלוית ריכוז (איור 6). יש שונות בתוך כל קבוצה (ממוצע CV 46%), אבל עדיין, הבדלים משמעותיים בין קבוצות ניתן לראות, ובכך מאשש כי ההשפעה שנצפתה באיבוד דם וזמן דימום תלויה בריכוז הפלזמה של FVIII. כל העכברים שטופלו ברכב נמדדים מתחת לגבול הנמוך יותר של הכמות עבור הבדיקה (2 U/L) והם מיוצגים עם ערך זה. עכברי WT לא נמדדו מכיוון שבדיקת FVIII המיושמת היא ספציפית לגילוי FVIII אנושי.

ספירות טסיות הדם וההמטוקריט נקבעו עבור כל הקבוצות באמצעות דגימות הדם שנאספו לאחר הדימום (איור 7 ונמדדו באמצעות מנתח המטולוגי (טבלת חומרים). לא הייתה שונות בין קבוצות בספירת הטסיות, מה שמצביע על כך שמספרי הטסיות אינם מושפעים, ולכן העכברים נשארים מסוגלים להמוסטאזיס ראשוני. במדידות המטוקריטים נצפו רמות נורמליות בבעלי חיים שקיבלו מינוני FVIII בינוניים וגבוהים יותר (5 IU/kg, 10 IU/kg ו-20 IU/kg), בעוד שרמות נמוכות משמעותית נצפו ברכב ו-1 קבוצות טיפול ב-IU/kg (בהשוואה לחיות WT). זוהי תצפית תכופה בבעלי חיים המופיליים לאחר דימום כבד.

באופן קלאסי, רק מין אחד של בעלי חיים (בדרך כלל זכר) שימש במחקרים בבעלי חיים, וזה מתואר גם עבור מודלים הישרדות TVT 8,9,11,12. בשאיפה להפחית את המספר הכולל של עכברים המופיליים הדרושים במחקרים עתידיים (לרבייה ולמחקר), נעשה שימוש בשני המינים. כדי להעריך את ההשפעה של מגדר במודל ממוטב זה (איור 8), הן תוצאות אובדן הדם והן תוצאות זמן הדימום היו נתונים לניתוח ANOVA דו-כיווני עם מין ומינון כגורמים. בניתוח זה, ההשפעה של מינון rFVIII הייתה מובהקת סטטיסטית (P < 0.0001), אך מין העכבר לא השפיע באופן משמעותי על התוצאות (P 0.35), ולא נמצאה אינטראקציה משמעותית בין הפרמטרים, מה שמצביע על כך שהתגובות לטיפול לא היו שונות בין המינים.

Figure 1
איור 1: תכנון זמני של מערך הניסוי. השלב שלפני טרנסקציה של וריד הזנב (TVT) כולל אינדוקציה של הרדמה, התחממות הזנב במי מלח ומינון. לאחר פציעת TVT, מבוצעות 40 דקות של ניטור הדימום בהרדמה, עם אתגרים הבאים כל 10 דקות. ההליך הניסויי מסתיים על ידי איסוף דגימות דם והמתת חסד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ההשפעה של rFVIII לאחר מתן תוך ורידי. אובדן דם כולל (פאנל שמאלי) וזמן דימום כולל (פאנל ימני) של עכברי F8-KO. כל עכבר מוצג כתצפיות בודדות ומשמעותו ±-SEM. מינוני הבדיקה השונים של rFVIII מיוצגים בציר x. הנתונים נותחו על ידי בראון-פורסייט ו-Welch ANOVA תוך יישום המבחן של דאנט כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עקומות מינון-תגובה לאובדן דם ולזמן דימום. איבוד דם (לוח שמאלי) וזמן דימום (לוח ימני). השטח האפור מייצג את 95% CI מהערכים של 6 עכברי C57BL/6 שלא טופלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מזימת מתאם לאיבוד דם וזמן דימום. R2 = 0.8755, P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: פרופילי דימום בודדים בעכברים מסוג בר, רכב, 1 IU/kg, 5 IU/kg, 10 IU/kg ו-20 עכברים שטופלו ב-IU/kg rFVIII. כל קו מייצג את פרופיל הדימום של עכבר יחיד, בעוד שכל פס מנוקד מייצג אפיזודה מדממת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: חשיפה ל-rFVIII. ריכוז FVIII בפלזמה נמדד על ידי בדיקת תיעול חמצן זוהרת (LOCI) לזיהוי FVIII אנושי. עכברי רכב היו תחת הגבול התחתון של הכמות (LLOQ) ולכן הותאמו עם ערך ה-LLOQ (2 U/L). חיות WT לא נמדדו מכיוון שבדיקת FVIII המיושמת היא ספציפית לגילוי FVIII אנושי. מינוני הבדיקה השונים של rFVIII ובקרת WT מיוצגים בציר x. ** P < 0.01, *** P < 0.001 ו- **** P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: נתונים המטולוגיים. ספירת טסיות (לוח שמאלי) והמטוקריט (לוח ימני) של עכברי F8-KO מוצגים כמשמעות תצפיות בודדות עם SEM. מינוני הבדיקה השונים של rFVIII ובקרת WT מיוצגים על ציר x. הנתונים נותחו על ידי בראון-פורסייט ו-Welch ANOVA תוך יישום המבחן של דאנט כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. ** P < 0.01 ו- *** P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8. השפעת המגדר. איבוד דם (פאנל שמאלי) וזמן דימום (לוח ימני) המסווגים לפי טיפול מוצגים כתצפיות בודדות עם ממוצע ± SEM. הנתונים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני המיישם את תיקון Bonferroni כדי להתאים להשוואות מרובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זמן דימום ED50 (יב"א/ק"ג) אובדן דם ED50 (IU/kg) הישרדות ED50 (IU/kg)
מודלים בהרדמה מודל טרנסקציה של וריד זנב ממוטב 2.6 ± 2.8 2.4 ± 1.7 לא רלוונטי
Vena saphena model30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 לא רלוונטי
קליפ זנב מתון (L=3 מ"מ)27 לא דווח 4.6 ± 0.5 לא רלוונטי
קליפס זנב מתון (L=4 מ"מ)28 39 28 לא רלוונטי
קליפ זנב מתון (L=4 מ"מ)20 לא דווח 53 לא רלוונטי
מודלים של הישרדות זנב ורידים טרנסקציה הישרדות מודל36 לא דווח לא דווח 58
הישרדות טרנסקציה של וריד זנב מודל10 לא דווח לא דווח 21

טבלה 1:ערכי ED 50 . השוואה בין ערכי ED50 של מודלים שונים של דימום זמין למחקרי המופיליה בעכברים. הנתונים מופקים ממאמרים מצוטטים [הפניות בכתב עילי] ומוצגים כ- ED50 (IU/kg)

איור משלים 1: תבנית מדידה. מיוצר באלומיניום. מפרטי גודל: 20 מ"מ x 40 מ"מ x 10 מ"מ (אורך x רוחב x גובה). חריץ: עומק 2.5 מ"מ ורוחב 2.5 מ"מ; רדיוס 1.25 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תבנית חיתוך. מיוצר מפלדת אל-חלד. מפרטי גודל: 20 מ"מ x 40 מ"מ x 10 מ"מ (אורך x רוחב x גובה). חריץ: עומק 3 מ"מ ורוחב 3 מ"מ; רדיוס 1.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לשיטה אופטימלית זו של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטת ההישרדות של TVT. בעלי החיים מורדמים לחלוטין במשך כל משך המחקר, מה שהופך את הטיפול בעכברים לקל יותר ומגביר את רווחת בעלי החיים. יתר על כן, בניגוד למודל ההישרדות של TVT, אין צורך בתצפית לילה, ומודל מותאם זה מציע את האפשרות למדוד את איבוד הדם ולצפות בזמן הדימום המדויק במשך 40 דקות. כמו כן, תקופות ארוכות יותר של דימום בבעלי חיים בהכרה עלולות לגרום למוות על ידי אקסנגווינציה, מה שמוביל לכאב ולמצוקה אצל בעלי החיים וכנראה ללחץ, מה שעלול לגרום לעלייה בווריאציה14. אובדן דם וזמן דימום אופיינו ואומתו בהצלחה כנקודות קצה, והחליפו את הזמן למוות או כמעט למוות. הפגיעה בפועל בזנב מוגדרת היטב וסטנדרטית מכיוון שהיא משתמשת במדריך בלוק חיתוך כדי לבצע את ה- TVT, מה שמבטיח חתך הניתן לשחזור, ומפחית את הקושי של ההליך ואת השונות הטכנית. לפיכך, ניתן להשיג עמידות גבוהה יותר של המודל, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים. יתר על כן, הנתונים הראו כי ניתן להשתמש בעכברים זכרים ונקבות כאחד, ובכך להפחית את המספר הכולל של בעלי חיים שיש לגדל, בהתאם לעקרונות 3R. יחד עם תצפיות אלה, קיימת מגמה שנקבות עכברים מדממות מעט פחות ומשתנות מעט יותר בקבוצות עם דימום גבוה, אך לא בקבוצות עם דימום נמוך. מדדי איבוד דם נמוכים יותר יכולים להיות קשורים לכך שלנקבות יש גודל קטן יותר, ולכן נפח דם קטן יותר בהשוואה לזכרים בני אותו גיל.

דימומים ספונטניים בחולים המופיליים הם בדרך כלל פנימיים, במיוחד מעורבים בהם שלד-שריר, רקמות רכות ודימום רירית, בעוד שפציעות חיצוניות (כגון חתכים קלים) אינן הגורם השכיח ביותר לדימומים ממושכים, אם כי חתכים חמורים יותר וטראומה עלולים להיות מסכני חייםשל 40,41. מודל אופטימלי זה גורם לדימום ורידי בלבד, בעוד שמודלים אחרים, כגון קליפ הזנב, גורמים לתערובת של דימום עורקי-ורידי. מכיוון שהמודל המתואר הוא מודל ורידי בלבד, ייתכן שאפקט המינון הפרוקו-קרישי במודל TVT זה לא ישקף את ההשפעה בפגיעה חמורה יותר בעורקים; לכן, יש להשתמש במודלים אחרים של דימום אם דימומים כאלה נמצאים במוקד.

כפי שמוצג על ידי פרופיל הדימום האינדיבידואלי, הדימום הראשוני דומה מאוד בכל הקבוצות המציין כי המוסטזיס ראשוני, כלומר צבירה של טסיות דם מופעלות, הוא שלם בהגדרת המופיליה A42. בפציעה משותקת, גם תחת המופיליה חמורה, צבירת טסיות יכולה להספיק כדי להחליש את הדימום. מסיבה זו, באמצעות מחקרים אמפיריים, מצאנו כי גרימת אתגר דימום כל 10 דקות היא צעד הכרחי בפרוטוקול על מנת לשבש אגרגטים של טסיות דם מופעלות, אשר יכול להיות חזק מספיק כדי למנוע דימום גם ללא יצירת פיברין מקרישה תפקודית. מכיוון שעכברים מורדמים לחלוטין אינם זזים ואינם יכולים לאתגר פיזית את הפציעה כפי שהיא מתרחשת במודל ההישרדות של TVT שאינו מורדם, היה צורך להציג את צעדי האתגר כדי למנוע צבירת טסיות לבדה מלחליש דימום. חלק מהעכברים המופיליים שלא טופלו מדממים מחדש באופן ספונטני לפני האתגר, אך לאחר האתגר הראשון, דימומים חוזרים ספונטניים מתרחשים ברוב העכברים ההמופיליים שלא טופלו, ולאחר האתגר השני, רבים מדממים ברציפות עד סוף הניסוי. כצפוי, היה דימום מוגבר בעכברי F8-KO ברכב בהשוואה לעכברי WT. עכברים שטופלו במינונים מוגברים של rFVIII הראו ירידה תלוית מינון הן באובדן הדם והן בזמן הדימום. השפעה משמעותית על הדימום נצפתה במינונים של 5 יחב"ל/ק"ג ומעלה (בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב). שני המינונים הגבוהים ביותר הפחיתו את הדימום לרמות קרובות למדי לתגובת הדימום מסוג פרא, מה שמעיד על נורמליזציה או כמעט נורמליזציה של דימום.

בטבלה 1, אנו מציגים השוואה שלערכי ED 50 שונים עבור מספר מודלים של דימום, המסווגים לפי נקודות הקצה שנחקרו. במודל מותאם זה, ראינו ערכים דומים של ED50 עבור אובדן דם וזמן דימום (2.4 ± 1.7 יחב"ל/ק"ג ו-2.6 ± 2.8 יחב"ל/ק"ג, בהתאמה). באמצעות אותו מודל שחקר את rFVIIa, ערכי ED50 לאיבוד דם וזמן דימום היו 0.42 מ"ג/ק"ג ו-0.39 מ"ג/ק"ג, בהתאמה38. זוהי רגישות גבוהה יותר להתערבות פרמקולוגית מאשר מודלים של דימום תחת הרדמה שתוארו קודם לכן, כגון מודל קליפ הזנב, עם FVIII ED50 לאיבוד דם של 4.6 ± 0.5 IU/kg27, 28 IU/kg28 ו-53 IU/kg20. יתר על כן, קיימת שונות גבוהה של ערכי ED50 בדגמי קליפ הזנב השונים 20,27,28. מודל נוסף תחת הרדמה הוא מודל קליפ הזנב החמור. זוהי שיטה מהירה יותר מכיוון שתקופת התצפית היא רק 20 דקות, אך היא פחות רגישה לפעילות פרו-קרישית. מינונים גבוהים מ-200 יחב"ל/ק"ג של FVIII היו נחוצים כדי להשיג הפחתה מובהקת סטטיסטית של איבוד דם בהשוואה לבעלי חיים שטופלו ברכב25. בדגם vena saphena30, הערך ED50 לזמן דימום היה 8.1 ± 2.2 IU/kg, ו-ED50 עבור איבוד דם ממוצע היה 5.1 ± 2.1 IU/kg, גם פחות רגיש מהמודל המעודן שלנו ביחס לשני הפרמטרים. יתר על כן, מודל זה דורש עבודה עדינה כדי לבצע את הפגיעה בכלי הדם והתערבויות חוזרות ונשנות מרובות אשר, אם לא יבוצעו באופן משוחזר, עלולות להשפיע על התוצאה.

במודל ההישרדות המסורתי של TVT, ההישרדות מוערכת לתקופה של 24 שעות לאחר המינון, שבמהלכו דימום או דימום מחדש יכולים להתרחש בכל עת. לפיכך, היעילות במודל ההישרדות של TVT דורשת שההשפעה הפרו-קרישית של הטיפול תימשך לפחות במשך רוב תקופת התצפית של 24 שעות. בשיטה המוצגת כאן, אנו מעריכים השפעות חריפות בין 5 דקות ל -40 דקות לאחר המינון; לפיכך, קשה לקבוע השוואה ישירה של ערכי ED50 מכיוון שיהיה צורך במינונים גבוהים יותר במודלי ההישרדות על מנת לשמור על כיסוי המוסטטי במהלך החלק האחרון של תקופת התצפית. עם זאת, אם תרצה בכך, ניתן להשתמש במודל TVT הממוטב כדי להעריך את משך הכיסוי ההמוסטטי על ידי הצגת עיכוב בין מינון להליך הדימום. זה תואר עבור גרסה קודמת של מודל TVT הממוטב שלנו שבו ביצוע ה- TVT 24 שעות לאחר המינון הביא ל- ED50 של בערך 10-15 IU / kg עבור rFVIII26 ללא שינוי. כפי שצוין בטבלה 1, במודלים של טרנסאקציית זנב עם הישרדות של 24 שעות כנקודת קצה, דווח על50 ערכים של ED 50 של 21 IU/kg 9 ו-58 IU/kg36 של rFVIII. באופן דומה, מודלים של הישרדות קליפ זנב8 דורשים גם הם מינונים פרו-קרישיים גבוהים יותר ממקביליהם החריפים.

בפרספקטיבה, מספר גורמי קרישה שונים (FVIII, FVIIa, FIX) ונגזרות, שחלקם משווקים כיום, הוערכו באמצעות המודל הממוטב באמצעות זני עכברים המופיליים שונים 26,38,43,44,45,46,47. הצלחנו גם להתאים את המודל לחקר התערבויות לפי דרישה על ידי מינון לאחר הטרנסקציה, ממש לפני האתגר הראשון. יתר על כן, השתמשנו בהצלחה במודל זה כדי להעריך נוגדנים דו-ספציפיים עם פעילות פרו-קרישית (Østergaard et al., שהתקבלה לפרסום ב-Blood), תוך התגברות על אתגרי תגובתיות צולבת של מינים על ידי מינון FIX אנושי ו-FX אנושי. זה מדגים את הרבגוניות והערך התרגומי של המודל בפיתוח תרופות חדשות בתחום ההמופיליה, כגון אסטרטגיות ממוקדות טסיות48. ניתן להעריך אסטרטגיות מבוססות AAV או עריכת גנום גם במקרים בהם יש פונדקאית הפעילה מבחינה פרמקולוגית בעכברים. לכן, מודל דימום TVT מותאם זה הוא חלופה למודלים של טרנסקציה של ורידים בזנב ולהישרדות קליפ זנב, כמו גם חלופה רבת ערך למודלים אחרים של דימום בהרדמה. מודל זה הומני יותר בהשוואה למודל ההישרדות ודוגמה לעידון מכיוון שבעלי החיים אינם חווים כאב וסבל. לדעתנו, הרגישות לרמות המינון הרלוונטיות מבחינה קלינית, לפשטות טכנית יחסית ולהימנעות ממוות/כמעט-מוות כנקודות קצה הם יתרונות משמעותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הם או היו עובדים ו /או בעלי מניות של נובו נורדיסק A/S בזמן ביצוע מחקר זה.

Acknowledgments

אסתר בלום ותומס ניגארד מוכרים כתומכים במדידות של FVIII בפלזמה. בו אלסטד מוכר בזכות ציור ועיבוד שבבי של התבנית וחיתוך בלוקים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
  2. Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
  3. Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
  4. Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
  5. Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
  6. Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
  7. Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
  8. Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
  9. Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
  10. Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
  11. Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
  12. Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
  13. Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
  14. Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
  15. Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
  16. Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
  17. Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
  18. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  19. Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
  20. Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
  21. Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
  22. Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
  23. Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
  24. Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
  25. Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
  26. Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
  27. Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
  28. Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
  29. Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
  30. Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
  31. Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
  32. Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
  33. Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
  34. Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
  35. Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
  36. Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
  37. Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
  38. Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
  39. Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
  40. Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
  41. Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
  42. Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
  43. Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
  44. Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
  45. Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
  46. Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
  47. Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
  48. Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 175 מודל טרנסקציה של ורידים בזנב דימום זנב מודל בעלי חיים התערבות פרמקולוגית המופיליה פקטור FVIII להפיל עכברים
מודל דימום טרנסקציה של וריד זנב בהמופיליה מורדמת לחלוטין עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carol Illa, A., Baumgarten, S.,… More

Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter