यह लेख मिटोटिमर बायोसेंसर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के माइटोकॉन्ड्रियल समय-चूक इमेजिंग और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस, रेडॉक्स राज्य और टर्नओवर के परिणामस्वरूप मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए विधि का वर्णन करता है।
जबकि न्यूरोनल स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों पर बहुत ध्यान दिया गया है, हाल के सबूत दर्शाता है कि एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और कार्य अनुभूति में फंसाया जाता है। यह लेख एक माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर: मिटोटिमर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के समय-चूक इमेजिंग के लिए विधि का वर्णन करता है। माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस और रेडॉक्स राज्य का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और अनूठा उपकरण है। यहां, संस्कृति, छवि अधिग्रहण और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।
एस्ट्रोसाइट्स मस्तिष्क हो्योसाइटसिस के रखरखाव में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। वे शायद सबसे अच्छी तरह से मस्तिष्क में महत्वपूर्ण संरचनात्मक भूमिकाओं के लिए जाना जाता है, रक्त मस्तिष्क बाधा1 के भाग के रूप में और मस्तिष्क2भर में न्यूरॉन्स और synapses का समर्थन करके । न्यूरॉन्स का एस्ट्रोसाइट समर्थन संरचनात्मक 3 और मेटाबोलिक4 ,5दोनों है , जिसमें एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोजेनेसिस और सिंप्टोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं, जबकि सक्रिय न्यूरॉन्स 4 ,6,7को लैक्टेट जैसे प्रमुख मेटाबोलाइट्स भी प्रदान करते हैं। संरचनात्मक समर्थन की भूमिका से परे, एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय कोशिकाएं हैं जो सीए2 + सिग्नलिंग और बफरिंग (सहज माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + प्रवाह सहित)8,9,कश्मीर+ बफरिंग10में भाग लेती हैं, और चोट के समय मस्तिष्क की जरूरतों के अनुकूल और प्रतिक्रिया कर सकती हैं11,12 . इस तरह की गतिशील कोशिकाओं होने के नाते, एस्ट्रोसाइट्स में मजबूत ऊर्जा आवश्यकताएं होती हैं, जिनके लिए एक कुशल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की आवश्यकता होती है। अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)13को बफर करने में भी इन माइटोकॉन्ड्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका है । ऊर्जा उत्पादन और आरओएस बफरिंग की उनकी व्यक्तिगत या स्थानीय भूमिकाओं के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया एक नेटवर्क14के रूप में कार्य करता है। इस अर्थ में, वे क्रमशः15,नए/कम माइटोकॉन्ड्रिया और पुराने/ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करते हुए विखंडन और संलयन माइटोकॉन्ड्रिया के बीच संतुलन बनाए रखते हैं । एक सेल की समग्र रेडॉक्स स्थिति का अंदाजा माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की रेडॉक्स स्थिति से लगाया जा सकता है। पैथोलॉजी में, यह जानकारी का एक महत्वपूर्ण टुकड़ा है जो प्रकाश डाल सकता है जिस पर कोशिकाएं बेहतर ढंग से काम नहीं कर रही हैं।
हाल के वर्षों में, कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की गतिशीलता और कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई सेंसर विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, ऊर्जा विनिमय (एटीपी), रेडॉक्स स्टेट (NADH/NAD+,ROS), और एंजाइमेटिक कार्यक्षमता (सीएएएमपी, सीए2 +,जेडएन2 +)को मापने वाले सेंसर वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन16के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। उनमें से, माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान (आकार, आकार, सतह क्षेत्र), गतिशीलता (गति, विस्थापन), और गतिशीलता (संलयन और विखंडनीय घटनाओं), साथ ही समग्र माइटोकॉन्ड्रियल टर्नओवर दर और रेडॉक्स राज्य में परिवर्तनों का पालन करने की अनुमति देता है। मिटोटाइमर एक उत्परिवर्ती लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, drFP58317है, जिसमें मानव साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस18, 19के उपइकैण आठवीं से एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नलहै, जो हरे (488 एनएम) में नए संश्लेषित माइटोकॉन्ड्रिया और लाल (555 एनएम) में ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए है। हरे (488 एनएम) और लाल (555 एनएम) फ्लोरेसेंस अनुपात का उपयोग करना व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया, उनके आकृति विज्ञान विश्लेषण, संलयन/विखंडन घटनाओं, और रेडॉक्स राज्य इतिहास20,21के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस अनूठी संपत्ति का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया की शारीरिक और रोग भूमिकाओं के बारे में कई वैज्ञानिक सवालों की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इसलिए कई अलग-अलग सेल प्रकारों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र का अनावरण करने के लिए बहुत आशाजनक है।
हमने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया के गतिशील और विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स इन विट्रो और वीवो22 में कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक नया लेंटीवायरल वेक्टर (एलवी-जी1-मिटोटाइमर-MiR124T, इसके बाद एलवी-जी1-मिटोटाइमर कहाजाताहै) विकसित किया है। एलवी-जी 1-मिंटोटाइमर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर gfaABC1D के एक कटे हुए संस्करण का उपयोग करता है, जिसमें B3 एन्हांसर (gfaABC1D (B3) कहा जाता है, इसके बाद पहले वर्णित miR124T न्यूरोनल डिटरगेटिंग सिस्टम23के साथ संयुक्त है। यह एस्ट्रो में एस्ट्रोसाइट्स और वीवो22में माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर की अनन्य अभिव्यक्ति की अनुमति देताहै । यहां प्रस्तुत चूहे हिप्पोकैम्पस एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति का प्रदर्शन करने और उन्हें एलवी-जी1-मिटोटाइमर बायोसेंसर से लैस करने के लिए विभिन्न कदम हैं, साथ ही लगातार कई घंटों/दिनों के दौरान एस्ट्रोसाइट माइटोकॉन्ड्रिया के व्यवहार का पालन करने के लिए विभिन्न माइक्रोस्कोपी कदम हैं।
यहां, एक सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की गतिशीलता और कारोबार का पालन करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तावित है। कोशिकाओं के एक निश्चित समूह या एक समय में एक व्यक्तिगत कोशिका पर एक समय-चूक दृष्टिकोण के विपरीत (अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है)24,25,शोधकर्ता एक ही व्यक्तिगत कोशिकाओं पर कई दिनों के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम के विकास का पालन कर सकते हैं। एकल अच्छी तरह से लाइव इमेजिंग के विपरीत जहां प्रकाश जोखिम के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है, और कई व्यक्तिगत कोशिकाओं का चयन कम संभव है, प्रस्तावित विधि इस माइक्रोस्कोप की एक अच्छी तरह से विभिन्न क्षेत्रों में कई विभिन्न कोशिकाओं को छवि बनाने और उन्हें फिर से छवि करने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर उन समान कोशिकाओं पर वापस आने की क्षमता का लाभ उठाती है। ब्याज की प्रत्येक कोशिका पर प्रत्येक मापा मापदंड के लिए किए गए एक आधार रेखा के लिए सामान्यीकरण के लिए धन्यवाद, यह माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की जटिलता को ध्यान में रखता है और अपनी आधारभूत छवि के सापेक्ष प्रत्येक कोशिका पर उपचार के प्रभाव की जांच करता है। माइक्रोस्कोप की क्षमता स्वायत्त रूप से एक समय में 16 कुओं तक इमेजिंग के इस प्रकार को पूरा करने के लिए (इमेजिंग 5 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह) माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की विषमता के लिए अनुमति देता है जो विभिन्न दिनों में विभिन्न स्थितियों इमेजिंग के साथ आने वाली प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के बिना विश्लेषण के दौरान ठीक से ध्यान में रखा जा सकता है।
संस्कृतियों की गुणवत्ता, एलवी-जी1-माइटोटाइमर बायोसेंसर, माइक्रोस्कोप और उद्देश्यों के प्रकार, और उपयुक्त कोशिकाओं का चयन व्यक्त करने वाले वायरल संक्रमणों का स्तर महत्वपूर्ण चर हैं जो इस प्रोटोकॉल में यथासंभव सुसंगत रहना चाहिए। सेल घनत्व, वेक्टर के प्रकार, और वायरल टाइटर्स को प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि पिछले काम से पता चलता है कि एलवी-जी 1-मिटोटाइमर अभिव्यक्ति में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और गतिशीलता21, 22,26, 27के लिए कोई हानिकारक परिणाम नहीं है, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि कोशिकाओं के लिए एकाग्रता विषाक्त नहीं है (उदाहरण के लिए, नियंत्रण में कोशिकाओं की कुल संख्या की जांच अच्छीतरहसे)। जैसा कि एक फोकल प्लेन का उपयोग किया जाता है, एस्ट्रोसाइट्स होना चाहिए: (1) जितना संभव हो उतना सपाट, (2) अन्य लेबल कोशिकाओं से अलग (पकवान में विस्थापन के मामले में विश्लेषण को सरल बनाने के लिए), और (3) उच्च फ्लोरेसेंस स्तर रखते हैं। चूंकि संस्कृति में कोशिकाएं आकृति विज्ञान में अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती हैं, इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली अत्यधिक विषम हो सकती है। इस संदर्भ में, आरओआई का विश्लेषण करना (और पूरी कोशिका नहीं) कुछ समस्याग्रस्त क्षेत्रों, जैसे कि पेरिन्यूक्लियर क्षेत्रों के लिए क्षतिपूर्ति करता है, और परिवर्तनशीलता को कम करता है। अपेक्षाकृत समान कोशिकाओं और नमूने पर यथासंभव अधिक से अधिक कोशिकाओं पर आधारभूत करना आवश्यक है। नतीजतन, उच्च सामग्री अधिग्रहण और विश्लेषण माइक्रोस्कोप आदर्श रूप से अनुकूल हैं। इस देशांतर निगरानी के दौरान, बायोसेंसर ब्लीचिंग से बचने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में अधिक नहीं करना भी महत्वपूर्ण है।
यह इमेजिंग विधि इसकी जटिलताओं के बिना नहीं है, और पूरे प्रोटोकॉल में, कई नोट्स शामिल हैं, जो माइक्रोस्कोप के साथ पिछले परीक्षणों के दौरान किए गए समस्या निवारण को ध्यान में रखते हैं। उदाहरण के लिए, इस्तेमाल की गई प्लेट कोटिंग का विकल्प अभीष्ट परख पर निर्भर करता है, लेकिन एस्ट्रोसाइट प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सबसे उपयुक्त विकल्पों के लिए सिफारिशों को शामिल किया गया है। इसके अतिरिक्त, अंतरकोशिकीय परिवर्तनशीलता के कारण प्रति शर्त कम से कम 5 कोशिकाओं पर छवि अधिग्रहण किया जाना चाहिए। अधिक विशेष रूप से, बेसलाइन इमेजिंग में चयनित कुछ कोशिकाएं मर जाएंगी, कुछ सौंपे गए छवि अधिग्रहण क्षेत्र के फ्रेम से बाहर निकल जाएंगी, और कुछ अपनी आकृति विज्ञान को बदल देंगे, जिससे माइटोकॉन्ड्रिया विश्लेषण में व्यक्तिगत होना बहुत मुश्किल हो जाएगा। शुरुआत से कई कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग के अंत में विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं के एक बड़े पर्याप्त नमूना आकार की संभावना में वृद्धि। इस इमेजिंग तकनीक के अधिक जटिल पहलुओं के अलावा, जहां तक इमेजिंग और विश्लेषण के इस प्रकार से लाभ हो सकता है, कुछ एकमुश्त सीमाएं हैं। छवि अधिग्रहण के स्वचालितीकरण का पूरा लाभ उठाने के लिए, उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में एक ऑटोफोकस सिस्टम होना चाहिए जो छवियों के बीच समय अंतराल की गति को संभाल सके (यानी, इस प्रोटोकॉल में हर 3 एस) और प्रत्येक छवि को लेने से पहले लगातार प्रश्न में सेल पर ध्यान केंद्रित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, जॉब्स सॉफ्टवेयर के बिना, जो पूरी छवि अधिग्रहण प्रक्रिया को स्वचालित करता है, यह विधि कोशिकाओं की संख्या के आधार पर दुरूह और संभावित रूप से असंभव हो जाती है क्योंकि इसे उचित समय बिंदु पर प्रत्येक कोशिका को फिर से खोजने और इमेजिंग की आवश्यकता होगी। अंत में, यह इमेजिंग विधि फोटोब्लैचिंग के मुद्दे से प्रतिरक्षा नहीं है। इस कारण से, किसी भी दीर्घकालिक अधिग्रहण विधि के साथ, फ्लोरोसेंट मार्कर चुनना महत्वपूर्ण है जो फोटोब्लैचिंग के लिए कम संवेदनशील हैं और जितना संभव हो इस मुद्दे से बचने के लिए छवि अधिग्रहण दर्जी करते हैं।
यह तकनीक वर्तमान में एक महत्वपूर्ण तरीके से उपयोग किए जाने वाले अन्य लोगों से अलग है। अन्य समय-चूक अध्ययनों के विपरीत, इस तकनीक को पूरे समय में एक ही स्थिति पर इमेजिंग की आवश्यकता नहीं होती है, न ही अन्य क्षेत्रों को छवि बनाने के लिए प्लेट के मैनुअल आंदोलन की आवश्यकता होती है। यह शोधकर्ताओं को एक 24 घंटे की समय सीमा में कई स्थितियों में कई कोशिकाओं को छवि करने की क्षमता की अनुमति देता है । नतीजतन, प्रत्येक कुएं में कई कोशिकाओं पर इस इमेजिंग और विश्लेषण को पूरा करने की क्षमता एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो कोशिकाओं के एक बड़े समूह का मोटे तौर पर अध्ययन करने से प्राप्त होती है, जबकि इसके अतिरिक्त प्रत्येक कोशिका से विशिष्ट उपाय प्रदान करती है। जबकि इस विधि के लिए कुछ विशिष्टताएं अन्य छवि अधिग्रहण विधियों (ऊपर उल्लिखित) पर लागू नहीं हो सकती हैं, लाभ अधिग्रहण के बाद संभव विश्लेषण के प्रकार के साथ जटिलताओं से पल्ला झाड़ लेते हैं। यह तकनीक शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम पर विभिन्न उपचारों के सटीक असर को देखने की अनुमति देती है, और नतीजतन, सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स पर।
इसके अतिरिक्त, यह विधि विशिष्ट संदर्भों में माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार और भूमिकाओं के बारे में कई अलग-अलग वैज्ञानिक प्रश्नों के लिए अत्यधिक अनुकूलन योग्य है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेष रूप से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के साथ सौदों। हालांकि, कई अन्य सेल प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, और जिन उपचारों का परीक्षण किया जा सकता है, वे केवल जांच किए जा रहे प्रश्नों द्वारा सीमित हैं। इमेजिंग के इस प्रकार के सामूहिक ज्ञान और माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार की समझ अग्रिम करने की क्षमता है, अंतर्निहित तंत्र है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग के लिए नेतृत्व, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद सहज गतिशीलता पर कई विकृतियों के प्रभाव।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को केआर और लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल (CHUV) को सम्मानित एक सिनेप्सिस फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों को उनकी मदद के लिए Nikon धंयवाद, विशेष रूप से जे Gannevat ।
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |