I denne artikel beskrives metoden til mitokondrietidsfordærv billeddannelse af astrocytkulturer udstyret med MitoTimer biosensor og den resulterende multiparametriske analyse af mitokondriedynamik, mobilitet, morfologi, biogenese, redox-tilstand og omsætning.
Mens meget opmærksomhed er blevet givet til mitokondrie ændringer på neuronalt niveau, viser de seneste beviser, at mitokondrie dynamik og funktion i astrocytter er impliceret i kognition. I denne artikel beskrives metoden til time-lapse imaging af astrocytkulturer udstyret med en mitokondriebiosensor: MitoTimer. MitoTimer er et kraftfuldt og unikt værktøj til at vurdere mitokondriedynamik, mobilitet, morfologi, biogenese og redox-tilstand. Her præsenteres de forskellige procedurer for kultur, billedopkøb og efterfølgende mitokondrieanalyse.
Astrocytter er kritiske aktører i vedligeholdelsen af hjernen homøostase. De er måske mest kendt for at have betydelige strukturelle roller i hjernen, som en del af blod – hjerne barrieren1 og ved at støtte neuroner og synapser i hele hjernen2. Astrocyt støtte af neuroner er både strukturelle3 og metaboliske4,5, med astrocytter fremme neurogenese og synaptogenese samtidig give centrale metabolitter som laktat til aktive neuroner4,6,7. Ud over den rolle, strukturstøtte, astrocytter er aktive celler, der deltager i Ca2 + signalering og buffering (herunder spontan mitokondrie Ca2 + tilstrømning)8,9, K+ buffering10, og kan tilpasse sig og reagere på behovene i hjernen i tider med skade11,12 . Som sådanne dynamiske celler har astrocytter robuste energibehov, hvilket kræver et effektivt mitokondrienetværk. Disse mitokondrier har også en afgørende rolle i buffering overdreven reaktiv ilt arter (ROS)13. Ud over deres individuelle eller lokale roller energiproduktion og ROS buffering, mitokondrier fungere som et netværk14. I denne forstand opretholder de ligevægt mellem fissioning og fusion mitokondrier, der repræsenterer nye / reducerede mitokondrier og ældre / oxideret mitokondrier, henholdsvis15. Den samlede redox tilstand af en celle kan måles ved redox tilstand mitokondrie netværk. I patologi er dette et kritisk stykke information, der kan kaste lys over, hvilke celler der muligvis ikke fungerer optimalt.
I de senere år er mange sensorer blevet udviklet til at studere dynamikken og funktionerne i mitokondrier i celler. For eksempel anvendes sensorer, der måler energiudveksling (ATP), redox-tilstand (NADH /NAD+, ROS) og enzymatisk funktionalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) i øjeblikket i studiet af mitokondriefunktion16. Blandt dem tillader MitoTimer at følge ændringerne i mitokondriemorfologi (størrelse, form, overfladeareal), mobilitet (hastighed, forskydning) og dynamik (fusions- og fissionshændelser) samt den samlede mitokondrieomsætning og redox-tilstand. MitoTimer er en mutant rød fluorescerende protein, drFP58317, med et mitokondrie signal fra underenhed VIII af human cytochrome c oxidase18,19 at visualisere nyligt syntetiseret mitokondrier i grøn (488 nm) og oxideret mitokondrier i rødt (555 nm). Ved hjælp af den grønne (488 nm) og rød (555 nm) fluorescens ratio tillader samtidig evaluering af individuelle mitokondrier, deres morfologi analyse, fusion / fission begivenheder, og redox tilstand historie20,21. Denne unikke egenskab kan bruges til at undersøge mange videnskabelige spørgsmål vedrørende mitokondrier fysiologiske og patologiske roller og er derfor meget lovende for at afsløre de underliggende mekanismer i mitokondrie dynamik inden for mange forskellige celletyper.
Vi har for nylig udviklet en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, herefter kaldet LV-G1-MitoTimer) til at studere mitokondrier dynamik og funktioner specielt i astrocytter in vitro og in vivo22. LV-G1-MitoTimer bruger en afkortet version af glialflimmersyreprotein (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3 forstærker (gfaABC1D(B3), herefter kaldet G1) kombineret med den tidligere beskrevne miR124T neuronal detargeting system23. Det giver eksklusivt udtryk for mitokondriebiosensoren i astrocytter in vitro og in vivo22. Præsenteret her er de forskellige trin til at udføre en kultur af rotte hippocampal astrocytter og udstyre dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, samt de forskellige mikroskopi trin til at følge adfærd astrocyt mitokondrier i flere på hinanden følgende timer / dage.
Her foreslås en ny metode til langsgående at følge dynamikken og omsætningen i mitokondriesystemet i en kultiveret astrocyt. I modsætning til en time-lapse tilgang på en fast gruppe af celler eller en individuel celle ad gangen (oftest brugt i litteraturen)24,25, forskere kan følge udviklingen af mitokondrie system i løbet af flere dage på de samme individuelle celler. I modsætning til enkelt godt levende billeddannelse, hvor høje niveauer af lyseksponering er påkrævet, og udvælgelsen af mange individuelle celler er mindre mulig, den foreslåede metode udnytter dette mikroskop evne til at afbilde flere forskellige celler i forskellige områder af en brønd og til at komme tilbage til de samme celler på forskellige tidspunkter for at re-billede dem. Takket være normalisering til en baseline udført for hvert målt kriterium på hver interessecelle tager det mitokondriesystemets kompleksitet i betragtning og undersøger effekten af behandlingen på hver celle i forhold til sit eget baselinebillede. Mikroskopets evne til autonomt at udføre denne type billeddannelse på op til 16 brønde ad gangen (billeddannelse 5 celler pr. Brønd) gør det muligt at tage behørigt hensyn til heterogeniteten af mitokondriesystemet under analysen uden den eksperimentelle variabilitet, der følger med billeddannelse på forskellige dage.
Kvaliteten af de kulturer, niveauet af virusinfektioner, der udtrykker LV-G1-MitoTimer biosensor, typen af mikroskop og mål, og udvælgelsen af egnede celler er kritiske variabler, der skal forblive så konsekvent som muligt i denne protokol. Celletæthederne, vektortypen og de virale titere kan tilpasses efter spørgsmålet. Selvom tidligere arbejde viser, at udtrykket LV-G1-MitoTimer ikke har skadelige konsekvenser for mitokondriefunktionen og dynamik21,22,26,27, er det vigtigt at kontrollere, at koncentrationen ikke er giftig for cellerne (for eksempel kontrol af det samlede antal celler i kontrol godt). Da der anvendes et enkelt fokalplan, skal astrocytter være: (1) så fladt som muligt, (2) isoleret fra andre mærkede celler (for at forenkle analysen i tilfælde af forskydning i fadet) og (3) med høje fluorescensniveauer. Da celler i kultur kan være meget varierende i morfologi, kan mitokondriesystemet være meget heterogent. I denne sammenhæng kompenserer analyse af INVESTERINGSAFKAST (og ikke hele cellen) for nogle problematiske områder, såsom de perinukleare områder, og reducerer variationen. Det er vigtigt at gøre baseline på relativt lignende celler og prøve så mange celler som muligt. Derfor er højindhold erhvervelse og analyse mikroskoper ideelt egnet. Under denne langsgående overvågning er det også vigtigt ikke at overeksponere cellerne i lyset for at undgå biosensor blegning.
Denne billedbehandlingsmetode er ikke uden dens kompleksitet, og i hele protokollen er der flere noter, der tager højde for fejlfinding udført under tidligere tests med mikroskopet. For eksempel afhænger valget af anvendte pladebelægning af den tilsigtede analyse, men anbefalinger til de mest egnede valg til astrocyt primære kulturer er medtaget. Derudover skal billedopsamling udføres på mindst 5 celler pr. tilstand på grund af intercellulær variabilitet. Mere specifikt vil nogle celler, der er valgt ved baseline imaging, dø, nogle vil flytte ud af rammen af det tildelte billedopsamlingsområde, og nogle vil ændre deres morfologi, hvilket gør mitokondrier meget vanskelige at individualisere i analyse. Imaging mange celler fra begyndelsen øge sandsynligheden for en stor nok stikprøve størrelse af celler til at analysere i slutningen af eksperimentet. Ud over de mere komplekse aspekter af denne billeddannelse teknik, der er nogle direkte begrænsninger for så vidt angår, hvem der kan drage fordel af denne type billeddannelse og analyse. For at drage fuld fordel af automatiseringen af billedopsamlingen skal det anvendte mikroskop have et autofokussystem, der kan håndtere hastigheden af tidsintervaller mellem billeder (dvs. hver 3 s i denne protokol) og kan konsekvent fokusere på den pågældende celle, før hvert billede tages. Derudover uden JOBS-softwaren, som automatiserer hele billedopsamlingsprocessen, bliver denne metode besværlig og potentielt umulig afhængigt af antallet af celler, der afbildes, da det ville kræve manuelt at finde og billedbehandle hver celle igen på det rette tidspunkt. Endelig er denne billeddannelsesmetode ikke immun over for spørgsmålet om fotobleaching. Af denne grund, som med enhver langsigtet erhvervelsesmetode, er det vigtigt at vælge fluorescerende markører, der er mindre modtagelige for fotobleaching og at skræddersy billedopkøb for at undgå dette problem så meget som muligt.
Denne teknik adskiller sig fra andre, der i øjeblikket anvendes på en afgørende måde. I modsætning til andre time-lapse undersøgelser, kræver denne teknik ikke billeddannelse på samme position i brønden hele tiden, heller ikke kræver manuel bevægelse af pladen til billedet andre områder. Dette giver forskerne mulighed for at afbilde mange celler under mange forhold i en 24 timers tidsramme. Derfor giver evnen til at udføre denne billeddannelse og analyse på mange celler i hver brønd de samme befolkningsoplysninger, man ville få ved bredt at studere en stor gruppe celler, samtidig med at der gives specifikke foranstaltninger fra hver celle afbildet. Mens nogle særlige forhold til denne metode måske ikke gælder for andre billedopsamlingsmetoder (skitseret ovenfor), opvejer fordelene komplikationerne med den type analyse, der er mulig efter erhvervelsen. Denne teknik gør det muligt for forskere at se de nøjagtige konsekvenser af forskellige behandlinger på mitokondriesystemet, og dermed på de dyrkede astrocytter.
Derudover er denne metode meget tilpasses til mange forskellige videnskabelige spørgsmål vedrørende mitokondrie adfærd og roller i specifikke sammenhænge. Her omhandler den skitserede protokol specifikt med kultiverede astrocytter. Men mange andre celletyper kan bruges, og de behandlinger, der kan testes, er kun begrænset af de spørgsmål, der undersøges. Denne type billeddannelse har potentiale til at fremme den kollektive viden og forståelse af mitokondrie adfærd, de underliggende mekanismer, der fører til mitokondrie dysfunktion, og virkningerne af mange patologier på den medfødte dynamik til stede i forskellige typer af celler.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af et Synapsis Foundation stipendium tildelt KR og Lausanne University Hospital (CHUV). Forfatterne takker Nikon for deres hjælp, især J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |