В данной статье описан метод митохондриальной покадровой визуализации культур астроцитов, оснащенных биосенсором MitoTimer, и полученный в результате мультипараметрический анализ митохондриальной динамики, подвижности, морфологии, биогенеза, окислительно-восстановительного состояния и оборота.
Хотя большое внимание уделяется митохондриальным изменениям на нейронном уровне, последние данные показывают, что митохондриальная динамика и функция в астроцитах участвуют в познании. В данной статье описан метод покадровой визуализации культур астроцитов, оснащенных митохондриальным биосенсором: MitoTimer. MitoTimer является мощным и уникальным инструментом для оценки динамики митохондрий, подвижности, морфологии, биогенеза и окислительно-восстановительного состояния. Здесь представлены различные процедуры для культуры, получения изображений и последующего митохондриального анализа.
Астроциты являются критическими игроками в поддержании гомеостаза мозга. Они, пожалуй, наиболее известны тем, что играют значительную структурную роль в мозге, как часть гематоэнцефалического барьера1 и поддерживая нейроны и синапсы по всему мозгу2. Астроцитарная поддержка нейронов является как структурной3, так и метаболической4,5,причем астроциты способствуют нейрогенезу и синаптогенезу, а также обеспечивают ключевые метаболиты, такие как лактат, к активным нейронам4,6,7. Помимо роли структурной поддержки, астроциты являются активными клетками, которые принимают участие в передаче сигналов и буферизации Ca2 + (включая спонтанные митохондриальные ca2 + притоки)8,9,K+ буферизация10, и могут адаптироваться и реагировать на потребности мозга во время травмы11,12 . Будучи такими динамичными клетками, астроциты имеют высокие энергетические потребности, что требует эффективной митохондриальной сети. Эти митохондрии также играют решающую роль в буферизации избыточных активных форм кислорода (АФК)13. В дополнение к их индивидуальным или локальным ролям производства энергии и буферизации АФК, митохондрии функционируют как сеть14. В этом смысле они поддерживают равновесие между делящимися и сливающимися митохондриями, представляющими собой новые/восстановленные митохондрии и более старые/окисленные митохондрии соответственно15. Общее окислительно-восстановительное состояние клетки можно измерить по окислительно-восстановительному состоянию митохондриальной сети. В патологии это важная часть информации, которая может пролить свет на то, какие клетки могут функционировать не оптимально.
В последние годы было разработано множество датчиков для изучения динамики и функций митохондрий в клетках. Например, датчики, измеряющие энергообмен (АТФ), окислительно-восстановительное состояние (NADH/NAD+, ROS) и ферментативную функциональность (цАМФ, Ca2+,Zn 2+),в настоящее время используются при изучении митохондриальной функции16. Среди них MitoTimer позволяет отслеживать изменения морфологии митохондрий (размер, форма, площадь поверхности), подвижность (скорость, смещение) и динамику (события слияния и деления), а также общую скорость оборота митохондрий и окислительно-восстановительное состояние. MitoTimer представляет собой мутантный красный флуоресцентный белок, drFP58317,с митохондриальным сигналом от субъединицы VIII человеческой цитохром-с-оксидазы18,19 для визуализации вновь синтезированных митохондрий в зеленом цвете (488 нм) и окисленных митохондрий в красном (555 нм). Использование соотношения флуоресценции зеленого (488 нм) и красного (555 нм) позволяет одновременно оценивать отдельные митохондрии, анализ их морфологии, события слияния/деления и историю окислительно-восстановительных состояний20,21. Это уникальное свойство может быть использовано для исследования многих научных вопросов, касающихся физиологических и патологических ролей митохондрий, и поэтому является очень перспективным для раскрытия основных механизмов митохондриальной динамики во многих различных типах клеток.
Недавно мы разработали новый лентивирусный вектор (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, далее называемый LV-G1-MitoTimer) для изучения динамики и функций митохондрий, особенно в астроцитах in vitro и in vivo22. LV-G1-MitoTimer использует усеченную версию промотора глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) gfaABC1D, с усилителем B3 (gfaABC1D(B3), далее называемым G1) в сочетании с ранее описанной нейрональной системой детаргетингаmiR124T 23. Позволяет эксклюзивно экспрессировать митохондриальный биосенсор в астроцитах in vitro и in vivo22. Здесь представлены различные шаги по выполнению культуры астроцитов гиппокампа крыс и оснащению их биосенсором LV-G1-MitoTimer, а также различные этапы микроскопии для отслеживания поведения митохондрий астроцитов в течение нескольких последовательных часов / дней.
Здесь предлагается новый метод продольного отслеживания динамики и оборота митохондриальной системы в культивируемом астроците. В отличие от покадрового подхода на фиксированной группе клеток или одной отдельной клетке за раз (чаще всего используется в литературе)24,25,исследователи могут следить за эволюцией митохондриальной системы в течение нескольких дней на одних и тех же отдельных клетках. В отличие от визуализации в реальном времени с одной лункой, где требуются высокие уровни воздействия света, а выбор многих отдельных клеток менее осуществим, предлагаемый метод использует способность этого микроскопа визуализировать несколько различных клеток в разных областях скважины и возвращаться к тем же клеткам в разные моменты времени для их повторного изображения. Благодаря нормализации исходного уровня, проводимого для каждого измеренного критерия для каждой интересующей клетки, он учитывает сложность митохондриальной системы и исследует влияние лечения на каждую клетку относительно ее собственного базового изображения. Способность микроскопа автономно выполнять этот тип визуализации на 16 скважинах одновременно (визуализация 5 клеток на лунку) позволяет правильно учитывать гетерогенность митохондриальной системы во время анализа без экспериментальной изменчивости, которая приходит с визуализацией различных состояний в разные дни.
Качество культур, уровни вирусных инфекций, экспрессирующих биосенсор LV-G1-MitoTimer, тип микроскопа и цели, а также выбор подходящих клеток являются критическими переменными, которые должны оставаться максимально последовательными в этом протоколе. Плотность клеток, тип вектора и вирусные титры могут быть адаптированы в соответствии с вопросом. Хотя предыдущая работа показывает, что экспрессия LV-G1-MitoTimer не имеет вредных последствий для митохондриальной функции и динамики21,22,26,27,важно убедиться, что концентрация не токсична для клеток (например, хорошо проверить общее количество клеток в контроле). В качестве единой фокальной плоскости астроциты должны быть: (1) как можно более плоскими, (2) изолированными от других меченых клеток (для упрощения анализа в случае смещения в чашке) и (3) обладающими высокими уровнями флуоресценции. Поскольку клетки в культуре могут сильно варьироваться по морфологии, митохондриальная система может быть очень гетерогенной. В этом контексте анализ ROI (а не всей ячейки) компенсирует некоторые проблемные области, такие как периноядерные области, и снижает изменчивость. Важно сделать базовую линию на относительно похожих клетках и взять образец как можно большего количества клеток. Следовательно, идеально подходят микроскопы для сбора и анализа высокого содержания. Во время этого продольного мониторинга также важно не подвергать клетки воздействию света, чтобы избежать отбеливания биосенсора.
Этот метод визуализации не лишен своих сложностей, и по всему протоколу включено несколько примечаний, которые учитывают устранение неполадок, выполненных во время предыдущих тестов с микроскопом. Например, выбор используемого пластинчатого покрытия зависит от предполагаемого анализа, но рекомендации по наиболее подходящим вариантам для первичных культур астроцитов были включены. Кроме того, получение изображения должно выполняться по крайней мере на 5 клетках на каждое состояние из-за межклеточной изменчивости. Более конкретно, некоторые клетки, выбранные при базовой визуализации, умрут, некоторые выйдут из рамки назначенной области получения изображения, а некоторые изменят свою морфологию, что делает митохондрии очень трудными для индивидуализации при анализе. Визуализация многих клеток с самого начала увеличивает вероятность достаточно большого размера выборки клеток для анализа в конце эксперимента. В дополнение к более сложным аспектам этого метода визуализации, существуют некоторые прямые ограничения в отношении того, кто может извлечь выгоду из этого типа визуализации и анализа. Чтобы в полной мере воспользоваться преимуществами автоматизации получения изображений, используемый микроскоп должен иметь систему автофокусировки, которая может обрабатывать скорость временных интервалов между изображениями (т. Е. Каждые 3 с в этом протоколе) и может последовательно фокусироваться на рассматриваемой ячейке перед каждым снимком. Кроме того, без программного обеспечения JOBS, которое автоматизирует весь процесс получения изображений, этот метод становится трудным и потенциально невозможным в зависимости от количества визуализируемых клеток, поскольку для этого потребуется ручной поиск и визуализация каждой клетки снова в соответствующий момент времени. Наконец, этот метод визуализации не застрахован от проблемы фотоотбеливания. По этой причине, как и при любом долгосрочном методе получения, важно выбирать флуоресцентные маркеры, которые менее восприимчивы к фотоотбеливанию, и адаптировать получение изображения, чтобы избежать этой проблемы, насколько это возможно.
Этот метод отличается от других, используемых в настоящее время решающим образом. В отличие от других покадровых исследований, этот метод не требует визуализации в одном и том же положении в скважине все время, а также не требует ручного движения пластины для изображения других областей. Это позволяет исследователям получать изображения многих клеток во многих условиях за один 24-часовой таймфрейм. Следовательно, способность проводить эту визуализацию и анализ на многих клетках в каждой лунке дает ту же популяционную информацию, которую можно было бы получить от широкого изучения большой группы клеток, дополнительно предоставляя конкретные меры из каждой изображенной клетки. Хотя некоторые особенности этого метода могут не применяться к другим методам получения изображений (описанным выше), преимущества перевешивают сложности с типом анализа, возможные после получения. Этот метод позволяет исследователям увидеть точные последствия различных методов лечения митохондриальной системы и, следовательно, культивируемых астроцитов.
Кроме того, этот метод легко настраивается на множество различных научных вопросов, касающихся митохондриального поведения и ролей в конкретных контекстах. Здесь изложенный протокол касается конкретно культивируемых астроцитов. Тем не менее, многие другие типы клеток могут быть использованы, и методы лечения, которые могут быть протестированы, ограничены только исследуемыми вопросами. Этот тип визуализации имеет потенциал для продвижения коллективных знаний и понимания митохондриального поведения, основных механизмов, которые приводят к митохондриальной дисфункции, и влияния многих патологий на врожденную динамику, присутствующую в различных типах клеток.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано стипендией Synapsis Foundation, присужденной K.R. и Университетской больнице Лозанны (CHUV). Авторы благодарят Nikon за помощь, в частности J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |