Summary
هنا نقدم طريقة معدلة لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجيفال الإنسان عن طريق إضافة مثبط الصخرة، Y-27632، إلى الطريقة التقليدية. هذه الطريقة أسهل وأقل استهلاكا للوقت ، وتعزز خصائص الخلايا الجذعية ، وتنتج أعدادا أكبر من الخلايا الظهارية عالية الإمكانات لكل من المختبر والتطبيقات السريرية.
Abstract
النسيج اللثة هو الهيكل الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ويلعب أدوارا ذات مغزى في العديد من الوظائف عن طريق الفم. الظهارة اللثة هي بنية مهمة من الأنسجة اللثة ، وخاصة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة. دراسة وظائف الخلايا الظهارية الغنجيفال له قيمة علمية حاسمة، مثل إصلاح العيوب الفموية والكشف عن توافق المواد الحيوية. كما الخلايا الظهارية الغنجية البشرية هي خلايا الكيراتينية متباينة للغاية، وعمرها قصير، وأنها من الصعب المرور. حتى الآن، هناك طريقتان فقط لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الغنجيفال، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية. ومع ذلك، فإن الوقت اللازم للحصول على الخلايا الظهارية باستخدام طريقة الزرع المباشر أطول، ومعدل بقاء الخلية من الطريقة الأنزيمية أقل. سريريا، الحصول على النسيج الغنجيفال محدودة، لذلك هناك حاجة إلى عزل مستقرة وفعالة وبسيطة في المختبر ونظام الثقافة. قمنا بتحسين الطريقة الأنزيمية التقليدية بإضافة Y-27632 ، وهو مثبط كيناز (ROCK) مرتبط ب Rho ، والذي يمكن أن يعزز بشكل انتقائي نمو الخلايا الظهارية. لدينا طريقة انزيمية معدلة يبسط خطوات الطريقة الأنزيمية التقليدية ويزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية، والتي لديها مزايا كبيرة على طريقة explant المباشرة وطريقة الأنزيمية.
Introduction
اللثة البشرية ، وهي بنية الدفاع الخط الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ، ليس فقط حاجزا ماديا وكيميائية1، ولكن أيضا يفرز فئات مختلفة من الوسطاء الالتهابيين الذين يشاركون في الاستجابات المناعية ويشكلون حاجزا مناعيا2،3. تلعب ظهارة اللثة دورا مهما في إصلاح وتجديد أنسجة اللثة. لذلك ، فإن دراسة الدفاع والمناعة من ظهارة اللثة ذات أهمية كبيرة لفهم حدوث التهاب اللثة وتشخيصه وعلاجه. عزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجية من الأنسجة الغنجية البشرية هي الخطوة الأولى المطلوبة لدراسة ظهارة الغنجيفال. يتطلب هذا الإجراء عمليات أساسية مثل إنتاج خلايا البذور لهندسة الأنسجة ، والنماذج المختبرية للأمراض المرتبطة باللثة ، ومواد لإصلاح عيوب اللثة.
تتميز الخلايا الظهارية الغنجية الأولية بانخفاض معدل الانقسام في المختبر4، وقد بحث الباحثون عن طريقة عزل وزراعة مثالية لعقود. حتى الآن، اثنين من تقنيات مختلفة، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية، وتستخدم عادة في المختبرات للحصول على خلايا الظهارة gingival الأولية في المختبر4،5. طريقة explant المباشر له مزايا مثل شرط وجود كمية أقل من عينات الأنسجة وإجراءات العزل البسيطة ، ولكن لديها مساوئ وقت أطول للثقافة والتعرض للتلوث5. على الرغم من أن الأسلوب الأنزيمي يقصر وقت الثقافة المطلوب ، إلا أن الكفاءة منخفضة نسبيا وتختلف اعتمادا على الإنزيمات والمتوسطة المستخدمة. وأظهر Kedjarune وآخرون6 أن طريقة الزرع المباشر، التي تتطلب المزيد من الوقت قبل الثقافة الفرعية (أسبوعين)، تبدو أكثر نجاحا لزراعة الخلايا الظهارية الغنجية مقارنة بصورة الأنزيمية. ومع ذلك، وبمقارنة هاتين الطريقتين، وجد كلينغبيل وآخرون 7 أن الطريقة الأنزيمية كان لها أفضل النتائج للثقافات الأولية للخلايا الظهارية الفموية، وكان من الممكنالحصول على الغلة المثالية للخلايا في أقصر فترة زمنية (11.9 يوما مقابل 14.2 يوما).
لذلك ، كان من المهم تطوير طريقة أكثر ملاءمة وفعالية لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الفموية4. كنا قد ذكرت سابقا أن إضافة Y-27632, مثبط كيناز البروتين المرتبطة رو (روك), يبسط إجراء العزل من خلايا البشرة الأولية الإنسان وخلايا القرنية منأنسجةالجلد الكبار 8,9,10. طورنا G-المتوسطة، وسيلة تلقيح مشروطة جديدة أن يفصل تلقائيا البشرة من الخلايا الجلدية ويدعم نمو وغلة الخلايا البشرةالأولية 8،9،10. في هذه الدراسة، طورنا تقنية جديدة للعزل والثقافة الخالية من المصل للخلايا الظهارية الغنجية من خلال الجمع بين G-medium وY-27632. في جوهرها ، ويستند أسلوبنا على تبسيط الطريقة الأنزيمية التقليدية من خطوتين ، لذلك قارنا طريقتنا الجديدة مع طريقة الزرع المباشر. هذه الطريقة الأنزيمية المعدلة تقصر بشكل كبير الوقت اللازم لفصل الخلايا الظهارية الغنجية عن الأنسجة الغنجيفالية وتزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية الغنجيفالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول هي أنسجة النخل البالغ الطازجة التي يتم التخلص منها من استخراج الأسنان المتضررة في قسم جراحة الوجه والفكين وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسة (البروتوكول رقم 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 GR201711، التاريخ: 02-27-2017).
1. الاستعدادات
- جمع الأنسجة النهمية الكبار الطازجة في أنابيب 15 مل تحتوي على 10 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) تكملها 3٪ البنسلين / العقدية (P /S) والحفاظ على الأنسجة عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تعامل مع الأنسجة كما هو مفصل أدناه في غضون 24 ساعة بعد استئصالها.
2. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة
- إعداد حل الغسيل: 3٪ P/ S. ميكس 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 1.5 مل من البنسلين (100 U/mL) و 1.5 مل من الستربتومايسين (100 ملغم / لتر).
- إعداد 500 مل من المتوسط المحتوي على عامل النمو (يسمى G-medium): DMEM/F12 (3:1) متوسط يحتوي على 1٪ P/S، 2٪ ملحق B27، 20 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)، 40 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2)، و 40 ميكروغرام / مل من fungizone.
- إعداد حلول الهضم إنزيم للطريقة الجديدة: حل 125 ملغ من مسحوق ديسباس و 125 ملغ من مسحوق الكولاجين من النوع الأول في 50 مل من DMEM.
ملاحظة: تصفية جميع الحلول الانزيم من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية. - إعداد 500 مل من المتوسط لتحييد الهضم الأنزيمي: 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ P / S في المتوسط DMEM.
3. طريقة الزرع المباشر
- معالجة الأنسجة الغنجية مسبقا
- غسل الأنسجة gingival مع 5 مل من الإيثانول 75٪ لمدة 30 s. ثم، شطف مرتين مع 5 مل من محلول الغسيل (الخطوة 2.1) لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إجراء جميع يغسل في أطباق زراعة الخلايا بقطر 50 ملم.
- غسل الأنسجة gingival مع 5 مل من الإيثانول 75٪ لمدة 30 s. ثم، شطف مرتين مع 5 مل من محلول الغسيل (الخطوة 2.1) لمدة 5 دقائق.
- Gingival ثقافة الخلايا الظهارية
- قطع الأنسجة gingival إلى 1 ملم3 قطع ومبعثر لهم في طبق ثقافة الخلية 100 ملم. استخدام ملقط مدببة غرامة ومقص العيون لعمليات القطع.
- أضف G-medium (الخطوة 2.2) إلى طبق الثقافة. ثم، احتضان طبق الثقافة في حاضنة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية. استخدم مجهر مقلوب (40x) لفحص الأنسجة كل 24 ساعة.
- إزالة قطع الأنسجة gingival عندما انتشرت الخلايا الظهارية إلى 2-5 ملم في القطر حول قطع الأنسجة. تغيير G-المتوسطة كل 2-4 أيام.
4. طريقة الأنزيمية المعدلة الجديدة
- معالجة الأنسجة الغنجية مسبقا
- لهذا، اتبع نفس الخطوات كما هو موضح لأسلوب explant المباشر الخطوة 3.1.1.
- هضم الأنسجة الغنجية
- قطع الأنسجة gingival إلى قطع صغيرة، ما يقرب من <1 ملم في الحجم، مع اثنين من ريش معقمة. كرر عملية التقطيع بشفرة جراحية.
- إضافة 1 مل من 2.5 ملغم / مل ديسباس + كولاجيناز الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل تحتوي على قطع الأنسجة gingival، ومن ثم احتضان أنبوب لمدة 15-20 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية.
- عندما يصبح النسيج شفافا وفلوكولنت ، أضف 1 مل من محلول التحييد لإنهاء الهضم. مزيج تماما الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 10-15 مرات. مرر الحل من خلال فلتر شبكة 100 ميكرومتر.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في الجزء السفلي في 10 مل من المتوسطة التي تحتوي على عامل النمو (الخطوة 2.2). نقل تعليق الخلية إلى طبق ثقافة الخلية 100 ملم. أضف 10 ميكرومتر من Y-27632 إلى طبق ثقافة الخلية.
- زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪. استبدل G-medium القديم مع G-medium الطازج كل يومين. مراقبة الخلايا في اليوم 1 واليوم 3.
5. تمرير الخلية
- أخرج الطبق من الحاضنة، وأزل الوسط المستهلك واغسله مرتين مع PBS. أضف 2 مل من 0.05٪ تريبسين لكل طبق 100 مم.
ملاحظة: هز الطبق للتأكد من وجود اتصال كاف بين حل تريبسين وأسفل الطبق. - اترك الطبق في حاضنة حوالي 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لعملية الهضم.
- استخدم المجهر (40x) لفحص الخلايا والتأكد من أن معظم الخلايا قد انفصلت عن الجزء السفلي من الطبق.
- أضف 2 مل من محلول الإبطال لإيقاف الهضم ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. ماصة صعودا وهبوطا 10-15 مرة. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة supernatant ببطء. إعادة إنفاق الخلايا مع 10 مل من G-المتوسطة وعدد الخلايا.
- أضف حوالي 1 × 106 خلايا في 10 مل من G-medium و 10 ميكرومتر Y-27632 لكل طبق 100 مم.
- تجديد G-المتوسطة وY-27632 كل يومين. عرض الخلايا في اليوم 1 واليوم 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 رسم تخطيطي لطريقة الإكسبلانت المباشرة والأسلوب الأنزيمي المعدل. طريقة explant المباشرة لا تحتاج إلى أي إنزيم هضمي خلال العملية برمتها. في المقابل ، عادة ما تحتاج الطريقة الأنزيمية التقليدية إلى مجموعتين من الإنزيمات الهضمية ، ديسباس والكولاجيناز ، لفصل الورقة الظهارية عن طبقة الخلايا الليفية الأساسية ، ثم التريبسين لإطلاق الخلايا الظهارية إلى تعليق. أسلوبنا الجديد يغفل خطوة الانفصال وهو أسلوب مبسط الأنزيمية. وعلاوة على ذلك، إضافة Y-27632 إلى G-المتوسطة يعزز بشكل فعال نمو الخلايا الظهارية. عادة ما تستغرق طريقة الزرع المباشر حوالي أسبوعين حتى تنمو الخلايا الظهارية الغنجية بما يكفي للمرور وهي ملوثة بسهولة. ومع ذلك ، فإن عدد الخلايا الظهارية الغنجية التي تم الحصول عليها من خلال الطريقة الجديدة أكبر بكثير من تلك التي تم الحصول عليها عن طريق طريقة الزرع المباشر ويستغرق فقط في المتوسط 8 أيام لتلبية متطلبات التمرير.
الشكل 1: مقارنة طريقة الزرع المباشر والأسلوب الجديد. (أ) مخطط يوضح عملية طريقة الزرع المباشر. يتم وضع قطع الأنسجة gingival في طبق الثقافة. يتم استزراع الخلايا الظهارية في G-medium وتنمو من قطع الأنسجة. عادة ما تستغرق طريقة الزرع المباشر حوالي 13 يوما حتى تصل الخلايا الظهارية إلى التقاء 80٪. (ب)مخطط يبين عملية الأسلوب الأنزيمي الجديد. يتم هضم شظايا الأنسجة الغنجية عن طريق ديسباس والكولاجيناز I ، وبعد ذلك يتم زراعة الكريات الخلية في G-medium مع Y-27632. الطريقة الأنزيمية الجديدة عادة ما يستغرق حوالي 6 أيام للوصول إلى التقاء 80٪ وهو مناسب لتمرير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لوحظت خلايا الظهارية الغنجية البالغة التي أعدتها طريقة الزرع المباشرة والأسلوب الجديد في المجهر في اليومين الثالث والسابع(الشكل 2A). ويمكن رؤية أن الطريقة الجديدة زادت بشكل كبير من إنتاج الخلايا الظهارية الغنجيفال في اليومين الثالث والسابع. تم قياس منحنيات النمو للخلايا الظهارية gingival التي تم الحصول عليها من خلال الطريقة الجديدة وطريقة explant المباشر باستخدام عدة عد الخلايا (CCK-8) في نقاط زمنية مختلفة (1d، 2d، 3d، 4d، 5d، 6d) (الشكل 2B). كان الوقت المضاعف للخلايا المعدة باستخدام الطريقة الجديدة حوالي 1-2 أيام ، ولكن مضاعفة وقت الخلايا المعدة باستخدام طريقة الزرع المباشر كانت حوالي 5-6 أيام. تم حساب غلة الخلية من خلال الطريقتين في اليوم السابع(الشكل 2C)وأظهرت أن عدد الخلايا التي تنتجها الطريقة الجديدة (9 × 106)كان أكثر من ثلاثة أضعاف عدد الخلايا التي تنتجها طريقة الزرع المباشر (3 × 106). ويبين الشكل 2D أن الأمر استغرق حوالي نصف الوقت للطريقة الجديدة (6 أيام) لتحقيق التقاء 80٪ مقارنة مع طريقة الزرع المباشر (13 يوما).
الشكل 2: الأسلوب الأنزيمي الجديد يزيد من إنتاج الخلايا الظهارية الغنجية الأولية. (أ) صور الخلايا الظهارية الغنجية التي أعدتها طريقة الاختلس المباشر (الصف السفلي) وطريقة الأنزيمية الجديدة (الصف العلوي) في اليوم الثالث والسابع بعد التلقيح الأولي. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (ب) تم جمع الخلايا الظهارية Gingival المستزرعة من خلال الطريقة المباشرة وطريقة الأنزيمية الجديدة في الأيام 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 ، وتم تحليل عدد الخلايا الظهارية الغنجيفال باستخدام عدة CCK-8. (ج) بعد 7 أيام من الثقافة، تم فصل الخلايا الظهارية الغنجيفال عن طريق التريبسين وتم جمعها. تم استخدام لوحة عد الخلايا لتحديد عدد الخلايا الظهارية الغنجية التي أعدت بشكل منفصل عن طريق الطريقتين. تم حساب عدد الخلايا من الطريقتين ، والتي تكررت ثلاث مرات بشكل منفصل ، ويتم التعبير عن النتائج كمتوسط عدد الخلايا لكل طبق 100 ملم. (د)يقارن متوسط الوقت للوصول إلى التقاء 80٪ من الخلايا الظهارية gingival الأولية (المقطع 0) التي أعدتها طريقة الأنزيمية الجديدة وطريقة explant المباشر. B و C و D: تم استخدام اختبار الطالب t; تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري; ن = 4؛ **p < 0.01، *p < 0.05 عند مقارنة الأسلوب الأنزيمي الجديد مع طريقة الزرع المباشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أظهر تحليل الفلورة المناعية للخلايا الظهارية الغنجية (في المقطع 3) الذي تم الحصول عليه من خلال الطريقة الجديدة أن التعبير عن CK5 ، CK18، وبان-CK (CK14، CK15، CK16، و CK19) كانت إيجابية (الشكل 3A،C، D)11،12،13،14،15، في حين كان التعبير عن CK10 وفيمينثين منخفضا ( الشكل3B،E)11،16. CK5 و Pan-CK (CK14, CK15, CK16, و CK19) كانت مترجمة بشكل رئيسي في الطبقة القاعدية من الخلايا الظهارية, وهو علامة على إمكاناتها التمايز عالية11,14,15. CK10 هو علامة علىظهارة 11متمايزة ، وفيمينتين هو علامة على الخلايا الليفية gingival16. كان المعدل الإيجابي للكيراتين للخلايا الظهارية الغنجية المعزولة بصورة جديدة أعلى، وخاصة CK5 و CK18 و Pan-CK (الشكل 3A، C،D)، مما يشير إلى أن الخلايا الظهارية الغنجية المعزولة يمكن أن تحافظ على وظيفة غشاء الطابق السفلي جيدة. التعبير المنخفض لعلامة التمايز CK10 (الشكل 3B) يشير إلى أن الخلايا الظهارية gingival لديها إمكانات تمييز عالية. وأظهرت الثقافات المختبرية أن الخلايا الظهارية الغنجية المعزولة بطويل جديد يمكن استزراعها للجيل الثامن، وأشار التعبير المنخفض عن الفيمينتين إلى أن الخلايا الظهارية الغنجية لها نقاء عال، وأنه لا توجد خلايا ليفية جينيفال ملوثة بها وأن كفاءة العزل كانت عالية(الشكل 3E).
الشكل 3:علامات محددة من الخلايا الظهارية gingival (P3) التي أعدتها طريقة الأنزيمية الجديدة. (A-E) تظهر CK5 (أحمر), CK10 (أحمر), CK18 (أحمر), بان-CK (أحمر), وفيمينتين (الأحمر) الخلايا الإيجابية, DAPI (الأزرق) كان يستخدم للطخة النوى. (أ-ج) أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر؛ (D) و (E) أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر; تكررت التجربة أربع مرات بشكل مستقل. (A) ، (C) ، و (D) إظهار التعبير الإيجابي للCK5 ، CK18 ، وعموم CK (CK14 ، 15 ، 16 ، و 19) في الخلايا الظهارية gingival ، في حين (B) و (E) إظهار التعبير المنخفض من CK10 و vimentin في الخلايا الظهارية الغنجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
زادت الطريقة الجديدة من التعبير عن ki67 و p63 و p75NGFR (انخفاض تقارب مستقبلات عامل نمو الأعصاب p75) في الخلايا الظهارية الغنجية الأولية. تم اختيار الخلايا الممر 3 لتحليل Immunofluorescence، والتي كشفت أن التعبير الإيجابي للki67، p63، و P75NGFR كان أعلى من ذلك من الخلايا الظهارية gingival التي تم الحصول عليها عن طريق طريقة explant المباشر (الشكل 4A،C، E). وكانت معدلات التعبير الإيجابي للki67، p63، و p75NGFR 80٪، 98٪، و 96٪ في الطريقة الجديدة، على التوالي، والتي كانت أعلى بكثير من تلك التي ki67 (35٪)، p63 (40٪)، وp75NGFR (47٪) التي تم الحصول عليها عن طريق الطريقة المباشرة(الشكل 4B،D، F). Ki67، p63، و p75NGFR هي علامات الخلايا الجذعية الظهارية عن طريق الفم17. وأشارت هذه النتائج إلى أن الخلايا الظهارية الغنجية الأولية المعزولة والمزرعة باستخدام الطريقة الجديدة تحتوي على مجموعات من الخلايا الجذعية، وتحتوي على إمكانات انتشار عالية، وتحافظ على خصائص الخلايا الجذعية للخلايا الظهارية الغنجية.
الشكل 4:خصائص الخلايا الجذعية للخلايا الظهارية الغنجية (P3) التي تم الحصول عليها من خلال طريقة الزرع المباشر والأسلوب الأنزيمي الجديد. (A), (C), و (E) تظهر الصور immunofluorescence تمثيلية من الخلايا الظهارية gingival في مرور 3 (P3), على التوالي, تظهر ki67 (أحمر), p63 (أحمر), وp75NGFR (أحمر) الخلايا الإيجابية التي تم الحصول عليها من قبل طريقة explant المباشرة وطريقة الأنزيمية الجديدة. تم استخدام DAPI (الأزرق) لتلطيخ النوى. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (ب)، (D)، و (F) تظهر التحليل الكمي للخلايا الإيجابية ki67، الخلايا الإيجابية p63، والخلايا الإيجابية p75NGFR، على التوالي، في الخلايا الظهارية gingival (P3) التي تم الحصول عليها عن طريق طريقة التفسير المباشر والأسلوب الأنزيمي الجديد. تم حساب ما مجموعه 400 خلية لتحديد كل مجموعة، ويظهر متوسط أعداد الخلايا الإيجابية ki67 و p63 و p75NGFR. B و D و F: تم استخدام اختبار الطالب t; تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري; تكررت التجربة أربع مرات بشكل مستقل (n = 4)؛ ** p < 0.01، عند مقارنة الأسلوب الأنزيمي الجديد مع طريقة الزرع المباشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النسيج gingival هو هيكل رئيسي يحافظ على سلامة اللثة والصحة. الخلايا الظهارية Gingival لها أدوار هامة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة ويمكن استخدامها في البحث العلمي والتطبيقات السريرية والمجالات ذات الصلة، بما في ذلك بيولوجيا الفم، وعلم الصيدلة، وعلم السموم، ونقص الغشاء المخاطي عن طريق الفم18. لذلك ، من الضروري تطوير طريقة مستقرة وفعالة لحصاد الخلايا الظهارية الفموية19. الخلايا الظهارية الأولية هي نوع من الخلايا المتمايزة تماما مع عدد قليل من المقاطع وعمر قصير. وقد ثبت أن زراعة الخلايا الظهارية أكثر تعقيدا من زراعة الخلايا الليفية5.
في الوقت الحاضر، تظهر الأدبيات المنشورة أن هناك بروتوكولات مختلفة لعزل وثقافة الخلايا الظهارية. ومع ذلك، طريقتين، أسلوب explant المباشر والأسلوب الأنزيمي، هي الأكثر استخداما بين تلك البروتوكولات. في عام 1910، وصف كاريل وبوروز لأول مرة طريقة للحصول على الخلايا الظهارية الغنجية والبوكال تسمى طريقة الزرع المباشر20. طريقة explant المباشرة لديها مزايا متطلبات الوزن المنخفض لعينات الأنسجة ، وإجراءات أقل تعقيدا ، وأقل تباينا ، ومشاركة أقل في الخطوات ، ولكنها تتمتع بمساوئ تتطلب وقتا طويلا للثقافة وهي عرضة للتلوث5. في عام 1975، أبلغ راينوالد والأخضر لأول مرة عن الطريقة الأنزيمية باستخدام الخلايا الليفية الماوس 3T3 المشععة كطبقة تغذية لثقافة الخلايا الظهارية الفموية في المختبر21. على الرغم من أن هذه الطريقة تحسنت كثيرا من العائد من keratinocytes، كان طبقة الخلية المغذية الماوس المشعع المخاطر البيولوجية المحتملة22. بعد ذلك ، تم تطوير أنظمة الثقافة بدون خلايا مغذية22 وبدون مصل23،24 مما أثبت أن خلايا 3T3 لم تكن ضرورية لثقافات الخلايا الظهارية. على الرغم من أن الأسلوب الأنزيمي يتطلب وقتا أقل للثقافة ، إلا أن الكفاءة منخفضة نسبيا وتختلف وفقا للإنزيمات والمتوسطة المستخدمة25. قارنت عدة مختبرات بين الطريقتين ولاحظ Kedjaruneوآخرون. وخلص شويثا وآخرون26 إلى أن طريقة الزرع المباشر تبدو تقنية بسيطة وناجحة لعزل الخلايا الكيراتينية المخاطية الفموية. ومع ذلك، خلص كلينغبيل وآخرون7 إلى العكس تماما، أي أن الطريقة الأنزيمية أظهرت أفضل النتائج في وقت أقل مع عمر جيد. واستعرضت دراسة استقصائية أجراها في المملكة المتحدة دانيالز وآخرون19 طرق العزلة وزراعة الخلايا في خلايا القرنية البشرية وأفادت بأن 21 مختبرا من أصل 34 مختبرا استجابت استخدمت الطريقة الأنزيمية مع بعض الاختلافات. على الرغم من أن طريقة الزرع المباشر تتطلب أنسجة أقل ولها خطوات معالجة أقل من الطريقة الأنزيمية ، فقد اقترح أن الطريقة الأنزيمية أسرع وأسهل في إدارة6. لذلك ، كان من الضروري تطوير طريقة أكثر ملاءمة وفعالية لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الفموية4. لدينا طريقة جديدة، طريقة مبسطة الأنزيمية التي تستخدم Y-27632 زيادة كبيرة في إنتاج الخلايا الظهارية gingival وتقصير الوقت اللازم لفصل الخلايا الظهارية gingival من الأنسجة الغنجيفال.
