Summary
Her presenterer vi en modifisert metode for isolasjon og kultur av menneskelige gingival epitelceller ved å legge rockhemmeren, Y-27632, til den tradisjonelle metoden. Denne metoden er enklere, mindre tidkrevende, forbedrer stamcelleegenskapene, og produserer et større antall høypotensiale epitelceller både for laboratoriet og for kliniske anvendelser.
Abstract
Gingivalvevet er den første strukturen som beskytter periodontalt vev og spiller meningsfulle roller i mange orale funksjoner. Gingival epitel er en viktig struktur av gingivalvev, spesielt i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Å studere funksjonene til gingival epitelceller har avgjørende vitenskapelig verdi, for eksempel å reparere orale feil og oppdage kompatibiliteten til biomaterialer. Siden humane gingival epitelceller er svært differensierte keratiniserte celler, er levetiden kort, og de er vanskelige å passere. Så langt er det bare to måter å isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Imidlertid er tiden som kreves for å oppnå epitelceller ved hjelp av den direkte explant-metoden lengre, og celleoverlevelsesgraden til den enzymatiske metoden er lavere. Klinisk er oppkjøpet av gingivalvev begrenset, så det er nødvendig med et stabilt, effektivt og enkelt in vitro-isolasjons- og kultursystem. Vi forbedret den tradisjonelle enzymatiske metoden ved å legge til Y-27632, en Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer, som selektivt kan fremme veksten av epitelceller. Vår modifiserte enzymatiske metode forenkler trinnene i den tradisjonelle enzymatiske metoden og øker effektiviteten til å dyrke epitelceller, som har betydelige fordeler i forhold til den direkte explant-metoden og den enzymatiske metoden.
Introduction
Den menneskelige gingiva, den første linjeforsvarsstrukturen som beskytter periodontalt vev, er ikke bare en fysisk og kjemisk barriere1, men skiller også ut forskjellige klasser av inflammatoriske mediatorer som deltar i immunresponser og utgjør en immunbarriere2,3. Gingival epitel spiller en viktig rolle i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Derfor er det å studere gingival epitelets forsvar og immunitet av stor betydning for å forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen av periodontitt. Isolasjonen og kulturen av gingival epitelceller fra humant gingivalvev er det første trinnet som kreves for å studere gingival epitelet. En slik prosedyre krever grunnleggende operasjoner som å produsere frøceller for vevsteknikk, in vitro-modeller av periodontale tilknyttede sykdommer og materialer for reparasjon av periodontale feil.
Primære gingival epitelceller er preget av en lav divisjonsrate in vitro4, forskere har lett etter en optimal isolasjons- og dyrkingsmetode i flere tiår. Til dags dato brukes to forskjellige teknikker, en direkte explant-metode og en enzymatisk metode, ofte i laboratorier for å oppnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant-metoden har fordeler som kravet om en lavere mengde vevsprøver og enkel isolasjonsprosedyre, men den har ulempene med lengre kulturtid og følsomhet for forurensning5. Selv om den enzymatiske metoden forkorter kulturtiden som kreves, er effektiviteten relativt lav og varierer avhengig av enzymer og medium som brukes. Kedjarune et al.6 viste at den direkte explant-metoden, som krever mer tid før subkultur (2 uker), så ut til å være mer vellykket for å dyrke gingival epitelceller sammenlignet med den enzymatiske metoden. Men sammenlignet med disse to metodene fant Klingbeil et al.7 at den enzymatiske metoden hadde de beste resultatene for primærkulturer av orale epitelceller, og det var mulig å oppnå det optimale celleutbyttet innen kortest tidsperiode (11,9 dager versus 14,2 dager).
Derfor var det viktig å utvikle en mer praktisk og effektiv metode for isolasjon og kultur av orale epitelceller4. Vi har tidligere rapportert at tilsetning av Y-27632, en hemmer av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK), forenkler isolasjonsprosedyren til humane primære epidermale celler og keratinocytter fra voksent hudvev8,9,10. Vi utviklet G-medium, et nytt betinget inokulasjonsmedium som spontant skiller epidermal fra dermale celler og støtter vekst og utbytte av primære epidermale celler8,9,10. I den nåværende studien utviklet vi en ny serumfri isolasjons- og kulturteknikk for gingival epitelceller ved å kombinere G-medium med Y-27632. I hovedsak er vår metode basert på en forenkling av den tradisjonelle to-trinns enzymatiske metoden, så vi sammenlignet vår nye metode med den direkte explant-metoden. Denne modifiserte enzymatiske metoden forkorter betydelig tiden som kreves for å skille gingival epitelceller fra gingivalvev og øker effektiviteten av å dyrke gingival epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant vev som brukes i denne protokollen er ferske voksne gingivalvev kassert fra ekstraksjoner av berørte tenner i Maxillofacial Surgery Department i henhold til retningslinjene fra institusjonens humane forskningsetiske komité (protokollnr. GR201711, Dato: 02-27-2017).
1. Forberedelser
- Samle ferske voksne gingivalvev i 15 ml rør som inneholder 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 3% penicillin/streptomycin (P/S) og hold vevet ved 4 °C.
MERK: Behandle vevet som beskrevet nedenfor innen 24 timer etter eksisjon.
2. Forbered reagenser og kulturmedium
- Forbered vaskeløsningen: 3% P / S. Bland 50 ml PBS med 1,5 ml penicillin (100 U / ml) og 1,5 ml streptomycin (100 mg / l).
- Forbered 500 ml vekstfaktorholdig medium (kalt G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium som inneholder 1% P/S, 2% B27 supplement, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor (EGF), 40 ng/ml fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) og 40 μg/ml fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) og 40 μg/ml fungizon.
- Forbered enzym fordøyelsesløsninger for den nye metoden: Løs opp 125 mg Dispase pulver og 125 mg type I kollagasepulver i 50 ml DMEM.
MERK: Filtrer alle enzymløsningene gjennom en 0,22 μm sil og oppbevar ved 4 °C. - Forbered 500 ml av mediet for å nøytralisere den enzymatiske fordøyelsen: 10% foster bovint serum (FBS) og 1% P / S i DMEM-mediet.
3. Direkte utvisningsmetode
- Gingival vev forbehandling
- Vask gingivalvev med 5 ml 75% etanol i 30 s. Skyll deretter to ganger med 5 ml av vaskeløsningen (trinn 2.1) i 5 min.
MERK: Utfør alle vasker i cellekulturretter med en diameter på 50 mm.
- Vask gingivalvev med 5 ml 75% etanol i 30 s. Skyll deretter to ganger med 5 ml av vaskeløsningen (trinn 2.1) i 5 min.
- Gingival epitelial cellekultur
- Klipp gingivalvevet i 1 mm3 stykker og spred dem i en 100 mm cellekulturrett. Bruk finspissede tang og oftalmisk saks til skjæreoperasjonene.
- Legg G-mediet (trinn 2.2) til kulturretten. Deretter inkuberer du kulturretten i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C. Bruk et invertert mikroskop (40x) for å undersøke vevet hver 24.
- Fjern gingivalvevsstykkene når epitelcellene har forplantet seg til en 2-5 mm i diameter rundt vevsstykkene. Bytt G-medium hver 2-4 dager.
4. Den nye modifiserte enzymatiske metoden
- Gingival vev forbehandling
- For dette, følg de samme trinnene som beskrevet for den direkte utvisningsmetoden, trinn 3.1.1.
- Fordøyelsen av gingivalvev
- Skjær gingivalvevet i små biter, ca. <1 mm i størrelse, med to steriliserte kniver. Gjenta prosessen med å makulere med to kirurgiske kniver.
- Tilsett 1 ml 2,5 mg/ml dispase + kollagensoppløsning til et 1,5 ml sentrifugerør som inneholder gingivalvevstykkene, og inkuber deretter røret i 15-20 min i en inkubator ved 37 °C.
- Når vevet blir gjennomsiktig og flocculent, legg til 1 ml nøytraliseringsløsning for å avslutte fordøyelsen. Bland løsningen grundig ved å pipettere opp og ned 10-15 ganger. Før løsningen gjennom et 100 μm nettingfilter.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspend cellepellet nederst i 10 ml vekstfaktorholdig medium (trinn 2.2). Overfør celleopphenget til en 100 mm cellekulturrett. Tilsett 10 μM Y-27632 i cellekulturretten.
- Kultur cellene ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator. Bytt ut det gamle G-mediet med det ferske G-mediet annenhver dag. Vær oppmerksom på cellene på dag 1 og dag 3.
5. Cell passaging
- Ta parabolen ut av inkubatoren, fjern det brukte mediet og vask to ganger med PBS. Tilsett 2 ml 0,05% trypsin for hver 100 mm tallerken.
MERK: Rist fatet for å forsikre deg om at det er nok kontakt mellom Trypsin-oppløsningen og parabolbunnen. - La retten stå i en inkubator rundt 5 min ved 37 °C for fordøyelsesprosessen.
- Bruk et mikroskop (40x) for å undersøke cellene og sørge for at de fleste celler har skilt seg fra bunnen av parabolen.
- Tilsett 2 ml nøytraliseringsløsning for å stoppe fordøyelsen og overføre cellene til et 15 ml rør. Pipette opp og ned 10-15 ganger. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten langsomt. Resuspend cellene med 10 ml G-medium og telle antall celler.
- Tilsett ca. 1 x 106 celler i 10 ml G-medium og 10 μM Y-27632 til hver 100 mm tallerken.
- Forny G-medium og Y-27632 annenhver dag. Vis cellene på dag 1 og dag 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skjematisk diagram over metoden for direkte utvisning og den modifiserte enzymatiske metoden. Den direkte explant-metoden trenger ikke noe fordøyelsesenzym under hele prosessen. I motsetning trenger den tradisjonelle enzymatiske metoden vanligvis to sett med fordøyelsesenzymer, dispase og kollagenase, for å skille epitelplaten fra det underliggende fibroblastlaget, og deretter trypsin for å frigjøre epitelcellene i suspensjon. Vår nye metode utelater trinnet for separasjon og er en forenklet enzymatisk metode. Videre fremmer tilsetning av Y-27632 til G-mediet effektivt epitelcellevekst. Den direkte explant-metoden tar vanligvis ca 2 uker for gingival epitelceller å vokse tilstrekkelig til passasje og er lett forurenset. Imidlertid er antall gingival epitelceller oppnådd ved den nye metoden betydelig større enn det som oppnås ved den direkte utvisningsmetoden og tar bare i gjennomsnitt 8 dager å oppfylle kravene til passivring.
Figur 1: Sammenligning av den direkte utvisningsmetoden og den nye metoden. (A) Skjema som viser prosessen med den direkte utvisningsmetoden. Gingivalvevsstykkene er plassert i en kulturrett. Epitelcellene dyrkes i G-medium og vokser ut fra vevsstykkene. Den direkte explant-metoden tar vanligvis ca 13 dager for epitelcellene å nå 80% samløp. (B) Oppsett som viser prosessen med den nye enzymatiske metoden. Gingivalvevsfragmentene fordøyes av dispase og kollagenase I, hvorpå cellepellets dyrkes i G-medium med Y-27632. Den nye enzymatiske metoden tar vanligvis ca 6 dager å nå 80% samløp som er egnet for passivring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Voksne gingival epitelceller utarbeidet ved direkte explant-metoden og ved den nye metoden ble observert i et mikroskop på tredje og syvende dag (figur 2A). Det kan ses at den nye metoden økte produksjonen av gingival epitelceller betydelig på tredje og syvende dag. Vekstkurvene til gingival epitelceller oppnådd ved den nye metoden og ved den direkte utvisningsmetoden ble målt ved hjelp av et celletellingssett (CCK-8) på forskjellige tidspunkter (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figur 2B). Doblingstiden for celler utarbeidet ved hjelp av den nye metoden var ca 1-2 dager, men doblingstiden for celler utarbeidet ved hjelp av direkte utvisningsmetode var ca 5-6 dager. Celleutbyttet ved de to metodene ble beregnet på den syvende dagen (figur 2C) og viste at antall celler produsert av den nye metoden (9 x 106) var mer enn tre ganger høyere enn antall celler produsert av den direkte utvisningsmetoden (3 x 106). Figur 2D viser at det tok omtrent halvparten av tiden for den nye metoden (6 dager) å oppnå 80% samløp sammenlignet med den direkte eksummetoden (13 dager).
Figur 2: Den nye enzymatiske metoden øker produksjonen av primære gingival epitelceller. (A) Bilder av gingival epitelceller utarbeidet av den direkte explant-metoden (nederste rad) og den nye enzymatiske metoden (øverste rad) på tredje og syvende dag etter innledende inokulasjon. Skalastenger = 200 μm. (B) Gingival epitelceller dyrket av den direkte metoden og den nye enzymatiske metoden ble samlet inn på dag 1, 2, 3, 4, 5 og 6, og antall gingival epitelceller ble analysert ved hjelp av et CCK-8-sett. (C) Etter 7 dager med kultur ble gingival epitelceller løsnet av trypsin og ble samlet inn. En celletellingsplate ble brukt til å bestemme antall gingival epitelceller tilberedt separat av de to metodene. Antall celler ble beregnet fra de to metodene, som ble gjentatt tre ganger separat, og resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig antall celler per 100 mm tallerken. (D) Gjennomsnittlig tid for å nå 80% sammenløp av primære gingival epitelceller (passasje 0) utarbeidet av den nye enzymatiske metoden og ved direkte explant-metoden sammenlignes. B, C og D: Student t -testble brukt; Feilfeltene viser standardavviket. n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 når du sammenligner den nye enzymatiske metoden med den direkte utvisningsmetoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Immunfluorescensanalyse av gingival epitelceller (ved passering 3) oppnådd ved den nye metoden viste at uttrykket av CK5, CK18 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) var positive (Figur 3A, C,D)11,12,13,14,15, mens uttrykket for CK10 og vimentin var lavt ( Figur3B,E)11,16. CK5 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) ble hovedsakelig lokalisert i basallaget av epitelceller, som er et tegn på deres høye differensieringspotensial11,14,15. CK10 er en markør for differensiert epitel11, og vimentin er en markør for gingival fibroblasts16. Den keratin positive frekvensen av gingival epitelceller isolert av den nye metoden var høyere, spesielt CK5, CK18 og Pan-CK (Figur 3A, C, D), som indikerte at de isolerte gingival epitelialcellene kunne opprettholde en god kjellermembranfunksjon. Det lave uttrykket for differensieringsmarkøren CK10 (figur 3B) indikerte at gingival epitelceller hadde et høyt differensieringspotensial. In vitro-kulturer viste at gingival epitelceller isolert av den nye metoden kunne dyrkes til åttende generasjon, og det lave uttrykket av vimentin indikerte at gingival epitelceller hadde høy renhet, at ingen gingival fibroblaster forurenset dem og at isolasjonseffektiviteten var høy (Figur 3E).
Figur 3: Spesifikke markører av gingival epitelceller (P3) utarbeidet av den nye enzymatiske metoden. (A-E) viser CK5 (rød), CK10 (rød), CK18 (rød), Pan-CK (rød) og vimentin (røde) positive celler, DAPI (blå) ble brukt til å flekke kjerner. (A-C) skalastenger = 100 μm; Skalastolpene (D) og (E) = 50 μm; eksperimentet ble gjentatt fire ganger uavhengig. (A), (C) og (D) viser det positive uttrykket for CK5, CK18 og pan-ck (CK14, 15, 16 og 19) i gingival epitelceller, mens (B) og (E) viser det lave uttrykket for CK10 og vimentin i gingival epitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den nye metoden økte uttrykket av ki67, p63 og p75NGFR (lav affinitet nerve vekstfaktor reseptor p75) i primære gingival epitelceller. Passasje 3 celler ble valgt for Immunofluorescence analyse, som avslørte at det positive uttrykket av ki67, p63 og p75NGFR var høyere enn for gingival epitelceller oppnådd ved direkte explant metode (Figur 4A, C, E). De positive uttrykksratene for henholdsvis ki67, p63 og p75NGFR var henholdsvis 80 %, 98 % og 96 % i den nye metoden, som var betydelig høyere enn for ki67 (35 %), p63 (40 %) og p75NGFR (47 %) oppnådd ved direkte metode (Figur 4B,D,F). Ki67, p63 og p75NGFR er markører av orale epitelstammeceller17. Disse resultatene indikerte at de primære gingival epitelceller isolert og dyrket ved hjelp av den nye metoden inneholdt stamcellepopulasjoner, hadde et høyt spredningspotensial og opprettholdt stamcelleegenskapene til gingival epitelceller.
Figur 4: Stamcellekarakteristikker av gingival epitelceller (P3) oppnådd ved direkte explant-metoden og den nye enzymatiske metoden. (A), (C) og (E) viser representative immunfluorescensbilder av gingival epitelceller ved passering 3 (P3), henholdsvis, som viser ki67 (rød), p63 (rød) og p75NGFR (rød) positive celler oppnådd ved direkte explant-metoden og den nye enzymatiske metoden. DAPI (blå) ble brukt til å flekke kjerner. Skalastolper = 50 μm. (B), (D) og (F) viser kvantitativ analyse av ki67-positive celler, p63-positive celler og p75NGFR-positive celler, henholdsvis i gingival epitelceller (P3) oppnådd ved den direkte utvisningsmetoden og ved den nye enzymatiske metoden. Totalt 400 celler ble telt for å kvantifisere hver gruppe, og gjennomsnittlig antall ki67-, p63- og p75NGFR-positive celler vises. B, D og F: Elevens t-testble brukt; Feilfeltene viser standardavviket. eksperimentet ble gjentatt fire ganger uavhengig (n = 4); **p < 0,01 når du sammenligner den nye enzymatiske metoden med den direkte utvisningsmetoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gingivalvevet er en nøkkelstruktur som opprettholder periodontal integritet og helse. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparasjon og regenerering av periodontalt vev og kan brukes i vitenskapelig forskning og kliniske anvendelser og relaterte felt, inkludert oral biologi, farmakologi, toksikologi og orale slimhinnemangler18. Derfor er det nødvendig å utvikle en stabil og effektiv metode for å høste orale epitelceller19. Primære epitelceller er en slags fullt differensierte celler med få passasjer og kort levetid. Culturing epitelceller har vist seg å være mer komplekse enn kultivering fibroblaster5.
For tiden viser den publiserte litteraturen at det finnes ulike protokoller for isolering og kultur av epitelceller. Imidlertid er to metoder, den direkte explant-metoden og den enzymatiske metoden, de mest brukte blant disse protokollene. I 1910 beskrev Carrel og Burrows først en metode for å oppnå gingival og bukkale epitelceller kalt den direkte explant-metoden20. Den direkte explant-metoden har fordelene med lavvektskrav for vevsprøver, mindre kompliserte prosedyrer, mindre variasjon og mindre involvering i trinnene, men den har ulempene ved å kreve lang kulturtid og er svært utsatt for forurensning5. I 1975 rapporterte Rheinwald og Green først den enzymatiske metoden ved hjelp av bestrålede 3T3 musfibroblaster som et materlag til kultur orale epitelceller in vitro21. Selv om denne metoden forbedret utbyttet av keratinocytter betydelig, hadde det bestrålede musematercellelaget potensielle biologiske risikoer22. Deretter ble kultursystemer uten materceller22 og uten serum23,24 utviklet som viste at 3T3 celler ikke var nødvendige for epitelceller. Selv om den enzymatiske metoden krever mindre kulturtid, er effektiviteten relativt lav og varierer avhengig av enzymer og medium som brukes25. Flere laboratorier sammenlignet de to metodene, og Kedjarune et al.6 observerte at den direkte utvisningsteknikken var mer vellykket enn den enzymatiske metoden og fant en høyere grad av celleproliferasjon. Shwetha et al.26 konkluderte med at den direkte explant-metoden ser ut til å være en enkel og vellykket teknikk for isolering av orale mucosal keratinocytter. Klingbeil et al.7 konkluderte imidlertid akkurat det motsatte, det vil si at den enzymatiske metoden viste de beste resultatene på kortere tid med god levetid. En undersøkelse utført i Storbritannia av Daniels et al.19 gjennomgikk isolasjons- og cellekulturmetodene til menneskelige keratinocytter og rapporterte at 21 av 34 laboratorier som svarte, brukte den enzymatiske metoden med noen variasjoner. Selv om den direkte explant-metoden krever mindre vev og har færre håndteringstrinn enn den enzymatiske metoden, har det blitt antydet at den enzymatiske metoden er raskere og lettere å håndtere6. Derfor var det nødvendig å utvikle en mer praktisk og effektiv metode for isolasjon og kultur av orale epitelceller4. Vår nye metode, en forenklet enzymatisk metode som bruker Y-27632, økte produksjonen av gingival epitelceller betydelig og forkortet tiden som kreves for å skille gingival epitelceller fra gingivalvev.
Figur 2A viser at den nye metoden økte produksjonen av gingival epitelceller betydelig på tredje og syvende dag. Figur 2B viser at doblingstiden for celler utarbeidet ved hjelp av den nye enzymatiske metoden var ca. 1-2 dager, men bruk av den direkte utvisningsmetoden tok ca. 5-6 dager. Antall celler som produseres ved hjelp av den nye enzymatiske metoden (9 x 106), var mer enn tre ganger større enn metoden for direkte utvisning (3 x 106) på den sjuende dagen (figur 2C). Celler utarbeidet ved hjelp av den nye enzymatiske metoden tok 13 dager å bli 80% confluent, som er i samsvar med tidligere studier, mens den direkte explant-metoden tok omtrent 2 uker6, 20,25 ± 1,05 dager18 og 14,2 ± 2,76 dager7 for at cellene skulle bli fullt konfluensielle før subkultur. Imidlertid tok den nye enzymatiske metoden bare 6 dager å bli 80% confluent, som er mye kortere enn den direkte explant-metoden på 13 dager i vårt laboratorium og Klingbeil et al.s7 enzymatiske metode på 11,9 ± 2,36 dager. Vi fant også et interessant fenomen, det vil si at epitelcellekoloniene vokste i en flerlagsstruktur i den direkte utvisningsmetoden, mens en jevn monolayerstruktur ble observert ved hjelp av den nye enzymatiske metoden. Åpenbart forlenger tykkere flerlagskolonier tiden som kreves for å bli 80% -100% confluent. Årsaken til at den nye enzymatiske metoden fremmer celleproliferasjon er tilsetningen av Y-27632, en hemmer av ROCK1 og ROCK2. Y-27632 ble opprinnelig rapportert for sine positive effekter på menneskelig epitelcelleproliferasjon og differensiering i 200827. Chapman et al.28 rapporterte at behandling med Y-27632 økte den proliferative kapasiteten til keratinocytter kraftig og resulterte i effektiv forevigning uten påviselig cellekrise. I våre tidligere studier oppdaget vi at Y-27632 forenkler isolasjonsprosedyren til humane primære epidermale celler og keratinocytter fra voksent hudvev8,9,10. Strudwick et al.29 rapporterte at bruken av 10 μM Y-27632 sammen med lavt kalsium tillot primære menneskelige keratinocytter å bli dyrket uten et cellematerlag i lengre perioder, samtidig som evnen til å skille og danne et stratifisert epitel beholdes. I denne studien økte den nye enzymatiske metoden ved hjelp av Y-27632 i stor grad høstingen av epitelceller ved å forlenge levetiden og fremme deres proliferative kapasitet.
Den tradisjonelle enzymatiske metoden inneholder to fordøyelsesoperasjoner. Den første fordøyelsen er å skille epitelvev fra bindevev ved hjelp av dispase, som fungerer fra den stromale siden4,5. Den andre fordøyelsen bruker vanligvis trypsin for å skille epitelceller fra epitelvev4,5. På grunn av ødeleggelsen av epitelceller av trypsin, påvirkes effektiviteten av den enzymatiske metoden4. Den nye enzymatiske metoden beskrevet her er en forenklet metode som utelater ett fordøyelsestrinn. De viktigste forskjellene mellom de nye og tradisjonelle enzymatiske metodene refererer til protokollene for å skille epitelvev fra bindevev5. I tillegg bruker den nye metoden dispase og collagenase i stedet for trypsin i fordøyelsestrinnet, og dermed er epitelcellenes integritet godt beskyttet. Klinisk er det mye vanskeligere å oppnå samme mengde vev fra menneskelig gingiva enn fra hud og bukkal slimhinne. Den direkte explant-metoden krevde bare små biter av gingivalvev og dyrket et større antall celler sammenlignet med den enzymatiske metoden18. Vi behandlet en liten mengde gingival epitelvev ved hjelp av den nye metoden og høstet en svært tilfredsstillende celletetthet. Dette viser at den nye metoden ikke er avhengig av relativt store mengder vev som først skal leveres. En mulig begrensning ved den nye metoden er at det kan oppstå en liten mengde (<5%) forurensning av fibroblaster ved innledende kultur (passasje 0), men det kan lett fjernes ved en kortsiktig behandling på 0,05% trypsin som rapportert previsouly9.
I denne studien var CK5, CK18 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) positive (Figur 3A, C, D). Dette antydet at de isolerte gingival epitelceller var i stand til å opprettholde sin kjellermembranfunksjon, som er i samsvar med studiene av Orazizadeh et al.30 og Kedjarune et al.6. CK5 og CK14 uttrykkes av uavklarte celler lokalisert i epitel-basallaget. CK19 finnes vanligvis i enkelt epitel og i ikke-keratinisert stratifisert epitel31. Immunfluorescence analyse av gingival epitelceller (P3) oppnådd ved hjelp av den nye enzymatiske metoden viste at uttrykksnivåene av ki67, p63 og p75NGFR var høyere enn i celler oppnådd ved hjelp av den direkte explant-metoden (Figur 4). Dette resultatet indikerer at den nye metoden kan opprettholde stamcelleegenskapene til gingival epitelceller og fremmer spredningspotensialet til gingival epitelceller. Vår forrige studie fant at Y-27632 opprettholder huden epidermale stamcellepotensial etter utvidelse8. Wang et al. fant ut at Y-27632 letter spredning, migrasjon og pluripotens av humane periodontale ligament stamceller32.
Oppsummert gir den nye modifiserte enzymatiske metoden en forenklet og effektiv prosedyre for å isolere og dyrke menneskelige primære epitelceller fra voksent gingivalvev. Denne nye metoden er enklere, mindre tidkrevende og forbedrer stamcelleegenskapene, og har dermed åpenbare fordeler sammenlignet med den direkte utvisningsmetoden i mange parametere. Denne avanserte metoden er mer egnet for å produsere et stort antall høypotensiale epitelceller både for laboratorie- og kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) til X.W.; Det viktigste forsknings- og utviklingsprogrammet i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
