Summary
Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Isolierung und Kultur menschlicher Zahnfleischepithelzellen vor, indem wir den Rock-Inhibitor Y-27632 zur traditionellen Methode hinzufügen. Diese Methode ist einfacher, weniger zeitaufwendig, verbessert die Stammzelleigenschaften und produziert eine größere Anzahl von Epithelzellen mit hohem Potenzial sowohl für das Labor als auch für klinische Anwendungen.
Abstract
Das Zahnfleischgewebe ist die erste Struktur, die parodontales Gewebe schützt und bei vielen oralen Funktionen eine bedeutende Rolle spielt. Das Zahnfleischepithel ist eine wichtige Struktur des Zahnfleischgewebes, insbesondere bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe. Die Untersuchung der Funktionen von Zahnfleischepithelzellen hat einen entscheidenden wissenschaftlichen Wert, wie die Reparatur von mundlichen Defekten und die Erkennung der Kompatibilität von Biomaterialien. Da es sich bei menschlichen Zahnfleischepithelzellen um hochdifferenzierte keratinisierte Zellen handelt, ist ihre Lebensdauer kurz und sie sind schwer zu durchlassen. Bisher gibt es nur zwei Möglichkeiten, Zahnfleischepithelzellen zu isolieren und zu kulturieren, eine direkte Explantierungsmethode und eine enzymatische Methode. Die Zeit, die benötigt wird, um Epithelzellen mit der Direktentpflanzungsmethode zu erhalten, ist jedoch länger und die Zellüberlebensrate der enzymatischen Methode ist niedriger. Klinisch ist der Erwerb von Zahnfleischgewebe begrenzt, so dass ein stabiles, effizientes und einfaches In-vitro-Isolations- und Kultursystem erforderlich ist. Wir haben die traditionelle enzymatische Methode verbessert, indem wir Y-27632 hinzugefügt haben, einen Rho-assoziierten Kinase(ROCK)-Inhibitor, der selektiv das Wachstum von Epithelzellen fördern kann. Unsere modifizierte enzymatische Methode vereinfacht die Schritte der traditionellen enzymatischen Methode und erhöht die Effizienz der Kultivierung von Epithelzellen, was erhebliche Vorteile gegenüber der Direktentregungsmethode und der enzymatischen Methode hat.
Introduction
Die menschliche Gingiva, die erste Verteidigungsstruktur, die Parodontalgewebe schützt, ist nicht nur eine physikalische und chemische Barriere1,sondern sezerniert auch verschiedene Klassen von Entzündungsmediatoren, die an Immunantworten beteiligt sind und eine Immunbarriere bilden2,3. Das Zahnfleischepithel spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe. Daher ist die Untersuchung der Abwehr und Immunität des Zahnfleischepithels von großer Bedeutung für das Verständnis des Auftretens, der Diagnose und der Behandlung von Parodontitis. Die Isolierung und Kultur von Zahnfleischepithelzellen aus menschlichem Zahnfleischgewebe ist der erste Schritt, der für die Untersuchung des Zahnfleischepithels erforderlich ist. Ein solches Verfahren erfordert grundlegende Operationen wie die Herstellung von Samenzellen für das Tissue Engineering, In-vitro-Modelle von parodontalen assoziierten Erkrankungen und Materialien zur Reparatur von Parodontaldefekten.
Primäre Zahnfleischepithelzellen zeichnen sich durch eine geringe Teilungsrate in vitro4aus, Forscher suchen seit Jahrzehnten nach einer optimalen Isolations- und Kultivierungsmethode. Bis heute werden zwei verschiedene Techniken, eine Direktexplantenmethode und eine enzymatische Methode, üblicherweise in Laboratorien verwendet, um primäre Zahnfleischepithelzellen in vitrozu erhalten4,5. Die Direktexplant-Methode hat Vorteile wie die Anforderung einer geringeren Menge an Gewebeproben und ein einfaches Isolationsverfahren, hat jedoch die Nachteile einer längeren Kulturzeit und Kontaminationsanfälligkeit5. Obwohl die enzymatische Methode die benötigte Kulturzeit verkürzt, ist die Effizienz relativ gering und variiert je nach verwendeten Enzymen und Medium. Kedjarune et al.6 zeigten, dass die Direktentpflanzungsmethode, die mehr Zeit vor der Subkultur (2 Wochen) benötigt, für die Kultivierung von Zahnfleischepithelzellen erfolgreicher zu sein schien als die enzymatische Methode. Beim Vergleich dieser beiden Methoden fanden Klingbeil et al.7 jedoch heraus, dass die enzymatische Methode die besten Ergebnisse für Primärkulturen oraler Epithelzellen erzielte und es möglich war, die optimale Zellausbeute innerhalb kürzester Zeit zu erzielen (11,9 Tage gegenüber 14,2 Tagen).
