Biochemistry

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954

Katherina Hemmen*¹, Susobhan Choudhury*¹, Mike Friedrich¹, Johannes Balkenhol¹, Felix Knote¹, Martin J. Lohse², Katrin G. Heinze¹

¹Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, ²Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons un protocole expérimental et un flux de travail d’analyse de données pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée à un transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence.

Abstract

Nous présentons un protocole et un flux de travail pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée au transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence. Dans le FCCS bicolore, où les fluctuations de l’intensité de fluorescence représentent l’empreinte dynamique de la biomolécule fluorescente respective, nous pouvons sonder la co-diffusion ou la liaison des récepteurs. FRET, avec sa haute sensibilité aux distances moléculaires, sert de « nanorègleur » bien connu pour surveiller les changements intramoléculaires. Pris ensemble, les changements conformationnels et les paramètres clés tels que les concentrations locales de récepteurs et les constantes de mobilité deviennent accessibles dans les environnements cellulaires.

Les approches quantitatives de fluorescence sont difficiles dans les cellules en raison des niveaux de bruit élevés et de la vulnérabilité de l’échantillon. Nous montrons ici comment effectuer cette expérience, y compris les étapes d’étalonnage à l’aide durécepteur 2-adrénergique (β 2 AR) marqué en bicolore marqué β₂AR et marqué avec eGFP et SNAP-tag-TAMRA. Une procédure d’analyse de données étape par étape est fournie à l’aide de logiciels open source et de modèles faciles à personnaliser.

Notre ligne directrice permet aux chercheurs de démêler les interactions moléculaires des biomolécules dans les cellules vivantes in situ avec une grande fiabilité malgré les niveaux limités de signal en bruit dans les expériences sur cellules vivantes. La fenêtre opérationnelle du FRET et en particulier du FCCS à de faibles concentrations permet une analyse quantitative dans des conditions quasi physiologiques.

Introduction

La spectroscopie de fluorescence est l’une des principales méthodes pour quantifier la dynamique des protéines et les interactions protéine-protéine avec une perturbation minimale dans un contexte cellulaire. La spectroscopie de corrélation de fluorescence confocale (FCS) est l’une des méthodes puissantes pour analyser la dynamique moléculaire car elle est sensible à une seule molécule, hautement sélective et compatible avec les cellules vivantes¹. Par rapport à d’autres approches axées sur la dynamique, FCS a une plage de temps mesurable plus large allant de ~ ns à ~ s, couvrant surtout les échelles de temps rapides qui sont souvent inaccessibles par les méthodes basées sur l’imagerie. De plus, il fournit également une sélectivité spatiale de sorte que la dynamique moléculaire membranaire, cytoplasmique et du noyau peut être facilement distinguée ². Ainsi, le clignotement moléculaire, la concentration locale moyenne et le coefficient de diffusion peuvent être analysés quantitativement avec FCS. Les dynamiques intermoléculaires telles que la liaison deviennent facilement accessibles lors de la sondation de la codiffusion de deux espèces moléculaires dans l’analyse fccS (fluorescence cross-correlation spectroscopy)³^,⁴^,⁵ dans une approche bicolore.

Le principal principe sous-jacent de la spectroscopie de corrélation est l’analyse statistique des fluctuations d’intensité émises par des biomolécules étiquetées par fluorescence diffusant dans et hors d’un foyer laser(Figure 1A). Les fonctions d’auto- ou de corrélation croisée qui en résultent peuvent ensuite être analysées plus en détail par ajustement de courbe pour éventuellement dériver les constantes de taux d’intérêt. En d’autres termes, les méthodes statistiques FCS et FCCS ne fournissent pas de traces de molécule unique comme dans le suivi de particules uniques, mais un motif dynamique ou une « empreinte digitale » d’un échantillon sondé avec une résolution temporelle élevée. Lorsqu’il est combiné avec le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET), la dynamique intramoléculaire telle que les changements conformationnels peut être surveillée en même temps dans une configuration confocale commune⁵^,⁶. FRET sonde la distance de deux fluorophores et est souvent appelé un « nanorègleur » moléculaire. Le transfert d’énergie n’a lieu que lorsque les molécules sont à proximité (< 10 nm), que le spectre d’émission du donneur chevauche de manière significative le spectre d’absorption de la molécule accepteur et que l’orientation dipolaire du donneur et de l’accepteur est (suffisamment) parallèle. Ainsi, la combinaison de FRET et FCCS fournit une technique à très haute résolution spatio-temporelle. Lorsque la sélectivité spatiale, la sensibilité ainsi que la compatibilité des cellules vivantes sont requises, FRET-FCCS présente un avantage évident par rapport à d’autres méthodes telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC)^7,la résonance plasmonique de surface (SPR)⁸ou la résonance magnétique nucléaire (RMN)^9,¹⁰ pour mesurer la dynamique et les interactions des protéines.

Malgré les capacités et la promesse de la spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (dc-FCCS), l’exécution de dc-FCCS dans des cellules vivantes est techniquement difficile en raison du saignement spectral ou de la diaphonie entre les canaux³^,⁴, de la différence dans les volumes confocaux due aux raies laser spectralement distinctes³^,⁴^,¹¹, du signal de fond et du bruit ou de la photostabilité limitée des échantillons¹²^, ¹³^,¹⁴^,¹⁵. L’introduction de l’excitation entrelacée par impulsions (PIE) au FCCS a été un ajustement important pour découpler temporellement les différentes excitations laser afin de réduire la diaphonie spectrale entre les canaux^16. D’autres méthodes de correction pour contrer les purges spectrales¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ et les corrections de fond ont également été bien acceptées¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Pour plus de détails et de bases sur FCS, PIE ou FRET, le lecteur est référé aux références suivantes²^,⁴,⁶^,¹⁶^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴.

Ici, toutes les expériences et analyses d’étalonnage nécessaires_ainsique les résultats expérimentaux d’un récepteur prototypique couplé à la protéine G, β récepteur 2-adrénergique (β 2 AR), pour trois scénarios différents sont présentés: (1) des molécules mono-étiquetées portant soit un fluorophore « vert » (eGFP) ou un^{fluorophore 25} « rouge » (marquage basé sur des étiquettes SNAP); (2) une construction à double marque, qui porte une étiquette SNAP N-terminale et une eGFP intracellulaire (NT-SNAP) [dans ce cas, les deux étiquettes sont à la même protéine. Ainsi, une co-diffusion à 100% est attendue]; et (3) un échantillon à double marque, où les deux fluorophores se trouvent du même côté de la membrane cellulaire (CT-SNAP). Il porte une étiquette SNAP C-terminal et un eGFP intracellulaire. Ici encore, les deux étiquettes sont à la même protéine avec à nouveau 100% de co-diffusion attendue. Comme les deux étiquettes sont très proches l’une de l’autre, du même côté de la membrane cellulaire, cela montre le potentiel d’observer le FRET et le comportement anticorrépendant. Toutes les constructions ont été transfectées dans des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et plus tard étiquetées avec un substrat fluorescent rouge qui est imperméable à la membrane pour la construction NT-SNAP et perméable à la membrane pour la construction CT-SNAP. Enfin, les données simulées illustrent l’influence des paramètres expérimentaux sur l’anticorrélation induite par FRET et l’effet des interactions protéine-protéine sur l’amplitude de codiffusion.

Ainsi, ce protocole fournit un guide complet pour effectuer le FRET-FCCS combiné dans les cellules vivantes afin de comprendre la dynamique des protéines et les interactions protéine-protéine tout en prenant conscience des artefacts techniques / physiques, des défis et des solutions possibles.

Protocol

1. Protocole expérimental

Préparation des échantillons
REMARQUE: Effectuer l’ensemencement cellulaire et la transfection dans des conditions stériles.
1. Placez un couvercle nettoyé par puits dans une plaque de culture de 6 puits et lavez trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
  REMARQUE: Le protocole de nettoyage du couvercle est détaillé dans la note supplémentaire 1.
2. À chaque puits, ajouter 2 mL du milieu de culture cellulaire complet contenant du phénol rouge (complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 μg/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) et garder la plaque de côté.
3. Culture des cellules CHO dans le même milieu contenant du rouge phénolique à 37 °C et 5 % de CO_2. Lavez les cellules avec 5 mL de PBS pour éliminer les cellules mortes.
4. Ajouter 2 mL de trypsine et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).
5. Diluer les cellules détachées avec 8 mL de milieu contenant du rouge phénol et mélanger soigneusement par pipetage.
6. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer et les grainer à une densité de 1,5 x 10⁵ cellules/puits dans la plaque de culture cellulaire à 6 puits contenant les couvercles (préparée à l’étape 1.1.1-1.1.2).
7. Laissez les cellules se développer dans un incubateur (37 °C, 5% de CO₂₎pendant 24 h afin d’obtenir environ 80% de confluence.
8. Diluer 2 μg de l’ADN vecteur désiré (p. ex. CT-SNAP ou NT-SNAP) et 6 μL du réactif de transfection dans deux tubes séparés, chacun contenant 500 μL du milieu sérique réduit pour chaque puits et incuber pendant 5 min à TA.
9. Mélanger les deux solutions ensemble pour obtenir le mélange de transfection et l’incuber pendant 20 min à TA.
10. En attendant, lavez les cellules CHO ensemencées une fois avec du PBS stérile.
11. Remplacer le PBS par 1 mL/puits de milieu sans phénol sans rouge complété par 10% de FBS sans antibiotiques.
12. Ajouter la totalité de 1 mL de mélange de transfection goutte à goutte à chaque puits et incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C, dans 5 % de CO_2.
13. Pour l’étiquetage de la construction SNAP, diluer la solution mère de substrat SNAP appropriée dans 1 mL du milieu complété par 10% fbS pour obtenir une concentration finale de 1 μM.
14. Lavez les cellules transfectées une fois avec du PBS et ajoutez 1 mL par puits de solution de substrat SNAP de 1 μM. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C dans 5% de CO_2.
15. Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans rouge phénol et ajoutez 2 mL par milieu sans phénol rouge. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 °C dans 5% de CO_2.
16. Transférez ensuite les couvercles de tous les échantillons dans la chambre d’imagerie et lavez-les avec un tampon d’imagerie de 500 μL. Ajoutez un tampon d’imagerie de 500 μL avant de passer à la configuration FRET-FCS.
Mesures d’étalonnage
REMARQUE: La configuration FRET-FCS est équipée d’un objectif d’eau de microscope confocal, de deux lignes laser, d’un système tcSPC (Time-Correlated Single Photon Counting), de deux tubes photomultiplicateurs hybrides (PMT) et de deux photodiodes d’avalanche (APD) pour la collecte de photons et le logiciel de collecte de données. Il est très important d’aligner la configuration à chaque fois avant les mesures de cellules vivantes. La description détaillée de la configuration se trouve dans la note supplémentaire 2. Les lasers et tous les détecteurs (deux PMT et deux APM) sont toujours allumés pendant les mesures, car toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions identiques. Pour les mesures d’étalonnage, utilisez un couvercle du même lot sur lequel les cellules ont été ensemencées, ce qui diminue la variation de la correction de l’anneau du collier.
1. Pour régler la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau de collier, placez la solution d’étalonnage verte 2 nM sur un couvercle en verre et allumez le laser 485 nm et 560 nm. Utiliser le laser en mode PIE (Pulsed Interleaved Excitation)¹⁶.
2. Concentrez-vous sur la solution et ajustez la position du sténopé et de l’anneau du collier de manière à obtenir le taux de comptage le plus élevé et le plus petit volume confocal pour obtenir la luminosité moléculaire maximale.
3. Répétez ce processus pour les canaux rouges avec une solution d’étalonnage rouge de 10 nM et un mélange des deux, la solution d’étalonnage verte et rouge.
4. Placez la solution d’ADN de 10 nM sur un couvercle en verre et ajustez la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau de collier de manière à ce que la corrélation croisée entre les canaux de détection vert et rouge soit la plus élevée, c’est-à-dire qu’elle montre la plus grande amplitude.
  REMARQUE: Les étapes 1.2.1 et 1.2.4 peuvent devoir être répétées d’avant en arrière pour trouver l’alignement optimal. Prenez 3 à 5 mesures de chaque solution d’étalonnage pendant 30 à 120 s après que la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau du collier a été alignée de manière optimale pour les canaux de détection verts et rouges et le volume de chevauchement confocal.
5. Mesurez une goutte de ddH₂O, le milieu d’imagerie, et une cellule non transfectée 3 à 5 fois chacune pendant 30 s à 120 s pour déterminer les taux de comptage de fond.
6. Collectez la fonction de réponse de l’instrument avec 3-5 mesures pendant 30 s - 120 s. Ceci est facultatif mais fortement recommandé.
Mesures de cellules vivantes
1. Trouvez une cellule appropriée en éclairant avec la lampe au mercure et en observant à travers l’oculaire.
  REMARQUE: Les cellules appropriées sont vivantes montrant la morphologie typique de la lignée cellulaire adhérente respective. La fluorescence de la protéine d’intérêt, ici un récepteur de surface, est visible sur toute la surface. Les cellules moins brillantes conviennent mieux que les cellules plus brillantes en raison du meilleur contraste dans FCS lorsqu’un faible nombre de molécules sont au point.
2. Allumez les deux lasers en mode PIE et concentrez-vous sur la membrane en regardant le nombre maximal par seconde.
  REMARQUE: La puissance du laser peut devoir être réduite pour les échantillons de cellules (moins de 5 μW à l’objectif). Cela dépend des fluorophores utilisés et de la configuration.
3. Observez les courbes d’auto- et de corrélation croisée de l’eGFP ou de l’étiquette SNAP-tag attachée à la β₂AR dans l’aperçu en ligne du logiciel de collecte de données et collectez plusieurs mesures courtes (~2 -10) avec un temps d’acquisition compris entre 60 et 180 s.
  REMARQUE: N’excitez pas les cellules pendant une longue période en continu car les fluorophores peuvent blanchir. Cependant, cela dépendra de la luminosité de chaque cellule, de la durée des mesures et du nombre total de mesures pouvant être effectuées.

2. Analyse des données

Exportation de données
1. Exportez les courbes de corrélation, G(t_c), et les taux de comptage, CR, de toutes les mesures.
2. Veillez à définir correctement les fenêtres de temps « invite » et « retard » et utilisez l’option « microtime gating » dans le logiciel de corrélation de données.
  REMARQUE: Au total, trois corrélations différentes sont requises: (1) autocorrélation du canal vert dans la fenêtre de temps d’invite (ACF_gp), (2) autocorrélation des canaux rouges dans la fenêtre de temps de retard (ACF_rd), et enfin (3) la corrélation croisée du signal de canal vert dans la fenêtre de temps d’invite avec le signal de canal rouge dans la fenêtre de temps de retard (CCF_PIE). L’exportation des données est présentée étape par étape pour différents logiciels dans la note supplémentaire 3.
Mesures d’étalonnage
1. Utilisez les fonctions d’autocorrélation des solutions de fluorophores vertes (ACF_gp) et rouges(ACF_rd),et adaptez-les à un modèle de diffusion 3D avec un terme triplet supplémentaire si nécessaire (eq. 1) pour calibrer la forme et la taille du volume de détection confocale pour les deux canaux de couleur utilisés:
  eq. 1
  Ici, b est la ligne de base de la courbe, N le nombre de molécules focales, t_D le temps de diffusion (en ms), et s = z₀/w₀ le facteur de forme de l’élément de volume confocal. Le triplet clignotant ou autre photophysique est décrit par son amplitude a_R et son temps de relaxation t_R.
  REMARQUE : Toutes les variables et tous les symboles utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le tableau 1.
2. Utilisez les coefficients de diffusion connus D pour l’étalon d’étalonnage vert²⁶ et rouge²⁷ et les facteurs de forme obtenus s_vert et s_rouge pour déterminer les dimensions (largeur w₀ et hauteur z₀) et volume V_eff de l’élément de volume confocal (eq. 2a-c).
  eq. 2a
  eq. 2b
  eq. 2c
  REMARQUE: Les modèles de calcul du paramètre d’étalonnage sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires (S7).
3. Calculer la diaphonie spectrale α du signal de fluorescence vert (collecté dans les canaux 0 et 2) dans les canaux de détection rouges (canaux numéros 1 et 3) en tant que rapport des signaux corrigés de fond (BG) (eq. 3).
  
  eq. 3
4. Déterminer l’excitation directe du fluorophore accepteur δ par la longueur d’onde d’excitation du donneur par le rapport entre le taux de comptage corrigé du fond des mesures d’étalonnage rouge dans la fenêtre de temps « rapide » (excitation par laser vert) et le taux de comptage corrigé de fond dans la fenêtre de temps « retard » (excitation par laser rouge) (eq. 4).
  
  eq. 4
5. Calculer la luminosité moléculaire B des fluorophores verts et rouges (eq. 5a-b) en fonction des taux de comptage corrigés du fond et du nombre obtenu de molécules en focus, N, à partir de l’ajustement de diffusion 3D (eq. 1):
  eq. 5a
  eq. 5b
6. Adapter à la fois ACF_gp et ACF_rd ainsi que CCF_PIE de l’ADN double marqué au modèle de diffusion 3D (eq. 1). Gardez les facteurs de forme obtenus, s_vert et s_rouge,constants pour ACF_gp et ACF_rd, respectivement. Le facteur de forme pour le CCF_PIE, s_PIE, se situe généralement entre ces deux valeurs.
  REMARQUE: Dans une configuration idéale, V_eff,_vert et V_{eff, le rouge} aurait la même taille et se chevaucherait parfaitement.
7. Déterminer l’amplitude au temps de corrélation zéro, G₀(t_c),en fonction des valeurs trouvées du nombre apparent de molécules focales(N_vert, N_rouge et N_PIE).
8. Calculer le rapport d’amplitude r_GR et r_RG pour un échantillon avec une co-diffusion à 100% de fluorophores verts et rouges (eq. 6). Sachez que N_PIE ne reflète pas le nombre de molécules à double marque focalisé mais ne reflète que le 1/G₀(t_c).
  et eq. 6
Expériences sur des cellules vivantes
1. Pour les constructions à étiquette unique, ajustez les échantillons de cellules à un modèle approprié. Pour le récepteur membranaire montré, la diffusion se produit de manière bimodale avec un temps de diffusion court et long. De plus, la photophysique et le clignotement des fluorophores doivent être pris en compte:
  eq. 7
  Ici, t_d1 et t_d2 sont les deux temps de diffusion requis, et un₁ est la fraction du premier temps de diffusion.
  REMARQUE: Contrairement aux mesures d’étalonnage, dans lesquelles les colorants libres et les brins d’ADN diffusent librement dans toutes les directions, le récepteur membranaire ne montre qu’une diffusion 2D le long des membranes cellulaires. Cette différence entre la diffusion 3D et la diffusion 2D est reflétée par le terme de diffusion modifié (comparer eq. 1), où t_D dans le cas 2D ne dépend pas du facteur de forme s de l’élément de volume confocal.
2. Calculer la concentration c de protéines vertes ou rouges à partir de l’eff N et V respectifs en utilisant les mathématiques de base (eq. 8):
  eq. 8
  où N_A = nombre d’Avogadro
3. Pour l’étiquette SNAP N-terminale et l’eGFP intracellulaire, ajuster les deux autocorrélations(ACF_gp et ACF_rd)de l’échantillon à double étiquette en utilisant le même modèle que pour les constructions à étiquette unique pour les ACF (eq. 7) et le CCF_PIE en utilisant un modèle de diffusion bimodale (eq. 9):
  eq. 9
  REMARQUE: Pour une description globale du système, les trois courbes doivent être ajustées conjointement: Le terme de diffusion est identique pour les trois courbes et la seule différence est le terme de relaxation pour le _PIECCF. Comme la photophysique de deux fluorophores n’est généralement pas liée, aucun terme de corrélation n’est requis. Cette absence de termes de relaxation se traduit par un _PIE CCF plat à des temps de corrélation courts. Cependant, la diaphonie et l’excitation directe de l’accepteur due au fluorophore donneur peuvent montrer des amplitudes faussement positives et doivent être soigneusement vérifiées pour l’utilisation des mesures d’étalonnage.
4. Calculer la concentration c de protéines vertes ou rouges à partir des effets N et V respectifs à _l’aide de l’équation 8.
5. Estimer la fraction ou la concentration, c_GR ou c_RG,des protéines vertes et rouges en interaction à partir des échantillons cellulaires en utilisant les facteurs de correction obtenus à partir des échantillons d’ADN, les rapports d’amplitude r_GR et r_RG de l’échantillon cellulaire et leurs concentrations respectives obtenues (eq. 10).
  et eq. 10
6. Pour l’étiquette SNAP C-terminal et l’eGFP intracellulaire, adapter les deux autocorrélations(ACF_gp et ACF_rd)de l’échantillon FRET en tant qu’échantillons monomarqués (équation 7) et fret CCF à un modèle de diffusion bimodale contenant un terme anti-corrélation (équation 11)
  eq. 11
  où un_f reflète l’amplitude de l’anti-corrélation totale et un_R et t_R l’amplitude et le temps de relaxation respectifs.
  REMARQUE: En cas de changements de fluorescence anti-corrélés dus au FRET, un ou plusieurs termes anti-corrélation peuvent être nécessaires (eq. 11), ce qui entraîne un « creux » de CCF_FRET à des moments de faible corrélation coïncidant avec une augmentation des deux autocorrélations(ACF_gp et ACF_rd). Cependant, sachez que la photophysique telle que le clignotement des triplets peut masquer le terme anti-corrélation en atténuant l’anti-corrélation induite par FRET. Une analyse conjointe complétée par des méthodes FCS filtrées pourrait aider à démasquer le terme anti-corrélation. En outre, les artefacts techniques provenant de temps morts dans l’électronique de comptage dans la gamme des nanosecondes doivent être exclus¹⁶. Une procédure étape par étape plus détaillée sur la façon d’effectuer l’analyse dans ChiSurf²⁸ et des modèles pour le calcul du volume confocal ou de la luminosité moléculaire sont fournis sur le référentiel Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) et sous forme de fichiers supplémentaires(Note supplémentaire 4 et Note supplémentaire 6). De plus, les scripts python pour l’exportation par lots des données acquises avec le logiciel Symphotime au format .ptu s’y trouvent.

Representative Results

Les résultats exemplaires de l’étalonnage et des mesures des cellules vivantes sont discutés ci-dessous. De plus, l’effet de FRET sur les courbes de corrélation croisée est démontré sur la base de données simulées à côté de l’effet de l’interaction protéine-protéine augmentant l’amplitude_{de l’EPI} CCF.

Exportation de données FCS basée sur PIE
Dans les expériences PIE, les données sont collectées en mode TTTR (Time-Tag Time-Resolved Mode)²⁹^,³⁰. La figure 1B montre les histogrammes de l’heure d’arrivée des photons d’une mesure PIE d’un brin d’ADN à double marque sur la configuration décrite (Note supplémentaire 1). La configuration dispose de quatre canaux de détection. L’émission de fluorescence est d’abord divisée par polarisation dans les directions « S » et « P » (se référant au plan perpendiculaire et parallèle dans lequel oscille le champ électrique d’une onde lumineuse). Deuxièmement, chaque direction de polarisation est ensuite divisée en deux canaux de couleur (vert, rouge) avant la détection, ce qui donne quatre canaux (vert S, rouge S, vert P, rouge P). Dans la fenêtre de temps « rapide », le fluorophore vert s’excite et le signal est détecté dans les canaux vert et rouge en raison de FRET. Dans la fenêtre de temps de retard, seul le fluorophore rouge (dans le canal rouge) est visible. Sur la base des canaux de détection et des fenêtres de temps « invite » par rapport aux fenêtres de temps « retardées », au moins cinq courbes de corrélation différentes (3 courbes d’autocorrélation (ACF) et 2 courbes de corrélation croisée (CCF)) peuvent être obtenues (Figure 1C-D):(1) signal vert dans la fenêtre de temps d’invite (ACF_gp), (2) signal rouge dans la fenêtre de temps d’invite (dans le cas de FRET, ACF_rp), et (3) signal rouge dans la fenêtre de temps de retard (ACF_rd). Ces ACF rendent compte de la mobilité des protéines, de la photophysique (p. ex., clignotement du triplet) et d’autres changements de luminosité corrélés dans le temps dans les fluorophores (p. ex., en raison du FRET). (4) _L’EPI CCF à corrélation croisée basée sur PIE du signal vert dans la fenêtre de temps d’invite avec le signal rouge dans la fenêtre de temps de retard permet de déterminer la fraction de co-diffusion du fluorophore vert et rouge¹⁶. (5) La corrélation croisée FRET FRET basée sur FRET du vert avec le signal rouge dans la fenêtre de temps d’invite est liée aux changements de luminosité anticorrépendants induits par FRET dans les signaux vert et rouge³¹^,³²^,³³.

Figure 1: Spectroscopie de corrélation (F(C)CS basée sur l’excitation entrelacée pulsée (PIE). (A) Dans FCS, les molécules marquées par fluorescence diffusent librement dans et hors d’un volume focal (limité par diffraction) façonné par un faisceau laser focal focal qui induit la fluorescence dans ce petit volume. Les fluctuations d’intensité résultantes des molécules entrant et sortant du volume sont corrélées et fournissent des informations sur la mobilité des molécules. (B) Dans PIE, deux lignes laser différentes (« prompt » et « delay ») sont utilisées pour exciter l’échantillon marqué avec deux fluorophores différents (« vert » et « rouge »). La différence de temps entre les deux impulsions d’excitation est adaptée aux durées de vie de fluorescence des fluorophores respectifs de sorte que l’un s’est désintégré avant que l’autre ne soit excité. Dans l’échantillon à double marque montré, les deux fluorophores sont suffisamment proches pour subir un transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) du fluorophore donneur « vert » au fluorophore accepteur « rouge ». Ainsi, l’émission de fluorescence rouge peut être détectée dans la fenêtre de temps « rapide » lors de l’excitation du donneur vert. Dans la configuration utilisée (Note supplémentaire 2), deux détecteurs sont utilisés pour chaque couleur, l’un orienté parallèlement à l’orientation du faisceau d’excitation (noté « p ») et le second perpendiculaire (noté « s »). (C) Trois fonctions d’autocorrélation différentes peuvent être déterminées dans une expérience PIE: Corrélation des i) signaux de canal vert dans la fenêtre de temps d’invite (ACF_gp), ii) signaux de canal rouge dans la fenêtre de temps d’invite (ACF_rp) et iii) signaux de canal rouge dans la fenêtre de temps de retard (ACF_rd). (D) Deux fonctions de corrélation croisée différentes peuvent être déterminées: iv) La corrélation croisée « PIE »(CCF_PIE)avec les signaux de canal vert dans la fenêtre de temps d’invite corrélés avec les signaux de canal rouge dans la fenêtre de retard, où l’amplitude de cette courbe est liée à la co-diffusion des fluorophores; et v) la corrélation croisée « FRET »(CCF_FRET)avec les signaux du canal vert dans la fenêtre de temps d’invite corrélés avec les signaux du canal rouge dans la même fenêtre d’invite; ici, la forme de cette courbe parfois plus rapide que la diffusion est liée aux changements d’intensité induits par FRET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étalonnage
La figure 2A-B montre une mesure d’étalonnage des fluorophores verts et rouges diffusants, respectivement. Sur la base d’un ajustement avec eq. 1 et le coefficient de diffusion connu D_vert²⁶ et D_rouge^27, la forme ( z₀ et w ₀) et la taille ( V_eff) du volume de détection sont calculées en utilisant eq. 2a-c. Les résultats d’ajustement de l’ACF_gp du fluorophore vert et de l’ACF_rd du fluorophore rouge sont résumés à la figure 2C. Les deux fluorophores présentent une constante de temps de relaxation supplémentaire de 8,6 μs (18%) et 36 μs (15%), respectivement. La luminosité moléculaire (eq. 5a-b) du fluorophore vert et rouge s’élève respectivement à 12,5 kHz par molécule et à 2,7 kHz par molécule.

Pour une estimation fiable de la taille et de la forme du volume confocal ainsi que de la luminosité moléculaire, il est recommandé d’effectuer 3 à 5 mesures par expérience d’étalonnage et un ajustement conjoint (ou global) de toutes les répétitions.

La diaphonie α(Figure 2D,eq. 3) et l’excitation directe de l’accepteur par le laser vert δ (Figure 2E, eq. 4) pour cette paire de fluorophores se situent respectivement à ~15% et ~ 38%..

Figure 2: Mesures d’étalonnage d’étalons d’étalonnage vert et rouge à diffusion libre. (A-B) Mesure représentative de 60 s d’une mesure d’étalon d’étalonnage de 2 nM vert (A) et d’une mesure d’étalon d’étalonnage de 10 nM rouge(B)montée sur le modèle de diffusion 3D incluant un temps de relaxation supplémentaire (eq. 1). Le tableau dans le panneau (C) montre les résultats d’ajustement et le paramètre dérivé basé sur eq. 2a-c et eq. 5a-b. *Les coefficients de diffusion ont été tirés de la littérature²⁶^,²⁷. (D) Détermination de la diaphonie α du signal vert dans les canaux rouges (eq. 3). Le spectre d’excitation de l’étalon vert est représenté en cyan, le spectre d’émission en vert. Les lignes laser d’excitation à 485 nm (bleu) et 561 nm (orange) sont représentées sous forme de lignes pointillées. Les cases transparentes vertes et magenta indiquent la plage d’émissions collectées (Note supplémentaire 2). (E) Détermination de l’excitation directe δ du fluorophore rouge par le laser 485 nm (eq. 4). Le code couleur est identique à (D), l’orange clair et l’orange foncé montrent respectivement le spectre d’excitation et d’émission de la norme rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour déterminer et calibrer le chevauchement du volume d’excitation vert et rouge, un double brin d’ADN à double marque est utilisé(figure 3A)comme décrit ci-dessus. Ici, les fluorophores sont espacés de 40 bp de sorte qu’aucun FRET ne peut se produire entre les fluorophores verts et rouges attachés aux extrémités des doubles brins d’ADN. La figure 3B montre les autocorrélations des fluorophores en vert(ACF_gp)et en magenta(ACF_rd)et la corrélation PIE-cross, CCF_PIE,en cyan. Veuillez noter que pour CCF_PIE, le signal dans les canaux verts dans la fenêtre de temps d’invite est corrélé avec le signal dans les canaux rouges dans la fenêtre de temps de retard¹⁶.

Ici, on obtient un coefficient de diffusion moyen pour le brin _d’ADN D = 77 μm²/s. Vous trouverez plus de détails sur le calcul dans le protocole étape par étape, Note complémentaire 4. Cette valeur est obtenue en insérant la taille des volumes de détection verts et rouges étalonnés (Figure 2) et les temps de diffusion respectifs d’ACF _gp et d’ACF_rd du brin d’ADN (Figure 3C) dans l’équation 2a. Ensuite, en utilisant les valeurs de correction obtenues r_GR et r_RG et en utilisant eq. 6 plus tard, la quantité de co-diffusion, c’est-à-dire de molécules à double marque (ou complexes protéiques en cas de co-transfection de deux protéines différentes) peut être déterminée à partir des échantillons cellulaires.

Figure 3: Étalonnage du volume de chevauchement vert-rouge à l’aide d’un échantillon d’ADN. (A) Le brin d’ADN utilisé pour l’étalonnage porte un fluorophore d’étalonnage vert et un fluorophore rouge, avec une distance de 40 pb entre les deux. La distance interdye doit être suffisamment grande pour exclure le FRET entre les fluorophores. (B) Mesure représentative en 60 s d’une solution d’ADN de 10 nM. Autocorrélations des deux fluorophores en vert (ACF_gp, standard vert) et magenta (ACF_rd, standard rouge) et la relation croisée PIE, CCF_PIE, en bleu. Le tableau dans le panneau (C) montre les résultats d’ajustement basés sur le modèle de diffusion 3D, y compris un terme de relaxation supplémentaire (eq. 1) et le coefficient de diffusion des paramètres dérivés de l’ADN, D_DNA (eq. 2a), la taille et la forme du volume de chevauchement (eq. 2a-c) et les rapports de correction r_GR et r_RG (eq. 6 ). Veuillez noter que les valeurs du volume de détection vert et rouge (étiquetées avec *) ont été tirées de l’ajustement des fluorophores individuels illustrés à la figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Expériences sur cellules vivantes
Dans la section suivante, l’analyse des expériences de cellules vivantes pour différentes constructions AR β₂est présentée. Comme β₂AR est une protéine membranaire, sa diffusion est largement limitée à une diffusion bidimensionnelle(Figure 4A)le long de la membrane cellulaire (à l’exception des procédés de transport ou de recyclage vers ou depuis la membrane) ². Avec la restriction à la diffusion 2D, le facteur de forme s = z₀/w₀ dans eq. 1 devient obsolète, ce qui entraîne un modèle de diffusion simplifié (eq. 9).

Constructions mono-étiquetées : β₂AR-IL3-eGFP et NT-SNAP-β₂AR
La figure 4 montre des mesures exemplaires de la construction monomarque β₂AR-IL3-eGFP (Figure 4B), où l’eGFP est insérée dans la boucle intracellulaire 3, et la construction NT-SNAP-β₂AR (Figure 4C), où la balise SNAP est conjuguée à la terminaison N de β₂AR. L’étiquette SNAP est étiquetée avec un substrat de surface SNAP imperméable à la membrane. Les courbes représentatives montrent la moyenne de 4 à 6 mesures répétées avec des temps d’acquisition de 120 à 200 s chacune. Les autocorrélations respectives ACF_gp et ACF_rd du signal eGFP et SNAP sont montées sur un modèle de diffusion bimodal et bidimensionnel (eq. 9). En termes de dynamique rapide, eGFP ne montre que le triplet attendu clignotant à t_R1 ~ 9 μs tandis que le signal SNAP nécessite deux temps de relaxation, l’un au temps de clignotement typique du triplet de t_R1 ~ 5 μs et un second à t_R2 ~ 180 μs.

La luminosité moléculaire des fluorophores dans les cellules vivantes est de 0,8 KHz (eGFP) et 1,7 kHz (SNAP) par molécule dans les conditions d’excitation données (eqs. 5a-b). La concentration des constructions AR β₂étiquetées incorporées dans la membrane cellulaire doit se situer dans la gamme nano-molaire et peut être déterminée par le nombre moyen de molécules (eq. 9, Figure 4C) et la taille du volume confocal respectif pour le canal vert et rouge (Figure 2) en utilisant eq. 8.

Figure 4: Mesure représentative des constructions mono-étiquettes. (A) Dans cette étude, le récepteur membranaire β₂AR a été utilisé comme exemple. Contrairement aux fluorophores et aux brins d’ADN utilisés pour l’étalonnage, qui pourraient flotter librement dans le volume de détection, les protéines membranaires diffusent principalement latéralement le long de la membrane, décrites comme une diffusion en 2 dimensions. (B, D) ACF_gp et ACF_rd des constructions mono-label β₂AR-IL3-eGFP (B) et NT-SNAP-β₂AR (D). La moyenne de 4 à 6 mesures collectées chacune pendant 120 à 200 s est montrée. Le tableau du panneau (C) montre les résultats d’ajustement des données au modèle de diffusion bimodal bidimensionnel, y compris des termes de relaxation supplémentaires (eq. 7). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Construction à double étiquette : NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP
Dans la construction à double étiquette NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (abrégé NT-SNAP), eGFP est inséré dans la boucle intracellulaire 3, et la balise SNAP conjuguée à la terminaison N de β₂AR(Figure 5A). Dans cette configuration, l’eGFP se trouve sur le côté intérieur de la membrane et le SNAP sur le côté extérieur avec des distances trop grandes pour FRET. Dans un cas idéal, cette construction montrerait une co-diffusion à 100% du fluorophore vert et rouge, et aucun signal FRET. La figure 5B-D montre deux mesures du NT-SNAP dans deux cellules sur deux jours de mesure différents. L’ajustement de l’ACF_gp et de l’ACF _rd de la « meilleure » mesure montrée à la figure 5B avec eq. 7 et le CCF_PIE avec eq. 9, révèle 50 à 60 molécules focales pour l’ACF _gp et l’ACF_rd, alors que N_app, donc 1/G₀(t_c) ~ 114 pour le CCF_PIE (Figure 5C ). La concentration des récepteurs marqués se situe dans la plage d’environ 100 nM, déterminée avec l’eq. 8. Pour déterminer la concentration moyenne de molécules à double marque, on calcule d’abord le rapport de G₀(t_c)(représenté par 1/N_(app))du CCF_PIE à ACF_gp et ACF_rd,respectivement, (eq. 6). Ensuite, ces valeurs, r_GRcell= 0,43 et r_RGcell = 0,53 sont comparées aux valeurs obtenues à partir de la mesure de l’ADN(r_{GR, ADN}= 0,51 et r_{RG, ADN} = 0,79 ce jour de mesure). En utilisant la règle des proportions, un r_GRcell= 0,43 de l’ACF_gp du signal eGFP réfléchit à une fraction de co-diffusion(r_GRcell/r_{GR, ADN)}de 0,84, où pour l’autre cas d’ACF _rd du signal de substrat SNAP, cette valeur s’élève à 0,67. La concentration moyenne de la construction NT-SNAP à double étiquette peut enfin être calculée sur la base de l’égalisation 10. En revanche, dans la mesure montrée à la figure 5D d’un jour différent, la concentration de récepteurs est assez faible et les données très bruyantes de sorte que la plage d’ajustement est limitée à ~ 10 μs. En outre, seule une faible quantité de co-diffusion est observée (15 - 26%).

Figure 5: Construction NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP à double étiquette. (A) Dans la construction à double étiquette, l’eGFP est inséré dans la boucle intracellulaire 3 et l’étiquette SNAP attachée à la terminaison N de β₂AR (NT-SNAP). (B, D) ACF_gp, ACF_rd et CCF_PIE de deux mesures de la construction à double étiquette. Les données sont adaptées à un modèle de diffusion bimodal bidimensionnel (eq. 9, CCF_PIE) et incluant des termes de relaxation supplémentaires (eq. 7, ACF_gp et ACF_rd). Le tableau dans le panneau (C) montre les résultats d’ajustement et la concentration de paramètre dérivée (eq. 8), le rapport de l’amplitude de corrélation à zéro temps de corrélation (G₀(t_c)) et la fraction des molécules co-diffusantes (eq. 10). Veuillez noter que les mesures ont été acquises à des jours différents, donc un facteur légèrement différent pour la correction d’amplitude a été utilisé (B: r_{GR, ADN} = 0,51 et r _{RG, ADN} = 0,79; D: r_{GR, ADN} = 0,51 et r _{RG, ADN} = 0,56). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Construction à double étiquette soumise à FRET: β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
Dans la construction à double étiquette β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Figure 6A), l’eGFP est inséré dans la boucle intracellulaire 3 identique à la construction NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP avec l’étiquette SNAP attachée au C-terminus. Ici, les deux étiquettes sont du même côté de la membrane plasmique des cellules, de sorte que les fluorophores sont à proximité immédiate de sorte que fret se produit comme indiqué par la durée de vie de l’eGFP trempée (Note supplémentaire 5). Compte tenu de la flexibilité de régions protéiques relativement non structurées comme le C-terminus³⁴ et d’au moins deux conformations protéiques différentes des RCPG^35,de la « FRET élevée » (HF) ou de la « FRET faible » (LF), des changements dynamiques de l’efficacité FRET dus aux changements de distance eGFP-SNAP ont pu être observés et identifiés par un terme anticorrélation dans la _FRET CCF (courbe orange de la figure 6B). ). Il a été démontré que les fluctuations fret sont anticorlées car le récepteur ne peut être que dans un état à la fois, soit HF ou LF. L’ajustement conjoint (ou global) des cinq courbes de corrélation(Figure 6B)révèle ~70% des molécules diffusant lentement à ~100 ms tandis que le reste diffuse avec ~1 ms. Toutes les autocorrélations et CCF_FRET montrent des termes de relaxation à 37 μs et 3 μs; les corrélations dominées par le signal rouge (ACF_rp, ACF_rd et CCF_FRET) montrent une composante lente supplémentaire ~ 50 ms (Figure 6C).

Les changements induits par fret sur le CCF_FRET dans différentes conditions(Figure 6D)sont démontrés par une série de simulations d’un système à deux états avec un temps de fluctuation de 70 μs entre les états LF et HF. Lors du passage de l’état LF à l’état HF, des changements dans le signal anticorrépendant sont observés dans la fenêtre de temps d’invite: le signal vert diminue et le signal rouge augmente (vice versa pour la commutation HF -> LF). Si la commutation HF-LF se produit sur des échelles de temps plus rapides que le temps de diffusion, c’est-à-dire pendant le temps de séjour de la molécule dans le foyer, la vitesse peut être dérivée de l’anticorrélation dans le CCF_FRET⁶^,³¹^,³⁶. Veuillez noter que les processus dynamiques plus lents que le temps de diffusion ne peuvent pas être observés dans FCS.

Dans cette démonstration, deux scénarios FRET différents ont été supposés, montrant un changement modéré ou maximal de l’efficacité FRET entre les deux états. Les simulations ont été réalisées à l’aide de Burbulator³⁷ et tiennent compte de l’absence ou de la présence de triplet clignotant et de la quantité croissante de diaphonie du donneur dans les canaux rouges. Le terme de diffusion a été modélisé comme une distribution bimodale avec 30% de molécules à diffusion rapide à t_D1 = 1 ms et le reste des molécules diffusant lentement avec t_D2 = 100 ms. Au total, 10⁷ photons ont été simulés dans un volume 3D de forme gaussienne avec w₀ = 0,5 μm et z₀ = 1,5 μm, une taille de boîte de 20, et N_FCS = 0,01.

La figure 6E-F montre les résultats de simulation pour la corrélation croisée CCF_FRET induite par FRET pour le contraste FRET modéré (Figure 6E) et maximal FRET ( Figure6F) en l’absence (lignes pleines) et la présence de clignotement triplet (lignes pointillées). L’anti-corrélation induite par FRET peut facilement être vue à la figure 6F. L’effet « amortisseur » lors de l’ajout d’un état triplet supplémentaire réduit l’amplitude de corrélation(Figure 6E-F)³⁸^,³⁹.

Figure 6: Simulation d’un échantillon à double étiquette montrant fret dynamique. (A) Double étiquetage β₂AR avec un eGFP inséré dans la boucle intracellulaire 3 et une étiquette SNAP C-terminal. Les deux fluorophores sont suffisamment proches pour subir des FRET et montrent des changements dans l’efficacité fret si le récepteur subit une dynamique protéique. (B) Autocorrélation (ACF_gp, ACF_rp et ACF_rd, ajustement avec eq. 7) et courbes de corrélation croisée (CCF_FRET (eq. 7) et CCF_PIE (eq. 9)) d’un exemple de mesure. Le tableau dans le panneau (C) affiche les résultats de l’ajustement. (D-F) Pour montrer l’influence du paramètre expérimental sur le terme d’anticorrélation induit par FRET attendu, 12 simulations ont été effectuées, dans lesquelles le changement de l’efficacité FRET (petite ou grande), la quantité différente de diaphonie du donneur dans les canaux accepteurs (0%, 1% ou 10%) et l’absence et la présence de clignotement triplet ont été modélisés. La fraction d’équilibre des deux états FRET a été supposée à 50:50 et leurs taux de change ajustés de telle sorte que le temps de relaxation obtenu t_R = 70 μs. Plus de détails sur les simulations voir dans le texte. (E) CCF_FRET des résultats de la simulation avec un contraste FRET modéré et en l’absence de diaphonie (orange foncé), 1% de diaphonie (orange) et 10% de diaphonie (orange clair). Les lignes pleines montrent des résultats en l’absence de triplet, des lignes pointillées en présence de triplet. (F) CCF_FRET des résultats de la simulation avec contraste FRET maximal. Le code couleur est identique à (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cependant, dans la simulation la plus similaire aux conditions expérimentales (α = 10%, clignotement du triplet à 15% et contraste FRET modéré, ligne jaune pointillée dans la figure 6E),le terme d’anticorrélation est presque diminué. La figure 7 montre le résultat de l’analyse de ces données simulées à l’aide des informations codées dans les histogrammes du temps d’arrivée des photons (c’est-à-dire la durée de vie de la fluorescence) au moyen de la spectroscopie de corrélation de la durée de vie de fluorescence (FLCS)¹⁷^,¹⁹ ou du FCS filtré par espèce (fFCS)¹⁸. Ici, les durées de vie de fluorescence des espèces HF et LF connues(Figure 7A)sont utilisées pour générer des poids ou des « filtres » (Figure 7B) qui sont appliqués au cours de la procédure de corrélation. Dans les courbes d’auto- et de corrélation croisée des espèces obtenues(figure 7C-D),l’anticorrélation peut être clairement observée.

Figure 7: Le FCS filtré à vie peut aider à découvrir les fluctuations de l’efficacité FRET basées sur la dynamique des protéines dans des échantillons à diaphonie élevée, clignotants de triplets significatifs ou d’autres propriétés photophysiques ou expérimentales masquant l’anticorrélation induite par FRET dans le CCF_FRET. Ici, l’approche est illustrée de manière exemplaire pour les données montrées à la figure 6E pour la simulation contenant 10% de diaphonie et 5% de clignotement de triplet. (A) Modèles normalisés de désintégration de l’intensité de fluorescence pour les deux espèces FRET (vert clair et vert foncé pour fret élevé et bas, respectivement) et l’IRF (gris). Le motif du canal de détection parallèle est représenté en lignes pleines, en lignes pointillées pour le canal de détection perpendiculaire. (B) La fonction de pondération ou « filtre » a été générée sur la base des motifs indiqués dans (A), le code couleur est identique à (A). Veuillez noter que seul le signal dans les canaux de détection verts, et donc la trempe du donneur induite par FRET, est pris en compte ici. (C) Quatre corrélations différentes spécifiques sont obtenues : les autocorrélations espèces de l’état FRET faible (sACF_LF-LF,vert foncé) et de l’état FRET élevé (sACF_HF-HF, vert clair), et les deux corrélations croisées d’espèces entre l’état FRET faible à l’état FRET élevé (sCCF_LF-HF, orange foncé) et vice versa (sCCF_HF-LF , orange). Le sCCF montre clairement l’anticorrélation dans la gamme μs. Des lignes noires pointillées montrent les ajustements. sACF étaient ajustés avec eq. 9 et sCCF avec eq. 11. Le tableau dans le panneau (D) affiche les résultats de l’ajustement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’amplitude de_l’EPI CCF pour étudier l’interaction protéine-protéine (IPP)
Enfin, un cas d’utilisation courant du FCS à base d’EPI dans les cellules vivantes consiste à étudier l’interaction entre deux protéines différentes. Ici, le paramètre de lecture est l’amplitude du CCF_PIE,ou plus précisément le rapport des amplitudes d’autocorrélation ACF_gp et ACF_rd à l’amplitude du CCF_PIE. Pour montrer l’effet de l’augmentation de la co-diffusion sur le CCF_PIE,des simulations ont été réalisées sur la base des deux constructions mono-étiquetées, β₂AR-IL3-eGFP et NT-SNAP-β₂AR (Figure 8A). La figure 8B montre comment l’amplitude de _l’EPI CCF augmente lorsque la fraction des molécules co-diffusantes passe de 0% à 100%. Veuillez noter qu’une diaphonie de 1% du signal vert dans les canaux rouges dans la fenêtre de temps de retard a été ajoutée avec les composants de diffusion autrement modélisés comme indiqué ci-dessus.

Figure 8: Le _{CCF PIE} peut être utilisé pour étudier l’interaction de deux protéines. (A) Ici, une étude de co-transfection de β₂AR-IL3-eGFP avec NT-SNAP-β₂AR (portant une étiquette SNAP « rouge ») a été simulée. (B) Pour une quantité croissante de molécules co-diffusantes (0% (bleu foncé) -> 100% (bleu clair)) l’amplitude G(t_c) augmente. Le terme de diffusion a de nouveau été modélisé comme une distribution bimodale avec 30% de molécules à diffusion rapide à t_D1 = 1 ms et le reste des molécules diffusant lentement avec t_D2 = 100 ms. De plus, 1 % de diaphonie du signal vert dans la fenêtre de temps de retard rouge a été ajouté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Symbole	Signification (unité commune)
α	diaphonie du fluorophore vert après excitation verte dans les canaux de détection rouges (%)
a₁	fraction du premier composant de diffusion dans le modèle de diffusion bimodale des récepteurs membranaires
a_f	amplitude totale du terme d’anticorrélation
a_R	amplitude de la photophysique / clignotement du triplet
b	ligne de base / décalage d’une courbe de corrélation
B	luminosité moléculaire d’un fluorophore ((kilo-)compte par molécule et par seconde)
BG	arrière-plan (p. ex. à partir d’un échantillon de référence approprié : ddH2O, tampon, cellule non transfectée, etc.)
c	concentration
CR	taux de comptage (KHz ou (kilo-) compte par seconde)
δ	excitation directe du fluorophore rouge après excitation verte (%)
D	coefficient de diffusion (μm²/s)
G(t_c)	fonction de corrélation
N	nombre de molécules ciblées
N_A	Nombre d’Avogadro (6.022*10²³ Mol^-1)
r_GR, r_RG	rapport d’amplitude de la fonction d’autocorrélation verte ou rouge à la fonction de corrélation croisée basée sur PIE
s	facteur de forme de l’élément de volume confocal
t_c	temps de corrélation (généralement en millisecondes)
t_D	temps de diffusion (généralement en milliseconde ou microseconde)
t_R	temps de relaxation de la photophysique (généralement en microseconde)
t_T	temps de relaxation du clignotement du triplet (généralement en microseconde)
w₀	demi-largeur de l’élément de volume confocal (μm)
z₀	demi-hauteur de l’élément de volume confocal (μm)

Tableau 1 : Liste des variables et des abréviations. Pour l’utilisation de symboles et de définitions dans les expériences de fluorescence et FRET, les lignes directrices de la communauté FRET⁴⁰ sont recommandées.

DOSSIERS SUPPLÉMENTAIRES :

SuppNote1_Coverslip nettoyage.docx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

SuppNote2_Confocal configuration.docx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

SuppNote3_Data exporter.docx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

SuppNote4_FCCS analyse d’étalonnage à l’aide de ChiSurf.docx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

SuppNote5_Fluorescence histogrammes à vie.docx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

S6_Scripts.zip Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

S7_Excel_templates.zip Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les techniques FCS dans les RCPG permettent d’évaluer la mobilité et les interactions des récepteurs à l’intérieur des cellules vivantes⁴¹. L’avantage de la technique FRET-FCS est que, parallèlement à la mobilité, la dynamique conformationnelle des RCPG peut être étudiée. Cependant, l’exécution de FRET-FCS dans des cellules vivantes est difficile et nécessite des cellules qui montrent une expression faible (ou modérée maximale) de la protéine d’intérêt sous marquage fluorescent, une configuration bien calibrée et un bon pipeline pour analyser les données. Ici, les points critiques de la préparation des échantillons et de la procédure expérimentale sont d’abord discutés en ce qui concerne les points de vue biologiques, spectroscopiques et techniques.

Les étapes expérimentales critiques comprennent la minimisation du fond et de l’autofluorescence (en utilisant des couvercles largement nettoyés et des milieux sans phénol-rouge), l’optimisation des conditions de transfection (par exemple, la quantité d’ADN plasmidique et le temps après la transfection) pour atteindre de faibles niveaux d’expression et un étiquetage efficace. Bien sûr, il est également essentiel de s’assurer que la fonction de la protéine étiquetée n’est pas entravée. Ainsi, dans les expériences sur cellules vivantes, la décision de la stratégie de marquage et de la position de l’étiquette est souvent prise en faveur de protéines fluorescentes ou d’une étiquette SNAP / CLIP attachée à la terminaison flexible N ou C⁴²^,⁴³. Des stratégies alternatives de étiquetage telles que l’insertion d’un acide aminé non naturel avec une chaîne latérale réactive pour le étiquetage avec un fluorophore organique ont émergé au cours des dernières années⁴⁴.

Pour le PIE-FCS bicolore, où seule l’interaction de deux molécules d’intérêt doit être étudiée, les fluorophores peuvent être sélectionnés parmi une grande variété de protéines fluorescentes établies ou de substrats SNAP/CLIP. Ici, du point de vue de la spectroscopie, l’objectif devrait être de sélectionner une paire telle que peu de diaphonie ou d’excitation directe de l’accepteur se produisent. De plus, les fluorophores sélectionnés doivent être photostables et montrer peu ou pas de blanchiment dans les conditions expérimentales choisies. Il est recommandé de sélectionner des fluorophores dans la gamme spectrale rouge car (1) le fond d’autofluorescence de la cellule est réduit et (2) la lumière d’excitation est de plus longue longueur d’onde, donc moins phototoxique¹⁴. Le photopachage peut être minimisé en effectuant d’abord une « série de puissance », dans laquelle la puissance du laser est augmentée progressivement et la luminosité moléculaire est observée. La plage d’intensité d’excitation optimale se situe dans la plage linéaire des résultats⁴⁵.

Si les deux étiquettes sont censées rendre compte également de la dynamique conformationnelle des protéines par fret, le choix des fluorophores disponibles est plus restreint. Ici, la distance minimale/maximale possible entre les deux fluorophores doit être estimée au préalable, par exemple, sur la base des structures disponibles ou de la taille moléculaire, et d’une paire de fluorophores choisie avec un rayon de Förster raisonnable R₀ tel que FRET peut effectivement se produire²⁰.

Ici, eGFP et une étiquette SNAP ont été choisies pour l’étiquetage, et l’étiquette SNAP a été étiquetée avec un substrat de surface intracellulaire ou imperméable à la membrane. Les spectres sont similaires à ceux de la figure 2C-D. Cette combinaison de fluorophores montre une diaphonie élevée de l’eGFP dans les canaux de détection rouges et une excitation directe de l’accepteur du substrat SNAP par l’excitation verte dans la fenêtre de temps d’invite et entraîne un « faux » signal significatif dans les canaux rouges dans la fenêtre de temps d’invite. Idéalement, les deux valeurs, la diaphonie et l’excitation directe de l’accepteur, ne devraient pas dépasser^{5% 5}^,⁶^,³⁸. Cependant, avec un rayon de Förster de 57 Å, il est idéal pour sonder la distance entre les étiquettes dans la construction_{β 2}AR-IL3-eGFP-CT-SNAP qui peut être évaluée à partir de la durée de vie de l’eGFP trempée (note supplémentaire 5).

Techniquement, comme pour toute expérience de spectroscopie de fluorescence, l’appareil doit être bien aligné et doit posséder des sources d’excitation appropriées, un filtre d’émission et des détecteurs sensibles. Pour éviter que les artefacts du détecteur ne s’après-pulsent sur l’échelle de temps μs, au moins deux détecteurs de chaque couleur doivent être présents, ce qui peut être corrélé de manière croisée. Dans l’électronique moderne de comptage de photons uniques corrélés dans le temps, le temps mort de la carte de détection dans la plage de temps ns ne joue guère de rôle en raison des canaux de routage indépendants, cependant, il pourrait être vérifié comme proposé par Müller et al ¹⁶ à condition que la plage de temps d’intérêt se situe dans la plage de temps inférieure à μs / ns. De plus, pour des résolutions temporelles encore plus élevées dans la gamme ps, chaque canal de détection doit être doublé, c’est-à-dire que quatre détecteurs par couleur doivent être utilisés, pour contourner également les temps morts du détecteur²^,¹⁵^,²⁹^,⁴⁶. Alors que la durée de vie moyenne de la fluorescence peut être estimée à l’aide de la détection de fluorescence non polarisée, pour l’analyse de la distance (~ distribution) entre les fluorophores, l’émission doit être collectée en fonction de la polarisation. Cela est dû au fait que l’efficacité du transfert d’énergie dans FRET repose sur l’orientation des deux fluorophores. Des informations plus détaillées peuvent être trouvées ici²⁰^,²⁸^,⁴⁷. Enfin, dans les expériences PIE, la distance entre l’impulsion d’invite et l’impulsion de retard est critique et doit être choisie de telle sorte que l’intensité de fluorescence des fluorophores ait été largement désintégrée(Figure 1B). Une règle courante est de placer les deux impulsions 5x la durée de vie de la fluorescence séparées, c’est-à-dire que pour l’eGFP avec une durée de vie de fluorescence de 2,5 ns la distance doit être de 12,5 ns au minimum²².

Après avoir détaillé toutes les considérations relatives à la procédure expérimentale, les données et leur analyse sont discutées plus en détail. Comme mentionné dans la section protocole, l’alignement de la configuration doit être vérifié quotidiennement, y compris l’analyse des mesures d’étalonnage. Les données présentées à la figure 2A-C, par exemple, montrent une composante de relaxation supplémentaire dans la gamme 8-40 μs. Le clignotement typique du triplet du fluorophore d’étalonnage vert est connu pour se produire dans la gamme 2-10 μs¹³^,¹⁵^,⁴⁸. La composante de relaxation lente requise dans toutes les courbes de l’échantillon d’ADN(Figure 3C),trop lente pour un clignotement réel du triplet, pourrait provenir d’interactions de l’ADN avec les fluorophores^39. Cependant, cette composante ne serait pas attendue dans _l’EPICCF, et provient très probablement de la diaphonie résiduelle. Ainsi, il est fortement conseillé d’effectuer l’analyse des échantillons d’étalonnage directement avant de procéder aux expériences cellulaires pour juger de la qualité de l’alignement de la journée.

L’étalonnage correct du volume de chevauchement confocal nécessite un échantillon avec une co-diffusion à 100% de l’étiquette verte et rouge. Ici, de l’ADN double brin marqué par fluorescence est utilisé. Les deux brins d’ADN peuvent être adaptés pour avoir les fluorophores souhaités à la distance requise l’un de l’autre. Les brins conçus peuvent être recuits avec un rendement élevé. Cependant, les bonnes pratiques de laboratoire conseillent de vérifier l’intégrité et le degré de marque des brins d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose et de mesurer le spectre d’absorption. En outre, le rendement de l’assemblage double brin doit être vérifié car cette mesure d’étalonnage repose de manière critique sur l’hypothèse qu’il y a une co-diffusion à 100% du vert avec l’étiquette rouge. Dans le cas où l’hypothèse n’est pas valide, des facteurs de correction pourraient devoir être appliqués¹⁶^,²². Dans les mesures d’étalonnage illustrées à la figure 2 et à la figure 3,un volume de détection de 1,4 fL et 1,9 fL dans les canaux vert et rouge a été obtenu, respectivement. Cette différence de taille est attendue pour une configuration avec des volumes d’excitation presque limités par diffraction (Note supplémentaire 2). Dans cette condition, la taille du volume d’excitation évolue avec la longueur d’onde d’excitation. Ceci explique à son tour les différentes amplitudes de corrélation observées à la figure 3B. Les facteurs de correction dérivés r_GR = 0,56 et r_RG = 0,72 corrigent pour cet écart de taille et le chevauchement potentiel non parfait des deux volumes d’excitation³^,⁴.

La figure 4, la figure 5, la figure 6et la figure 7 illustrent le flux de travail d’une étude basée sur PIE-F(C)CS visant à comprendre la dynamique conformationnelle des protéines. Tout d’abord, les deux constructions mono-marquées β₂AR-IL3-eGFP et NT-SNAP-β₂AR servent de témoins pour caractériser les propriétés du fluorophore dans les cellules en l’absence de l’autre fluorophore respectif (Figure 4). Ensuite, la construction à double étiquette NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP portant une étiquette SNAP face à l’extérieur de la cellule et une eGFP du côté cytoplasmique sert de contrôle de « co-diffusion à 100% »(Figure 5). La dernière construction, β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, porte les deux fluorophores du côté cytoplasmique et suffisamment proches les uns des autres pour subir fret. Ici encore, une co-diffusion à 100% serait attendue en tandem avec des fluctuations d’intensité anti-corrélées dans le signal des canaux vert et rouge dans la fenêtre de temps rapide, c’est-à-dire après l’excitation du donneur, en raison de la dynamique des protéines influençant l’efficacité FRET³¹^,³²^,³³. Cette dynamique peut apparaître comme anti-corrélation dans le CCF_FRET (Figure 6-7).

Toutes les constructions GPCR β₂AR montrent une diffusion bimodale sur la membrane cellulaire(Figure 4A). Alors que le β₂AR-IL3-eGFP ne montre que le clignotement attendu du triplet(Figure 5B)¹³^,¹⁵, NT-SNAP-β₂AR montre un temps de relaxation lent supplémentaire(Figure 5C-D). Il est probable que t_R2 puisse provenir d’un substrat SNAP non lié. Cela pourrait être élucidé par d’autres expériences, par exemple en mesurant également la diffusion et les propriétés photophysiques du substrat SNAP utilisé dans une solution aqueuse. Il est à noter qu’une expérience simple pour différencier les temps de diffusion et de relaxation consiste à modifier le sténopé de la configuration confocale, c’est-à-dire à augmenter le volume effectif: Alors que les temps de diffusion augmentent avec l’augmentation des volumes effectifs, les termes de relaxation sont inchangés¹³. Lors de la détermination de la concentration de protéine fluorescente (FP) en fonction des résultats d’ajustement, sachez que les PF en général subissent un processus de maturation, dans lequel finalement le chromophore est formé¹². Ce temps de maturation peut différer de FP à FP en plus de la photophysique qui dépend de l’environnement chimique local^13,¹⁵. Ainsi, la concentration réelle de protéines présente dans l’échantillon rapporté par FCS est généralement sous-estimée, ce qui peut être corrigé si la fraction des FP non fluorescents peut être déterminée dans l’expérience. Enfin, il est conseillé de vérifier les spectres de fluorophores dans les cellules vivantes pour corriger les valeurs de α et δ, si nécessaire, car la plupart des fluorophores réagissent sensibles à leur environnement¹³^,¹⁵^,⁴⁸. L’arrière-plan à soustraire est déterminé par le signal recueilli dans les cellules non transfectées. En outre, l’autocorrélation de l’autre canal de couleur respectif et de _l’EPI CCF doit être vérifiée pour pouvoir identifier les faux signaux (Note supplémentaire 4 - Figure 30).

Les deux mesures du NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (Figure 5D), où les fluorophores sont situés de différents côtés de la membrane, ont été acquises à des jours différents et montrent l’importance des statistiques dans la fluorescence d’une seule molécule résolue dans le temps. Ici, les différents résultats peuvent être dus au degré différent d’étiquetage: dans une cellule, le degré plus élevé d’étiquetage et de moyenne des mesures a entraîné un bruit relativement faible(Figure 5B),tandis que dans l’autre cellule, seules deux mesures ont pu être collectées (Figure 5A). Au-delà de la collecte d’une quantité suffisante de données, il est essentiel d’évaluer les résultats en temps opportun et peut-être d’optimiser la stratégie d’étiquetage. Lors de la conception des expériences, il est important de se rappeler que FRET est sensible, mais limité à des distances allant jusqu’à 10 nm et « aveugle » sinon. Dans notre cas, cette « cécité » est indiquée par la durée de vie inchangée de la fluorescence eGFP (Note supplémentaire 5). Dans la construction AR-IL3-eGFP-CT-SNAP β₂(Figure 6A),fret peut être identifié à partir de la durée de vie de l’eGFP trempée (note supplémentaire 5). Cependant, aucun terme d’anticorrélation n’est observé(Figure 6B),ce qui signifie que fret ne fluctue pas ou à une échelle de temps plus lente que le temps de diffusion. Jusqu’à trois termes de relaxation supplémentaires sont requis dans ACF_gp, ACF_rp, ACF_rd et CCF_FRET (Figure 6C). La composante lente dans ACF_rp, ACF_rd et CCF_FRET pourrait être due au blanchiment de l’accepteur et, bien sûr, influence la valeur obtenue de la diffusion lente trouvée dans ces courbes (~350 ms contre 117 ms dans ACF_gp). t_D dans le canal rouge est censé être légèrement plus grand que dans le canal vert en raison des volumes confocaux de taille différente (Figure 2) - mais seulement par un facteur comparable à la différence de taille. Le temps de relaxation très rapide de 3 μs reflète le clignotement du triplet des fluorophores¹³^,¹⁵^,⁴⁸, tandis que le temps de relaxation plus lent de 37 μs pourrait être dû au FRET: De même, comme FRET induit une anticorrélation dans le CCF_FRET, des corrélations positives sont attendues dans les autocorrélations³¹^,³²^,³³. La présence de ce terme comme « positif » dans le FRET du CCF et sa présence dans l’ACF_rd pourraient être expliquées par la diaphonie élevée et devraient être expliquées plus avant. Notez que _l’EPI CCF est stable à des temps de corrélation courts comme prévu.

D’autre part, il convient de noter que l’apparition de FRET dans un système d’intérêt entraîne des effets non linéaires sur les courbes de corrélation⁶. La luminosité moléculaire, par exemple, d’une molécule évolue dans l’amplitude de corrélation au carré et chaque état FRET (et les molécules toujours présentes sans récepteur actif) montre une luminosité moléculaire différente. En effet, FRET diminue la concentration apparente de molécules vertes détectées (c’est-à-dire augmente l’amplitude de l’ACF_gp) et le nombre de molécules rouges (déterminé à partir de l’invite rouge) est surestimé^5. Les deux effets influencent la quantité d’interaction dérivée à la fois de CCF_FRET et de CCF_PIE. Cependant, l’analyse globale comme indiqué par exemple pour la dynamique intramoléculaire de calmoduline ³¹^,³² ou syntaxine³³ peut révéler la dynamique des protéines. Lorsqu’elle est soigneusement étalonnée, l’efficacité FRET moyenne peut être extraite des amplitudes relatives CCF_PIE et ACF²², tandis que les états limites peuvent être déterminés à partir de l’analyse de la distribution de la durée de vie de la fluorescence du donneur³³.

Compte tenu du fait que dans les expériences sur des cellules vivantes avec de grands fluorophores comme l’eGFP, le contraste FRET est susceptible d’être encore plus faible que prévu pour les simulations illustrées à la figure 6 et que l’excitation directe de l’accepteur n’a pas été ajoutée dans la simulation, cela pourrait expliquer pourquoi l’identification de l’anticorrélation dans les expériences sur cellules vivantes est très difficile. Une alternative d’analyse prometteuse repose sur la collecte des informations codées dans les histogrammes de temps d’arrivée des photons(Figure 1B)accessibles en raison de la collecte de données de comptage de photons uniques corrélées dans le temps²⁹^,³⁰. Si la durée de vie de la fluorescence (~motifs) des deux espèces (ou plus) (FRET) à l’intérieur de l’échantillon est connue (Figure 7A), on peut choisir un « filtre » ou des poids qui sont appliqués au cours du processus de corrélation (Figure 7B)¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Les courbes de corrélation ainsi obtenues, ne représentent plus la corrélation des canaux de détection mais plutôt les auto- ou croisements entre deux espèces différentes (FRET), ainsi renommées en espèces-ACF (sACF) ou espèces-CCF (sCCF). L’application de cette approche aux données simulées avec un contraste FRET modéré, une diaphonie élevée et un clignotement triplet récupère le terme d’anticorrélation (Figure 7C-D). Cependant, il convient de noter que des temps de relaxation peuvent être obtenus mais que la relation à l’amplitude est perdue¹⁸. Cette approche a déjà été appliquée dans des expériences sur des cellules vivantes, par exemple pour étudier l’interaction de l’EGFR avec son antagoniste⁴⁹ ou pour séparer la fluorescence des protéines attachées à des variantes d’eGFP avec des durées de vie de fluorescence exceptionnellement courtes et longues⁵⁰.

Alors que les mesures FRET basées sur PIE dans les protéines purifiées sont largement utilisées pour étudier la dynamique des protéines³⁶²², dans les cellules vivantes, elles se concentrent sur la compréhension des interactions protéine-protéine. Cette approche a été appliquée pour étudier la régulation de l’activité de la MAP kinase dans la levure⁵¹ ou pour résoudre l’interaction des protéines membranaires avec leur partenaire de liaison cytosolique comme résumé dans cet article récent⁵². Ici, des complications peuvent survenir lorsqu’une diaphonie importante de fluorophores verts est toujours présente dans la fenêtre de temps de retard des canaux rouges ou de signal rouge dans les canaux verts dans la fenêtre de temps d’invite. Le premier pourrait être causé par un retard insuffisant de l’impulsion rouge par rapport à l’impulsion verte, tandis que les deux effets découlent de spectres d’excitation et d’émission trop fortement chevauchants des fluorophores choisis. Il est recommandé de vérifier soigneusement les constructions à étiquette unique respectives et de corriger les amplitudes _d’EPI CCF faussement positives, en particulier dans les cellules où l’autofluorescence avec une durée de vie de fluorescence très courte pourrait être un autre facteur de complication²².

Pour conclure, l’approche FRET-FCS décrite ici a un grand potentiel pour comprendre les interactions protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à des concentrations physiologiques proches. Dans ce protocole, l’accent a été mis sur les mesures d’étalonnage requises et l’analyse quantitative nécessaire à effectuer lors des mesures de cellules vivantes. À cette fin, différentes mesures de cellules vivantes ont été montrées complétées par des simulations. Les simulations fournissent la compréhension générale ici car les paramètres pourraient être modifiés systématiquement avec des modèles d’ajustement sur mesure qui décrivent la mobilité spécifique et les propriétés photophysiques des données respectives. L’analyse a été réalisée avec des outils logiciels open source avec un protocole étape par étape étendu et des modèles faciles à adapter. Enfin, les progrès techniques, et donc la disponibilité de systèmes PIE-FCS stables prêts à l’emploi ainsi que la diffusion de logiciels open source pour l’analyse de données rendront cette technique de plus en plus accessible à une communauté de recherche plus large pour éventuellement démêler l’interaction et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec la plus grande sensibilité.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Acknowledgments

Ce projet a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, numéro de projet 374031971, projet INF) à J.B. et K.G.H.

Nous remercions le Centre Rudolf Virchow pour son soutien financier et l’imagerie par fluorescence de l’unité centrale pour son soutien technique. De plus, nous remercions Ashwin Balakrishnan pour sa relecture approfondie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Band pass filters Brightline	AHF, Tübingen, Germany	HC 525/50 and HC 600/52	Filter
2x Dichroic beam splitter	AHF, Tübingen, Germany	HC BS F38-573	Filter
6-well culture plate Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20000	Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20003	Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany	WK-XYB-PZ-IX71	Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Germany	SPCM-AQR-14	Single photon counting detector
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Germany	10FC16PB.3	Filter
Biorender (Software)	Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)	---	Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line	ATCC	CCL-61	Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software)	Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA	---	tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Reagent
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)	A3672,0250	Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance)	IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany)	---	Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Reagent
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M	Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S 0615	Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Canada	XI120-Q-5060	Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9105S	Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9112S	Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	111640	Reagent
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Germany	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm)	Picoquant, Berlin, Germany	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	11668-019	Reagent
MFD suite (Software)	AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany	---	Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	AC254-150-A-ML	Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	640110	Reagent
Olympus IX 71 stand	Olympus, Hamburg, Germany	IX2-ILL100	Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Reagent
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	14190144	Reagent
Pinhole (50 µM)	Newport, Darmstadt, Germany	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Germany	932200 (PMA Hybrid 40)	Single photon counting detector
Python scripts (Software)	Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany	---	Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tübingen, Germany	F73-421PH	Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator	Picoquant, Berlin, Germany	02126	Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	6771.1	Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)	Picoquant, Berlin, Germany	931073 (SPT64-1+2 single user )	Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Germany	930010 (Hydraharp 400)	Optics
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	ACN127-020-A	First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Germany	UPLSAPO60XW	Objective

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Biochemistry

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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