ويبين الشكل 2A أن الطريقة الجديدة زادت بشكل كبير من إنتاج الخلايا الظهارية الغنجية في اليومين الثالث والسابع. ويبين الشكل 2B أن الوقت المضاعف للخلايا التي أعدت باستخدام الطريقة الأنزيمية الجديدة كان حوالي 1-2 أيام ولكن استخدام طريقة الزرع المباشر استغرق حوالي 5-6 أيام. كان عدد الخلايا المنتجة باستخدام الأسلوب الأنزيمي الجديد (9 × 106)أكبر بثلاث مرات من طريقة الزرع المباشر (3 × 106)في اليوم السابع(الشكل 2C). استغرقت الخلايا المعدة باستخدام الطريقة الأنزيمية الجديدة 13 يوما لتصبح التقاء بنسبة 80٪، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة، في حين استغرقت طريقة النفع المباشر حوالي أسبوعين6و20.25 ± 1.05 يوما18 و14.2 ± 2.76 يومالتصبح الخلايا التقاءا كاملا قبل الثقافة الفرعية. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأنزيمية الجديدة لم تأخذ سوى 6 أيام لتصبح التقاء بنسبة 80 ٪ ، وهو أقصر بكثير من طريقة النفعية المباشرة من 13 يوما في مختبرنا وطريقة Klingbeil وآخرون7 الأنزيمية من 11.9 ± 2.36 يوما. وجدنا أيضا ظاهرة مثيرة للاهتمام ، أي أن مستعمرات الخلايا الظهارية نمت في بنية متعددة الطبقات في طريقة الزرع المباشر ، في حين لوحظ وجود هيكل أحادي الطبقة موحد باستخدام الطريقة الأنزيمية الجديدة. من الواضح أن المستعمرات متعددة الطبقات الأكثر سمكا تطيل الوقت المطلوب لتصبح التقاء بنسبة 80٪ -100٪. السبب في أن الطريقة الأنزيمية الجديدة تعزز انتشار الخلايا هو إضافة Y-27632 ، وهو مثبط ل ROCK1 و ROCK2. Y-27632 تم الإبلاغ عنه في البداية لآثاره الإيجابية على انتشار الخلايا الظهارية البشرية والتمايز في عام 200827. وذكر تشابمان وآخرون28 أن العلاج مع Y-27632 زاد إلى حد كبير من القدرة التكاثرية للخلايا القرنية وأسفر عن تخليد فعال دون أزمة خلايا يمكن اكتشافها. في دراساتنا السابقة، اكتشفنا أن Y-27632 يبسط إجراء عزل خلايا البشرة الأولية البشرية وخلايا القرنية من أنسجة الجلدالبالغة 8و9و10. وأفاد سترودويك وآخرون29 بأن استخدام 10 ميكرومتر Y-27632 جنبا إلى جنب مع انخفاض الكالسيوم سمح بزراعة الخلايا القرنية البشرية الأولية دون طبقة تغذية الخلية لفترات أطول من الزمن مع الحفاظ على القدرة على التفريق وتشكيل ظهارة طبقية. في هذه الدراسة، زادت الطريقة الأنزيمية الجديدة باستخدام Y-27632 بشكل كبير من حصاد الخلايا الظهارية من خلال إطالة عمرها وتعزيز قدرتها على الانتشار.
الطريقة الأنزيمية التقليدية تحتوي على عمليتين الهضم. الهضم الأول هو فصل الأنسجة الظهارية عن النسيج الضام باستخدام dispase ، الذي يعمل من الجانب السترومي4،5. الهضم الثاني يستخدم عادة التريبسين لفصل الخلايا الظهارية من الأنسجة الظهارية4،5. بسبب تدمير الخلايا الظهارية عن طريق التريبسين ، تتأثر كفاءة الطريقة الأنزيمية4. الأسلوب الأنزيمي الجديد الموصوف هنا هو أسلوب مبسط يغفل خطوة هضم واحدة. الاختلافات الرئيسية بين الطرق الأنزيمية الجديدة والتقليدية تشير إلى بروتوكولات فصل الأنسجة الظهارية من النسيج الضام5. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم الطريقة الجديدة ديسباس والكولاجيناز بدلا من التريبسين في خطوة الهضم ، وبالتالي فإن سلامة الخلايا الظهارية محمية بشكل جيد. سريريا، فإنه من الصعب الحصول على نفس الكمية من الأنسجة من اللثة البشرية من الجلد والغشاء المخاطي البوكال. تتطلب طريقة الزرع المباشر قطعا صغيرة فقط من الأنسجة الغنجية وزرعت عددا أكبر من الخلايا بالمقارنة مع الطريقة الأنزيمية18. عالجنا كمية صغيرة من الأنسجة الظهارية الغنجية باستخدام الطريقة الجديدة وحصدنا كثافة خلايا مرضية للغاية. وهذا يدل على أن الطريقة الجديدة لا تعتمد على كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة التي سيتم توفيرها في البداية. أحد القيود المحتملة للطريقة الجديدة هو أنه يمكن أن تظهر كمية صغيرة (<5٪) تلوث الخلايا الليفية في الثقافة الأولية (المقطع 0)، ولكن يمكن إزالتها بسهولة عن طريق علاج قصير الأجل من 0.05٪ تريبسين كما ذكرت مسبقا9.
في هذه الدراسة، CK5، CK18، وبان-CK (CK14، CK15، CK16، و CK19) كانت إيجابية(الشكل 3A،C، D). وهذا يشير إلى أن الخلايا الظهارية الغنجية المعزولة كانت قادرة على الحفاظ على وظيفة غشاء الطابق السفلي ، وهو ما يتفق مع دراسات أوراززاده وآخرون30 و Kedjaruneوآخرون. يتم التعبير عن CK5 و CK14 بواسطة خلايا غير متمايزة مترجمة في الطبقة القاعدية الظهارية. CK19 توجد عادة في ظهارة بسيطة وفي ظهارة طبقية غير keratinized31. أظهر تحليل immunofluorescence للخلايا الظهارية الغنجية (P3) التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة الأنزيمية الجديدة أن مستويات التعبير من ki67 و p63 و p75NGFR كانت أعلى مما كانت عليه في الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة الزرع المباشر(الشكل 4). تشير هذه النتيجة إلى أن الطريقة الجديدة يمكن أن تحافظ على خصائص الخلايا الجذعية للخلايا الظهارية الغنجية وتعزز إمكانات انتشار الخلايا الظهارية الغنجية. وجدت دراستنا السابقة أن Y-27632 يحافظ على إمكانات الخلايا الجذعية البشرة الجلد بعد التوسع8. وجد وانغ وآخرون أن Y-27632 يسهل انتشار الخلايا الجذعية للأربطة اللثة البشرية وهجرتها وتعددنسلها 32.
وباختصار، فإن الطريقة الأنزيمية المعدلة الجديدة توفر إجراء مبسطا وفعالا لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الأولية للإنسان من الأنسجة الغنجية البالغة. هذه الطريقة الجديدة أسهل وأقل استهلاكا للوقت وتعزز خصائص الخلايا الجذعية ، وبالتالي لديها مزايا واضحة مقارنة بطريقة الزرع المباشر في العديد من المعلمات. هذه الطريقة المتقدمة هي أكثر ملاءمة لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الظهارية عالية الإمكانات سواء بالنسبة للمختبرات أو للتطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) والبرنامج الرئيسي للبحث والتطوير في مقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى X.W. برنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2018GSF118240) إلى J.G. مشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2018WS163) إلى Z.X. ومشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2019WS045) إلى J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