Daher war es wichtig, eine bequemere und effektivere Methode zur Isolierung und Kultur oraler Epithelzellen zu entwickeln4. Wir haben bereits berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), das Isolationsverfahren von menschlichen primären epidermalen Zellen und Keratinozyten aus adultem Hautgewebe vereinfacht8,9,10. Wir entwickelten G-Medium, ein neues konditioniertes Impfmedium, das spontan epidermale von dermalen Zellen trennt und das Wachstum und dieAusbeuteprimärer epidermaler Zellen unterstützt 8,9,10. In der vorliegenden Studie haben wir eine neue serumfreie Isolations- und Kulturtechnik für Zahnfleischepithelzellen entwickelt, indem wir G-Medium mit Y-27632 kombiniert haben. Im Wesentlichen basiert unsere Methode auf einer Vereinfachung der traditionellen zweistufigen enzymatischen Methode, daher haben wir unsere neue Methode mit der Direktentstechtungsmethode verglichen. Diese modifizierte enzymatische Methode verkürzt signifikant die Zeit, die benötigt wird, um Zahnfleischepithelzellen vom Zahnfleischgewebe zu trennen, und erhöht die Effizienz der Kultivierung von Zahnfleischepithelzellen.
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Protocol
Menschliche Gewebe, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind frisches erwachsenes Zahnfleischgewebe, das aus Extraktionen betroffener Zähne in der Abteilung für Kiefer- und Gesichtschirurgie gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Institution (Protokoll Nr. GR201711, Datum: 27.02.2017).
1. Zubereitungen
- Sammeln Sie frisches erwachsenes Zahnfleischgewebe in 15-ml-Röhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 3% Penicillin / Streptomycin (P / S) und halten Sie das Gewebe bei 4 ° C.
HINWEIS: Behandeln Sie das Gewebe wie unten beschrieben innerhalb von 24 Stunden nach der Exzision.
2. Reagenzien und Kulturmedium vorbereiten
- Bereiten Sie die Waschlösung vor: 3% P / S. Mischen Sie 50 ml PBS mit 1,5 ml Penicillin (100 U / ml) und 1,5 ml Streptomycin (100 mg / L).
- Bereiten Sie 500 ml Wachstumsfaktor-haltiges Medium (G-Medium genannt) vor: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1% P/S, 2% B27-Ergänzung, 20 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 40 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) und 40 μg/ml Fungizon.
- Bereiten Sie Enzymaufschlusslösungen für die neue Methode vor: 125 mg Dispasepulver und 125 mg Kollagenasepulver Typ I in 50 ml DMEM auflösen.
HINWEIS: Filtern Sie alle Enzymlösungen durch ein 0,22 μm Sieb und lagern Sie sie bei 4 °C. - Bereiten Sie 500 ml des Mediums vor, um die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% P / S im DMEM-Medium.
3. Direkte Explant-Methode
- Zahnfleischgewebe Vorbehandlung
- Zahnfleischgewebe mit 5 ml 75% Ethanol für 30 s waschen. Anschließend zweimal mit 5 ml der Waschlösung (Schritt 2.1) für 5 min abspülen.
HINWEIS: Führen Sie alle Waschungen in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 50 mm durch.
- Zahnfleischgewebe mit 5 ml 75% Ethanol für 30 s waschen. Anschließend zweimal mit 5 ml der Waschlösung (Schritt 2.1) für 5 min abspülen.
- Zahnfleischepithelzellkultur
- Schneiden Sie das Zahnfleischgewebe in 1 mm3 Stücke und streuen Sie es in eine 100 mm Zellkulturschale. Verwenden Sie feine spitze Zinnen und Augenscheren für die Schneidoperationen.
- Das G-Medium (Schritt 2.2) in die Kulturschale geben. Anschließend wird die Kulturschale in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop (40x), um das Gewebe alle 24 Stunden zu untersuchen.
- Entfernen Sie die Zahnfleischgewebestücke, wenn sich die Epithelzellen auf einen Durchmesser von 2-5 mm um die Gewebestücke herum vermehrt haben. Wechseln Sie das G-Medium alle 2-4 Tage.
4. Die neue modifizierte enzymatische Methode
- Zahnfleischgewebe Vorbehandlung
- Führen Sie dazu die gleichen Schritte aus, die für die Direktentstechtungsmethode in Schritt 3.1.1 beschrieben sind.
- Verdauung von Zahnfleischgewebe
- Schneiden Sie das Zahnfleischgewebe mit zwei sterilisierten Klingen in winzige Stücke, etwa <1 mm groß. Wiederholen Sie den Vorgang des Schredderns mit zwei chirurgischen Klingen.
- 1 ml 2,5 mg/ml Dispase + Kollagenase-Lösung wird in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit den Zahnfleischgewebestücken gegeben und dann das Röhrchen für 15-20 min in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert.
- Wenn das Gewebe transparent und flockig wird, fügen Sie 1 ml der Neutralisationslösung hinzu, um die Verdauung zu beenden. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 10-15 Mal auf und ab pipettieren. Die Lösung wird durch einen 100 μm Netzfilter leiten.
- Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet am Boden in 10 ml wachstumsfaktorhaltigem Medium (Schritt 2.2). Die Zellsuspension wird in eine 100 mm Zellkulturschale überführen. 10 μM Y-27632 in die Zellkulturschale geben.
- Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator. Ersetzen Sie das alte G-Medium alle 2 Tage durch das frische G-Medium. Beobachten Sie die Zellen an Tag 1 und Tag 3.
5. Zellpassage
- Nehmen Sie die Schüssel aus dem Inkubator, entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie es zweimal mit PBS. Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin für jede 100 mm Schüssel hinzu.
HINWEIS: Schütteln Sie die Schüssel, um sicherzustellen, dass genügend Kontakt zwischen der Trypsinlösung und dem Schalenboden besteht. - Lassen Sie die Schale in einem Inkubator ca. 5 min bei 37 °C für den Verdauungsprozess.
- Verwenden Sie ein Mikroskop (40x), um die Zellen zu untersuchen und sicherzustellen, dass sich die meisten Zellen vom Boden der Schüssel getrennt haben.
- Fügen Sie 2 ml der Neutralisationslösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen und die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen zu überführen. Pipette 10-15 mal auf und ab. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand langsam. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml G-Medium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
- Etwa 1 x 106 Zellen in 10 ml G-Medium und 10 μM Y-27632 in jede 100 mm Schüssel geben.
- Erneuern Sie G-medium und Y-27632 alle 2 Tage. Sehen Sie sich die Zellen an Tag 1 und Tag 5 an.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm der Direktexplantmethode und der modifizierten enzymatischen Methode. Die Direktexplant-Methode benötigt während des gesamten Prozesses kein Verdauungsenzym. Im Gegensatz dazu benötigt die traditionelle enzymatische Methode normalerweise zwei Sätze von Verdauungsenzymen, Dispase und Kollagenase, um das Epithelblatt von der darunter liegenden Fibroblastenschicht zu trennen, und dann Trypsin, um die Epithelzellen in Suspension freizusetzen. Unsere neue Methode verzichtet auf den Schritt der Trennung und ist eine vereinfachte enzymatische Methode. Darüber hinaus fördert die Zugabe von Y-27632 zum G-Medium effektiv das Wachstum von Epithelzellen. Die direkte Explantialmethode dauert in der Regel etwa 2 Wochen, bis die Zahnfleischepithelzellen ausreichend zur Passage gewachsen sind und leicht kontaminiert sind. Die Anzahl der mit der neuen Methode erhaltenen Zahnfleischepithelzellen ist jedoch deutlich größer als die der Direktentpflanzungsmethode und benötigt durchschnittlich nur 8 Tage, um die Anforderungen für das Passieren zu erfüllen.
Abbildung 1: Vergleich der Direktentpflanzungsmethode und der neuen Methode. (A) Schema, das den Prozess der Direktentpflanzungsmethode zeigt. Die Zahnfleischgewebestücke werden in eine Kulturschale gelegt. Die Epithelzellen werden in G-Medium kultiviert und wachsen aus den Gewebestücken heraus. Die Direktexplant-Methode dauert in der Regel etwa 13 Tage, bis die Epithelzellen 80% Zusammenfluss erreichen. (B) Schema, das den Prozess der neuen enzymatischen Methode zeigt. Die Zahnfleischgewebefragmente werden durch Dispase und Kollagenase I verdaut, danach werden die Zellpellets in G-Medium mit Y-27632 kultiviert. Die neue enzymatische Methode benötigt in der Regel etwa 6 Tage, um eine 80% ige Konfluenz zu erreichen, die für das Passieren geeignet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Adulte Zahnfleischepithelzellen, die nach der Direktentsteichtungsmethode und nach der neuen Methode hergestellt wurden, wurden am dritten und siebten Tag in einem Mikroskop beobachtet (Abbildung 2A). Es ist zu sehen, dass die neue Methode die Produktion von Zahnfleischepithelzellen am dritten und siebten Tag signifikant erhöhte. Die Wachstumskurven von Zahnfleischepithelzellen, die mit der neuen Methode und der Direktentpflanzungsmethode erhalten wurden, wurden mit einem Zellzählkit (CCK-8) zu verschiedenen Zeitpunkten (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) gemessen (Abbildung 2B). Die Verdopplungszeit der mit der neuen Methode hergestellten Zellen betrug etwa 1-2 Tage, aber die Verdopplungszeit der zellen, die mit der Direktentpflanzungsmethode hergestellt wurden, betrug etwa 5-6 Tage. Die Zellausbeute der beiden Methoden wurde am siebten Tag berechnet (Abbildung 2C) und zeigte, dass die Anzahl der nach der neuen Methode produzierten Zellen (9 x 106) mehr als dreimal höher war als die Anzahl der Zellen, die durch die Direktexplant-Methode produziert wurden (3 x 106). Abbildung 2D zeigt, dass es etwa die Hälfte der Zeit dauerte, bis die neue Methode (6 Tage) eine Konfluenz von 80% im Vergleich zur Direkt-Explant-Methode (13 Tage) erreicht hatte.
Abbildung 2: Die neue enzymatische Methode erhöht die Produktion von primären Zahnfleischepithelzellen. (A) Bilder von Zahnfleischepithelzellen, die nach der Direktentstehungsmethode (untere Reihe) und der neuen enzymatischen Methode (obere Reihe) am dritten und siebten Tag nach der ersten Impfung hergestellt wurden. Schuppenbalken = 200 μm. (B) Gingivalepithelzellen, die mit der direkten Methode und der neuen enzymatischen Methode kultiviert wurden, wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 gesammelt, und die Anzahl der Zahnfleischepithelzellen wurde mit einem CCK-8-Kit analysiert. (C) Nach 7 Tagen Kultur wurden Zahnfleischepithelzellen durch Trypsin abgelöst und gesammelt. Eine Zellzählplatte wurde verwendet, um die Anzahl der gingivalen Epithelzellen zu bestimmen, die nach den beiden Methoden getrennt hergestellt wurden. Die Anzahl der Zellen wurde aus den beiden Methoden berechnet, die dreimal getrennt wiederholt wurden, und die Ergebnisse werden als durchschnittliche Anzahl von Zellen pro 100-mm-Schüssel ausgedrückt. (D) Die durchschnittliche Zeit bis zum Erreichen eines Zusammenflusses von 80% primärer Zahnfleischepithelzellen (Passage 0), die mit der neuen enzymatischen Methode und der Direktentpflanzungsmethode hergestellt wurden, wird verglichen. B, C und D: Der t-Testdes Schülers wurde verwendet; die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 beim Vergleich der neuen enzymatischen Methode mit der Direktexplantmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die mit der neuen Methode erhaltene Immunfluoreszenzanalyse von Zahnfleischepithelzellen (an Passage 3) zeigte, dass die Expression von CK5, CK18 und Pan-CK (CK14, CK15, CK16 und CK19) positiv war (Abbildung 3A, C, D)11,12,13,14,15, während die Expression von CK10 und Vimentin niedrig war ( Abbildung3B,E)11,16. CK5 und Pan-CK (CK14, CK15, CK16 und CK19) waren hauptsächlich in der Basalschicht von Epithelzellen lokalisiert, was ein Zeichen für ihr hohes Differenzierungspotentialist 11,14,15. CK10 ist ein Marker des differenzierten Epithels11und Vimentin ist ein Marker der gingivalen Fibroblasten16. Die Keratin-positive Rate der mit der neuen Methode isolierten Zahnfleischepithelzellen war höher, insbesondere CK5, CK18 und Pan-CK (Abbildung 3A, C, D), was darauf hindeutete, dass die isolierten Zahnfleischepithelzellen eine gute Basalmembranfunktion aufrechterhalten konnten. Die geringe Expression des Differenzierungsmarkers CK10 (Abbildung 3B) deutete darauf hin, dass die Zahnfleischepithelzellen ein hohes Differenzierungspotential aufwiesen. In-vitro-Kulturen zeigten, dass die mit der neuen Methode isolierten Zahnfleischepithelzellen bis zur achten Generation kultiviert werden konnten, und die geringe Expression von Vimentin deutete darauf hin, dass die Zahnfleischepithelzellen eine hohe Reinheit aufwiesen, dass keine gingivalen Fibroblasten sie kontaminierten und dass die Isolationseffizienz hoch war (Abbildung 3E).
Abbildung 3: Spezifische Marker von Zahnfleischepithelzellen (P3), hergestellt durch die neue enzymatische Methode. (A-E) zeigen CK5 (rot), CK10 (rot), CK18 (rot), Pan-CK (rot) und Vimentin (rot) positive Zellen, DAPI (blau) wurde verwendet, um Kerne zu färben. (A-C) Skalenbalken = 100 μm; (D) und (E) Skalenbalken = 50 μm; das Experiment wurde viermal unabhängig voneinander wiederholt. (A), (C) und (D) zeigen die positive Expression von CK5, CK18 und Pan-ck (CK14, 15, 16 und 19) in Zahnfleischepithelzellen, während (B) und (E) die geringe Expression von CK10 und Vimentin in Zahnfleischepithelzellen zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die neue Methode erhöhte die Expression von ki67, p63 und p75NGFR (Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor p75) in primären Zahnfleischepithelzellen. Passage-3-Zellen wurden für die Immunfluoreszenzanalyse ausgewählt, die ergab, dass die positive Expression von ki67, p63 und p75NGFR höher war als die von Zahnfleischepithelzellen, die mit der Direkten Explantierungsmethode erhalten wurden (Abbildung 4A,C, E). Die positiven Expressionsraten von ki67, p63 und p75NGFR betrugen 80%, 98% bzw. 96% in der neuen Methode, die signifikant höher waren als die von ki67 (35%), p63 (40%) und p75NGFR (47%), die nach der direkten Methode erhalten wurden (Abbildung 4B,D, F). Ki67, p63 und p75NGFR sind Marker für orale epitheliale Stammzellen17. Diese Ergebnisse zeigten, dass die primären Zahnfleischepithelzellen, die mit der neuen Methode isoliert und kultiviert wurden, Stammzellpopulationen enthielten, ein hohes Proliferationspotenzial aufwiesen und die Stammzelleigenschaften von Zahnfleischepithelzellen beibehielten.
Abbildung 4: Stammzelleigenschaften von Gingivalepithelzellen (P3), die durch die Direktexplantmethode und die neue enzymatische Methode erhalten wurden. (A), (C) und (E) zeigen repräsentative Immunfluoreszenzbilder von gingivalen Epithelzellen an Passage 3 (P3), die ki67 (rot), p63 (rot) und p75NGFR (rot) positive Zellen zeigen, die durch die Direktexplantmethode und die neue enzymatische Methode erhalten wurden. DAPI (blau) wurde verwendet, um Kerne zu färben. Skalenbalken = 50 μm. (B), (D) und (F) zeigen eine quantitative Analyse von ki67-positiven Zellen, p63-positiven Zellen bzw. p75NGFR-positiven Zellen in Zahnfleischepithelzellen (P3), die durch die Direktexplantmethode und durch die neue enzymatische Methode erhalten wurden. Insgesamt wurden 400 Zellen gezählt, um jede Gruppe zu quantifizieren, und die durchschnittliche Anzahl der ki67-, p63- und p75NGFR-positiven Zellen wird gezeigt. B, D und F: Der t-Testdes Schülers wurde verwendet; die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an; das Experiment wurde viermal unabhängig voneinander wiederholt (n = 4); **p < 0,01, wenn man die neue enzymatische Methode mit der Direktentpflanzungsmethode vergleicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Zahnfleischgewebe ist eine Schlüsselstruktur, die die parodontale Integrität und Gesundheit aufrechterhält. Zahnfleischepithelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe und können in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Anwendungen und verwandten Bereichen, einschließlich oraler Biologie, Pharmakologie, Toxikologie und Mundschleimhautmängeln, eingesetzt werden18. Daher ist es notwendig, eine stabile und effiziente Methode zur Ernte oraler Epithelzellen zu entwickeln19. Primäre Epithelzellen sind eine Art volldifferenzierte Zellen mit wenigen Passagen und einer kurzen Lebensdauer. Die Kultivierung von Epithelzellen hat sich als komplexer erwiesen als die Kultivierung von Fibroblasten5.
Derzeit zeigt die veröffentlichte Literatur, dass verschiedene Protokolle für die Isolierung und Kultur von Epithelzellen existieren. Zwei Methoden, die Direktentsteinpflanzungsmethode und die enzymatische Methode, sind jedoch die am häufigsten verwendeten unter diesen Protokollen. Im Jahr 1910 beschrieben Carrel und Burrows erstmals eine Methode zur Gewinnung von zahnfleischivalen und bukkalen Epithelzellen, die als direkte Explant-Methode bezeichnet wurde20. Die Direktexplant-Methode hat die Vorteile von geringen Gewichtsanforderungen für Gewebeproben, weniger komplizierten Verfahren, weniger Variation und weniger Beteiligung an den Schritten, hat aber die Nachteile, dass eine lange Kulturzeit erforderlich ist und ist sehr anfällig für Kontamination5. 1975 berichteten Rheinwald und Green erstmals über die enzymatische Methode mit bestrahlten 3T3-Mausfibroblasten als Feederschicht zur Kultur oraler Epithelzellen in vitro21. Obwohl diese Methode die Ausbeute an Keratinozyten erheblich verbesserte, hatte die bestrahlte Maus-Feederzellschicht potenzielle biologische Risiken22. Danach wurden Kultursysteme ohne Feeder-Zellen22 und ohne Serum23,24 entwickelt, die bewiesen, dass 3T3-Zellen für Epithelzellkulturen nicht notwendig waren. Obwohl die enzymatische Methode weniger Kulturzeit benötigt, ist die Effizienz relativ gering und variiert je nach verwendeten Enzymen und Medium25. Mehrere Labore verglichen die beiden Methoden und Kedjarune et al.6 beobachteten, dass die direkte Explantierungstechnik erfolgreicher war als die enzymatische Methode und fanden eine höhere Zellproliferationsrate. Shwetha et al.26 kamen zu dem Schluss, dass die Direktentpflanzungsmethode eine einfache und erfolgreiche Technik zur Isolierung von mundschleimhautkeratinozyten zu sein scheint. Klingbeil et al.7 kamen jedoch genau zu dem Gegenteil, d.h. die enzymatische Methode zeigte die besten Ergebnisse in kürzerer Zeit mit einer guten Lebensdauer. Eine in Großbritannien von Daniels et al.19 durchgeführte Umfrage untersuchte die Isolations- und Zellkulturmethoden menschlicher Keratinozyten und berichtete, dass 21 von 34 Labors, die geantwortet haben, die enzymatische Methode mit einigen Variationen verwendeten. Obwohl die Direktexplant-Methode weniger Gewebe benötigt und weniger Handhabungsschritte als die enzymatische Methode aufwies, wurde vorgeschlagen, dass die enzymatische Methode schneller und einfacher zu handhaben ist6. Daher war es notwendig, eine bequemere und effektivere Methode zur Isolierung und Kultur oraler Epithelzellen zu entwickeln4. Unsere neue Methode, eine vereinfachte enzymatische Methode, die Y-27632 verwendet, erhöhte signifikant die Produktion von Zahnfleischepithelzellen und verkürzte die Zeit, die benötigt wird, um Zahnfleischepithelzellen vom Zahnfleischgewebe zu trennen.
Abbildung 2A zeigt, dass die neue Methode die Produktion von Zahnfleischepithelzellen am dritten und siebten Tag signifikant erhöhte. Abbildung 2B zeigt, dass die Verdopplungszeit der zellen, die mit der neuen enzymatischen Methode hergestellt wurden, etwa 1-2 Tage betrug, aber mit der Direktentpflanzungsmethode etwa 5-6 Tage dauerte. Die Anzahl der mit der neuen enzymatischen Methode (9 x 106)hergestellten Zellen war am siebten Tag mehr als dreimal größer als die Direktentpflanzungsmethode (3 x10 6) (Abbildung 2C). Zellen, die mit der neuen enzymatischen Methode hergestellt wurden, brauchten 13 Tage, um zu 80% konfluent zu werden, was mit früheren Studien übereinstimmt, während die direkten Explant-Methode etwa 2 Wochen dauerte6,20,25 ±1,05 Tage 18 und 14,2 ± 2,76 Tage7, bis die Zellen vor der Subkultur vollständig zusammenfließten. Die neue enzymatische Methode brauchte jedoch nur 6 Tage, um zu 80% konfluent zu werden, was viel kürzer ist als die direkte Explantierungsmethode von 13 Tagen in unserem Labor und die7 enzymatische Methode von Klingbeil et al. von 11,9 ± 2,36 Tagen. Wir fanden auch ein interessantes Phänomen, das heißt, die Epithelzellkolonien wuchsen in einer mehrschichtigen Struktur in der Direkt-Explant-Methode, während mit der neuen enzymatischen Methode eine einheitliche Monoschichtstruktur beobachtet wurde. Offensichtlich verlängern dickere mehrschichtige Kolonien die Zeit, die benötigt wird, um 80% -100% konfluent zu werden. Der Grund, warum die neue enzymatische Methode die Zellproliferation fördert, ist die Zugabe von Y-27632, einem Inhibitor von ROCK1 und ROCK2. Y-27632 wurde ursprünglich für seine positiven Auswirkungen auf die Proliferation und Differenzierung menschlicher Epithelzellen im Jahr 2008 berichtet27. Chapman et al.28 berichteten, dass die Behandlung mit Y-27632 die proliferative Kapazität von Keratinozyten stark erhöhte und zu einer effizienten Immortalisierung ohne nachweisbare Zellkrise führte. In unseren früheren Studien haben wir entdeckt, dass Y-27632 das Isolationsverfahren von menschlichen primären epidermalen Zellen und Keratinozyten aus adultem Hautgewebe vereinfacht8,9,10. Strudwick et al.29 berichteten, dass die Verwendung von 10 μM Y-27632 zusammen mit niedrigem Kalzium es ermöglichte, primäre menschliche Keratinozyten für längere Zeit ohne Zellfütterungsschicht zu kultiviert zu haben, während die Fähigkeit zur Differenzierung und Bildung eines geschichteten Epithels erhalten blieb. In dieser Studie erhöhte die neue enzymatische Methode mit Y-27632 die Ernte von Epithelzellen erheblich, indem sie ihre Lebensdauer verlängerte und ihre proliferative Kapazität förderte.
Die traditionelle enzymatische Methode umfasst zwei Aufschlussoperationen. Die erste Verdauung besteht darin, Epithelgewebe vom Bindegewebe mit Hilfe von Dispase zu trennen, die von der Stromaseite4,5arbeitet. Die zweite Verdauung verwendet normalerweise Trypsin, um Epithelzellen vom Epithelgewebe zu trennen4,5. Aufgrund der Zerstörung von Epithelzellen durch Trypsin wird die Effizienz der enzymatischen Methode beeinträchtigt4. Die hier beschriebene neue enzymatische Methode ist eine vereinfachte Methode, die auf einen Verdauungsschritt verzichtet. Die Hauptunterschiede zwischen den neuen und traditionellen enzymatischen Methoden beziehen sich auf die Protokolle der Trennung von Epithelgewebe von Bindegewebe5. Darüber hinaus verwendet die neue Methode Dispase und Kollagenase anstelle von Trypsin im Verdauungsschritt, wodurch die Integrität der Epithelzellen gut geschützt ist. Klinisch ist es viel schwieriger, die gleiche Menge an Gewebe aus der menschlichen Gingiva zu gewinnen als aus der Haut und der Wangenschleimhaut. Die Direktexplant-Methode erforderte nur kleine Stücke Zahnfleischgewebe und kultivierte im Vergleich zur enzymatischen Methode eine größere Anzahl von Zellen18. Wir haben eine kleine Menge Zahnfleischepithelgewebe mit der neuen Methode behandelt und eine sehr zufriedenstellende Zelldichte gewonnen. Dies zeigt, dass die neue Methode nicht auf relativ große Mengen an zunächst zu stellendem Gewebe angewiesen ist. Eine mögliche Einschränkung der neuen Methode besteht darin, dass in der Anfangskultur (Passage 0) eine geringe Menge (<5%) Kontamination von Fibroblasten auftreten könnte, die jedoch leicht durch eine kurzfristige Behandlung von 0,05% Trypsin entfernt werden kann, wie vor der9berichtet.
In dieser Studie waren CK5, CK18 und Pan-CK (CK14, CK15, CK16 und CK19) positiv (Abbildung 3A, C, D). Dies deutete darauf hin, dass die isolierten Zahnfleischepithelzellen in der Lage waren, ihre Basalmembranfunktion aufrechtzuerhalten, was mit den Studien von Orazizadeh et al.30 und Kedjarune et al.6übereinstimmt. CK5 und CK14 werden durch undifferenzierte Zellen exprimiert, die in der epithelial-basalen Schicht lokalisiert sind. CK19 wird typischerweise in einfachem Epithel und in nicht keratinisiertem geschichteten Epithelgefunden 31. Die Immunfluoreszenzanalyse von Zahnfleischepithelzellen (P3), die mit der neuen enzymatischen Methode durchgeführt wurde, zeigte, dass die Expressionsniveaus von ki67, p63 und p75NGFR höher waren als in Zellen, die mit der Direktentpflanzungsmethode erhalten wurden (Abbildung 4). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die neue Methode die Stammzelleigenschaften von Zahnfleischepithelzellen erhalten kann und das Proliferationspotenzial von Zahnfleischepithelzellen fördert. Unsere vorherige Studie ergab, dass Y-27632 das epidermale Stammzellpotenzial der Haut nach der Expansionaufrechterhält 8. Wang et al. fanden heraus, dass Y-27632 die Proliferation, Migration und Pluripotenz von menschlichen Parodontalbandstammzellen erleichtert32.
Zusammenfassend bietet die neue modifizierte enzymatische Methode ein vereinfachtes und effektives Verfahren zur Isolierung und Kulturierung menschlicher primärer Epithelzellen aus adultem Zahnfleischgewebe. Diese neue Methode ist einfacher, weniger zeitaufwendig und verbessert ihre Stammzelleigenschaften und hat somit in vielen Parametern offensichtliche Vorteile gegenüber der Direktentpflanzungsmethode. Diese fortschrittliche Methode eignet sich besser für die Herstellung einer großen Anzahl von High-Potential-Epithelzellen sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.
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Disclosures
Alle Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Key Program der Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) und dem Key Research and Development Program der Provinz Shandong (2019GSF108107) an X.W. unterstützt; das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shandong (2018GSF118240) an J.G.; Medizinisches und Gesundheitswissenschaftliches und technologisches Entwicklungsprojekt der Provinz Shandong (2018WS163) an Z.X. und das Medizinische und Gesundheitswissenschaftliche und technologische Entwicklungsprojekt der Provinz Shandong (2019WS045) an J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
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