Denne artikkelen beskriver metoden for mitokondrie-tidsforløpavbildning av astrocyttkulturer utstyrt med MitoTimer biosensor og den resulterende multiparametriske analysen av mitokondriedynamikk, mobilitet, morfologi, biogenese, redokstilstand og omsetning.
Mens mye oppmerksomhet har blitt gitt til mitokondrieendringer på nevronnivå, viser nyere bevis at mitokondriedynamikk og funksjon i astrocytter er implisert i kognisjon. Denne artikkelen beskriver metoden for tidsforløpavbildning av astrocyttkulturer utstyrt med en mitokondriebiosensor: MitoTimer. MitoTimer er et kraftig og unikt verktøy for å vurdere mitokondriedynamikk, mobilitet, morfologi, biogenese og redokstilstand. Her presenteres de forskjellige prosedyrene for kultur, bildeanskaffelser og påfølgende mitokondrieanalyse.
Astrocytter er kritiske aktører i vedlikehold av hjernen homeostase. De er kanskje mest kjent for å ha betydelige strukturelle roller i hjernen, som en del av blod-hjernebarrieren1 og ved å støtte nevroner og synapser i hele hjernen2. Astrocyttstøtte av nevroner er både strukturell3 og metabolsk4,5, med astrocytter som fremmer nevrogenese og synaptogenesis, samtidig som de gir viktige metabolitter som laktat til aktive nevroner4,6,7. Utover rollen som strukturell støtte, astrocytter er aktive celler som deltar i Ca2 + signalering og bufring (inkludert spontan mitokondrie Ca2 + tilstrømninger)8,9, K+ buffering10, og kan tilpasse seg og reagere på hjernens behov i tider med skade11,12 . Som slike dynamiske celler har astrocytter robuste energibehov, noe som krever et effektivt mitokondrienettverk. Disse mitokondriene har også en avgjørende rolle i buffering av overdreven reaktive oksygenarter (ROS)13. I tillegg til deres individuelle eller lokale roller som energigenerering og ROS-bufring, fungerer mitokondrier som et nettverk14. I denne forstand opprettholder de likevekt mellom fisjon og fusjon av mitokondrier, som representerer nye / reduserte mitokondrier og eldre / oksidert mitokondrier, henholdsvis15. Den generelle redokstilstanden til en celle kan måles av redokstilstanden til mitokondrienettverket. I patologi er dette et kritisk stykke informasjon som kan kaste lys over hvilke celler som kanskje ikke fungerer optimalt.
De siste årene har mange sensorer blitt utviklet for å studere dynamikken og funksjonene til mitokondrier i celler. Sensorer som måler energiutveksling (ATP), redokstilstand (NADH/NAD+, ROS) og enzymatisk funksjonalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) brukes for tiden i studiet av mitokondriefunksjon16. Blant dem tillater MitoTimer å følge endringene i mitokondriemorfologi (størrelse, form, overflateareal), mobilitet (hastighet, forskyvning) og dynamikk (fusjons- og fisjonshendelser), samt den generelle mitokondrieomsetningshastigheten og redokstilstanden. MitoTimer er et mutant rødt fluorescerende protein, drFP58317, med et mitokondriesignal fra subenhet VIII av humant cytokrom coksidase 18,19 for å visualisere nylig syntetiserte mitokondrier i grønt (488 nm) og oksidert mitokondrier i rødt (555 nm). Ved hjelp av det grønne (488 nm) og røde (555 nm) fluorescensforholdet tillater samtidig evaluering av individuelle mitokondrier, deres morfologianalyse, fusjon / fisjonshendelser og redoks tilstandshistorie20,21. Denne unike egenskapen kan brukes til å undersøke mange vitenskapelige spørsmål om mitokondrienes fysiologiske og patologiske roller og er derfor svært lovende for å avduke de underliggende mekanismene for mitokondriedynamikk i mange forskjellige celletyper.
Vi har nylig utviklet en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, heretter kalt LV-G1-MitoTimer) for å studere mitokondriers dynamikk og funksjoner spesielt i astrocytter in vitro og in vivo22. LV-G1-MitoTimer bruker en avkortet versjon av glial fibrillary acidic protein (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3 enhancer (gfaABC1D (B3), heretter kalt G1) kombinert med den tidligere beskrevne miR124T nevronal detargeting system23. Det tillater eksklusivt uttrykk for mitokondriebiosensoren i astrocytter in vitro og in vivo22. Presentert her er de forskjellige trinnene for å utføre en kultur av rotte hippocampal astrocytter og utstyre dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, samt de forskjellige mikroskopi trinnene for å følge oppførselen til astrocytt mitokondrier i flere påfølgende timer / dager.
Her foreslås en ny metode for å langsgående følge dynamikken og omsetningen av mitokondriesystemet i en kultivert astrocytt. I motsetning til en tidsforløp tilnærming på en fast gruppe celler eller en enkelt celle om gangen (oftest brukt i litteraturen)24,25, kan forskere følge utviklingen av mitokondriesystemet i løpet av flere dager på de samme individuelle cellene. I motsetning til enkeltbrønn levende bildebehandling der høye nivåer av lyseksponering er nødvendig, og valget av mange individuelle celler er mindre gjennomførbart, utnytter den foreslåtte metoden dette mikroskopets evne til å bilde flere forskjellige celler i forskjellige områder av en brønn og å komme tilbake til de samme cellene på forskjellige tidspunkter for å avbilde dem på nytt. Takket være normalisering av en basislinje utført for hvert målte kriterium på hver interessecelle, tar det hensyn til mitokondriesystemets kompleksitet og undersøker effekten av behandling på hver celle i forhold til sitt eget basisbilde. Mikroskopets evne til autonomt å utføre denne typen avbildning på opptil 16 brønner om gangen (avbildning av 5 celler per brønn) gjør det mulig å ta hensyn til heterogeniteten til mitokondriesystemet under analyse uten eksperimentell variasjon som følger med avbildning av ulike forhold på forskjellige dager.
Kvaliteten på kulturene, nivåene av virusinfeksjoner som uttrykker LV-G1-MitoTimer biosensor, type mikroskop og mål, og valg av egnede celler er kritiske variabler som må forbli så konsistente som mulig i denne protokollen. Celletetthetene, typen vektor og virale titere kan tilpasses i henhold til spørsmålet. Selv om tidligere arbeid viser at LV-G1-MitoTimer-uttrykket ikke har skadelige konsekvenser for mitokondriefunksjon og dynamikk21,22,26,27, er det viktig å verifisere at konsentrasjonen ikke er giftig for cellene (for eksempel å sjekke det totale antall celler i kontrollbrønn). Som et enkelt fokusplan brukes, bør astrocytter være: (1) så flate som mulig, (2) isolert fra andre merkede celler (for å forenkle analysen i tilfelle forskyvning i parabolen), og (3) har høye fluorescensnivåer. Siden celler i kultur kan være svært variable i morfologi, kan mitokondriesystemet være svært heterogent. I denne sammenhengen kompenserer analyse av ROIer (og ikke hele cellen) for noen problematiske områder, for eksempel perinukære områder, og reduserer variasjonen. Det er viktig å gjøre grunnlinjen på relativt like celler og prøve så mange celler som mulig. Følgelig er høy innholdsanskaffelse og analysemikroskoper ideelle. Under denne langsgående overvåkingen er det også viktig å ikke overeksponere cellene for lys for å unngå biosensorbleking.
Denne avbildningsmetoden er ikke uten kompleksitet, og gjennom hele protokollen er flere notater inkludert, som tar hensyn til feilsøking gjort under tidligere tester med mikroskopet. For eksempel avhenger valget av platebelegg som brukes av den tiltenkte analysen, men anbefalinger for de mest egnede valgene for astrocytt primærkulturer er inkludert. I tillegg bør bildeanskaffelse utføres på minst 5 celler per tilstand på grunn av intercellulær variasjon. Mer spesifikt vil noen celler valgt ved baseline-avbildning dø, noen vil bevege seg ut av rammen til det tildelte bildeanskaffelsesområdet, og noen vil endre morfologien, noe som gjør mitokondriene svært vanskelig å individualisere i analyse. Hvis du ser på mange celler fra begynnelsen, øker sannsynligheten for en stor nok utvalgsstørrelse på celler til å analysere på slutten av eksperimentet. I tillegg til de mer komplekse aspektene ved denne bildeteknikken, er det noen direkte begrensninger så langt som hvem som kan dra nytte av denne typen avbildning og analyse. For å dra full nytte av automatiseringen av bildeanskaffelse, må mikroskopet som brukes ha et autofokussystem som kan håndtere hastigheten på tidsintervaller mellom bilder (dvs. hver tredje s i denne protokollen) og kan konsekvent fokusere på den aktuelle cellen før hvert bilde tas. I tillegg, uten JOBS-programvaren, som automatiserer hele bildeanskaffelsesprosessen, blir denne metoden vanskelig og potensielt umulig, avhengig av antall celler som blir avbildet, da det ville kreve manuelt å finne og avbilde hver celle igjen på riktig tidspunkt. Til slutt er denne avbildningsmetoden ikke immun mot spørsmålet om fotobleking. Av denne grunn, som med enhver langsiktig oppkjøpsmetode, er det viktig å velge fluorescerende markører som er mindre utsatt for fotobleaching og for å skreddersy bildeanskaffelse for å unngå dette problemet så mye som mulig.
Denne teknikken skiller seg fra andre som for tiden brukes på en avgjørende måte. I motsetning til andre tidsforløpstudier krever denne teknikken ikke avbildning på samme posisjon i brønnen hele tiden, og det krever heller ikke manuell bevegelse av platen for å avbilde andre områder. Dette gjør det mulig for forskere å avbilde mange celler under mange forhold i en tidsramme på 24 timer. Følgelig gir evnen til å utføre denne avbildningen og analysen på mange celler i hver brønn den samme befolkningsinformasjonen man vil få ved å studere en stor gruppe celler, samtidig som man i tillegg gir spesifikke tiltak fra hver celle som er avbildet. Selv om noen spesifisiteter på denne metoden kanskje ikke gjelder for andre metoder for bildeanskaffelse (skissert ovenfor), oppveier fordelene komplikasjonene med typen analyse som er mulig etter oppkjøpet. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å se de nøyaktige konsekvensene av ulike behandlinger på mitokondriesystemet, og følgelig på de kultiverte astrocyttene.
I tillegg er denne metoden svært tilpassbar til mange forskjellige vitenskapelige spørsmål angående mitokondrieadferd og roller i spesifikke sammenhenger. Her handler den skisserte protokollen spesielt om kultiverte astrocytter. Imidlertid kan mange andre celletyper brukes, og behandlingene som kan testes er begrenset bare av spørsmålene som undersøkes. Denne typen avbildning har potensial til å fremme den kollektive kunnskapen og forståelsen av mitokondrieadferd, de underliggende mekanismene som fører til mitokondrie dysfunksjon, og effekten av mange patologier på den medfødte dynamikken som finnes i forskjellige typer celler.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av et Synapsis Foundation-stipend tildelt K.R. og Lausanne University Hospital (CHUV). Forfatterne takker Nikon for deres hjelp, spesielt J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |