Summary
Здесь мы представляем модифицированный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток реснь человека путем добавления ингибитора Породы, Y-27632, к традиционному методу. Этот метод проще, менее трудоемкий, усиливает свойства стволовых клеток и производит большее количество высокофомотриальных эпителиальных клеток как для лабораторных, так и для клинических применений.
Abstract
Денцевая ткань является первой структурой, которая защищает ткани пародонта и играет значимую роль во многих функциях полости рта. Эпителий области енной области является важной структурой ткани енной области, особенно в восстановлении и регенерации ткани пародонта. Изучение функций эпителиальных клеток депо имеет решающее научное значение, такое как восстановление дефектов полости рта и выявление совместимости биоматериалов. Поскольку эпителиальные клетки ресничков человека являются высокодифференцированными ороговевших клетками, их продолжительность жизни коротка, и их трудно пройти. До сих пор существует только два способа выделения и культивирования эпителиальных клеток рысений: метод прямого эксплантата и ферментативный метод. Однако время, необходимое для получения эпителиальных клеток методом прямого эксплантата, больше, а выживаемость клеток ферментативным методом ниже. Клинически приобретение десочной ткани ограничено, поэтому необходима стабильная, эффективная и простая система изоляции и культивирования in vitro. Мы улучшили традиционный ферментативный метод, добавив Y-27632, ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCK), который может избирательно способствовать росту эпителиальных клеток. Наш модифицированный ферментативный метод упрощает этапы традиционного ферментативного метода и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток, что имеет значительные преимущества перед методом прямого эксплантата и ферментативным методом.
Introduction
Десна человека, первая линия защитной структуры, защищающей ткани пародонта, является не только физико-химическим барьером1,но и выделяет различные классы медиаторов воспалительного действия, которые участвуют в иммунных реакциях и составляют иммунный барьер2,3. Эпителий области ден играет важную роль в восстановлении и регенерации тканей пародонта. Поэтому изучение защиты и иммунитета эпителия депо имеет большое значение для понимания возникновения, диагностики и лечения пародонтита. Выделение и культивирование эпителиальных клеток области решетки человека является первым шагом, необходимым для изучения эпителия области решетки. Такая процедура требует основных операций, таких как производство семенных клеток для тканевой инженерии, моделей in vitro заболеваний, связанных с пародонтозом, и материалов для восстановления дефектов пародонта.
Первичные эпителиальные клетки депив характеризуются низкой скоростью деления in vitro4,исследователи десятилетиями искали оптимальный метод изоляции и культивирования. На сегодняшний день два различных метода, метод прямого эксплантата и ферментативный метод, обычно используются в лабораториях для получения первичных клеток эпителия десны in vitro4,5. Метод прямого эксплантирования имеет такие преимущества, как требование меньшего количества образцов тканей и простая процедура выделения, но он имеет недостатки в более длительном времени культивирования и восприимчивости к загрязнению5. Хотя ферментативный метод сокращает требуемое время культивирования, эффективность относительно низкая и варьируется в зависимости от используемых ферментов и среды. Kedjarune et al.6 показали, что метод прямого эксплантата, который требует больше времени до субкультуры (2 недели), оказался более успешным для культивирования эпителиальных клеток десны по сравнению с ферментативным методом. Однако, сравнивая эти два метода, Klingbeil et al.7 обнаружили, что ферментативный метод имел наилучшие результаты для первичных культур эпителиальных клеток полости рта, и можно было получить оптимальный выход клеток в течение кратчайшего периода времени (11,9 дня против 14,2 дня).
Поэтому важно было разработать более удобный и эффективный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток полости рта4. Ранее мы сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), упрощает процедуру выделения первичных клеток эпидермиса человека и кератиноцитов из тканей кожи взрослого человека8,9,10. Мы разработали G-среду, новую кондиционированную среду для прививки, которая спонтанно отделяет эпидермальные клетки от кожных и поддерживает рост и выход первичных эпидермальных клеток8,9,10. В настоящем исследовании мы разработали новую технику выделения и культивирования эпителиальных клеток без сыворотки без сыворотки путем объединения G-среды с Y-27632. По сути, наш метод основан на упрощении традиционного двухэтапного ферментативного метода, поэтому мы сравнили наш новый метод с методом прямого эксплантата. Этот модифицированный ферментативный метод значительно сокращает время, необходимое для отделения эпителиальных клеток деска от дежной ткани и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток деповидной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческие ткани, используемые в этом протоколе, представляют собой свежие взрослые деневые ткани, выброшенные из удаления ретинированных зубов в отделении челюстно-лицевой хирургии в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике исследований человека Учреждения (Протокол No. GR201711, Дата: 02-27-2017).
1. Препараты
- Соберите свежие взрослые ткани ребрышки в пробирки по 15 мл, содержащие 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), дополненного 3% пенициллина / стрептомицина (P / S), и держите ткани при 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте ткани, как описано ниже, в течение 24 ч после иссечения.
2. Подготовка реагентов и питательной среды
- Приготовить моющее раствор: 3% P/S. Смешать 50 мл PBS с 1,5 мл пенициллина (100 Ед/мл) и 1,5 мл стрептомицина (100 мг/л).
- Приготовьте 500 мл среды, содержащей фактор роста (называемой G-средой): среды DMEM/F12 (3:1), содержащей 1% P/S, 2% добавки B27, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 40 нг/мл фактора роста фибробластов 2 (FGF2) и 40 мкг/мл грибка.
- Приготовьте растворы для ферментного сбраживания для нового метода: растворите 125 мг порошка Диспазы и 125 мг порошка коллагеназы типа I в 50 мл ДМЭМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте все растворы ферментов через ситечко 0,22 мкм и храните при 4 °C. - Готовят 500 мл среды для нейтрализации ферментативного пищеварения: 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% P/S в среде DMEM.
3. Метод прямого эксплантата
- Предварительная обработка ткани ресни
- Промывайте ткани ресницы 5 мл 75% этанола в течение 30 с. Затем дважды промыть 5 мл моющих растворов (шаг 2.1) в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все мытья в посуде для клеточных культур диаметром 50 мм.
- Промывайте ткани ресницы 5 мл 75% этанола в течение 30 с. Затем дважды промыть 5 мл моющих растворов (шаг 2.1) в течение 5 мин.
- Культура эпителиальных клеток области гин
- Разрежьте ткани области на 1 мм3 кусочка и рассыпьте их в чашке для культивирования клеток 100 мм. Используйте мелкоконечные щипцы и офтальмологические ножницы для операций резки.
- Добавьте G-среду (шаг 2.2) в блюдо для культивовки. Затем инкубируют культурную чашку в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. Используйте инвертированный микроскоп (40x) для изучения тканей каждые 24 ч.
- Удалите кусочки ткани области, когда эпителиальные клетки распространились до 2-5 мм в диаметре вокруг кусочков ткани. Меняйте G-среднюю каждые 2-4 дня.
4. Новый модифицированный ферментативный метод
- Предварительная обработка ткани ресни
- Для этого выполните те же действия, что и для метода прямого эксплантата, шаг 3.1.1.
- Переваривание ткани гневы
- Разрежьте денцевую ткань на крошечные кусочки, размером примерно <1 мм, двумя стерилизованными лезвиями. Повторите процесс измельчения двумя хирургическими лезвиями.
- Добавьте 1 мл 2,5 мг/мл диспазы + раствор коллагеназы в центрифужную трубку 1,5 мл, содержащую кусочки деповой ткани, а затем инкубируют трубку в течение 15-20 мин в инкубаторе при 37 °C.
- Когда ткань станет прозрачной и флокулентной, добавляют 1 мл нейтрализующих растворов для прекращения пищеварения. Тщательно перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз 10-15 раз. Пропустите раствор через сетчатый фильтр 100 мкм.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу на дне в 10 мл среды, содержащей фактор роста (этап 2.2). Переложите клеточную суспензию в чашку для культивовки клеток 100 мм. Добавьте 10 мкМ Y-27632 в чашку для культивируемости клеток.
- Культивьять клетки при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Заменяйте старую G-среднюю на свежую G-среднюю каждые 2 дня. Наблюдайте за клетками в День 1 и День 3.
5. Пасуя клеток
- Выньте посуду из инкубатора, удалите отработанный носитель и дважды вымойте PBS. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина на каждое блюдо по 100 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните блюдо, чтобы убедиться, что между раствором трипсина и дном блюда достаточно контакта. - Оставьте блюдо в инкубаторе примерно через 5 минут при 37 °C для процесса пищеварения.
- Используйте микроскоп (40x), чтобы исследовать клетки и убедиться, что большинство клеток отделились от нижней части чашки.
- Добавьте 2 мл нейтрализующих растворов, чтобы остановить пищеварение и перенести клетки в пробирку объемом 15 мл. Пипетка вверх и вниз 10-15 раз. Центрифугировать ячейки при 200 х г в течение 5 мин.
- Медленно удаляйте супернатант. Повторно суспендируете клетки с 10 мл G-среды и подсчитайте количество клеток.
- Добавьте около 1 х 106 ячеек в 10 мл G-среды и 10 мкМ Y-27632 к каждой тарелке 100 мм.
- Обновляйте G-medium и Y-27632 каждые 2 дня. Просмотр ячеек на 1-й и 5-й день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана принципиальная схема метода прямого экспланта и модифицированного ферментативного метода. Метод прямого эксплантата не нуждается в пищеварительном ферменте в течение всего процесса. Напротив, традиционный ферментативный метод обычно требует двух наборов пищеварительных ферментов, диспазы и коллагеназы, чтобы отделить эпителиальный лист от нижележащих слоев фибробластов, а затем трипсин для высвобождения эпителиальных клеток в суспензию. Наш новый метод опускает этап разделения и является упрощенным ферментативным методом. Кроме того, добавление Y-27632 в G-среду эффективно способствует росту эпителиальных клеток. Метод прямого эксплантирования обычно занимает около 2 недель, чтобы эпителиальные клетки рыселей росли в достаточной степени для прохождения и легко загрязняются. Однако количество эпителиальных клеток рысья, полученных новым методом, значительно больше, чем полученное методом прямого эксплантата, и для удовлетворения требований к пассажа требуется в среднем всего 8 дней.
Рисунок 1:Сравнение метода прямого экспланта и нового метода. (A) Схема, показывающая процесс метода прямого экспланта. Кусочки ткани области области помещают в культуральную посуду. Эпителиальные клетки культивируются в G-среде и вырастают из кусочков ткани. Метод прямого эксплантата обычно занимает около 13 дней, чтобы эпителиальные клетки достигли 80% слияния. (B) Схема, показывающая процесс нового ферментативного метода. Фрагменты десневной ткани перевариваются диспазой и коллагеназой I, после чего клеточные гранулы культивируют в G-среде с Y-27632. Новый ферментативный метод обычно занимает около 6 дней, чтобы достичь 80% слияния, которое подходит для пассирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Взрослые эпителиальные клетки ден, полученные методом прямого эксплантата и новым методом, наблюдались в микроскопе на третий и седьмой дни(рисунок 2А). Видно, что новый метод значительно увеличил выработку эпителиальных клеток ески на третий и седьмой дни. Кривые роста эпителиальных клеток ребрышки, полученные новым методом и методом прямого эксплантата, измеряли с помощью набора подсчета клеток (CCK-8) в разных временных точках (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(рисунок 2B). Время удвоения клеток, приготовленных с использованием нового метода, составляло около 1-2 дней, но время удвоения клеток, приготовленных методом прямого эксплантата, составляло около 5-6 дней. Выходы клеток двумя методами рассчитывали на седьмой день(фиг.2С)и показывали, что количество клеток, полученных новым методом (9 х 106),было более чем в три раза выше, чем количество клеток, полученных методом прямого экспланта (3 х 106). Рисунок 2D показывает, что для достижения 80% слияния новому методу потребовалось около половины времени (6 дней) по сравнению с методом прямого эксплантата (13 дней).
Рисунок 2:Новый ферментативный метод увеличивает выработку первичных эпителиальных клеток гнек. (A) Изображения эпителиальных клеток десны, полученные методом прямого эксплантата (нижний ряд) и новым ферментативным методом (верхний ряд) на третий и седьмой день после первоначальной инокуляции. Шкала стержней = 200 мкм.(B)Эпителиальные клетки, культивируемые прямым методом и новым ферментативным методом, собирали на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 днях, а количество эпителиальных клеток дева анализировали с использованием набора CCK-8. После7 дней культивирования эпителиальные клетки решеток были отделены трипсином и собраны. Для определения количества эпителиальных клеток, полученных отдельно двумя методами, использовалась пластина для подсчета клеток. Количество ячеек вычисляли по двум методам, которые повторяли три раза по отдельности, а результаты выражали как среднее количество ячеек на 100 мм тарелку. (D)Сравнивается среднее время достижения 80% слияния первичных эпителиальных клеток деливы (пассаж 0), полученных новым ферментативным методом и методом прямого эксплантата. B, C и D: использовался тест Tстудента; в полосах ошибок отображается стандартное отклонение; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 при сравнении нового ферментативного метода с методом прямого эксплантата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Иммунофлуоресцентный анализ эпителиальных клеток ребрышки (при прохождении 3), полученный новым методом, показал, что экспрессия CK5, CK18 и Pan-CK (CK14, CK15, CK16 и CK19) была положительной(Фиг.3A,C,D)11,12,13,14,15,в то время как экспрессия CK10 и виментина была низкой(Фиг.3B,E)11,16. CK5 и Pan-CK (CK14, CK15, CK16 и CK19) были в основном локализованы в базальном слое эпителиальных клеток, что является признаком их высокого дифференцировального потенциала11,14,15. CK10 является маркером дифференцированного эпителия11,а виментин является маркером ребрышных фибробластов16. Кератин-положительный показатель эпителиальных клеток рогов, выделенных новым методом, был выше, особенно CK5, CK18 и Pan-CK(Рисунок 3A,C, D),что указывало на то, что изолированные эпителиальные клетки ресни могут поддерживать хорошую функцию базальной мембраны. Низкая экспрессия маркера дифференцировки CK10(рисунок 3B)указывала на то, что эпителиальные клетки ребенка имели высокий потенциал дифференцировки. Культуры in vitro показали, что эпителиальные клетки десны, выделенные новым методом, могут быть культивированы до восьмого поколения, а низкая экспрессия виментина указывает на то, что эпителиальные клетки десны имеют высокую чистоту, что никакие десневые фибробласты не загрязняют их и что эффективность выделения была высокой(рисунок 3E).
Рисунок 3:Специфические маркеры эпителиальных клеток десны (Р3), полученные новым ферментативным методом. (A-E) показывают CK5 (красный), CK10 (красный), CK18 (красный), Pan-CK (красный) и виментин (красный) положительные клетки, DAPI (синий) использовался для окрашивания ядер. (A-C) шкала стержней = 100 мкм; (D)и(E)шкала стержней = 50 мкм; эксперимент повторялся четыре раза независимо. (A),(C) и (D) показывают положительную экспрессию CK5, CK18 и pan-ck (CK14, 15, 16 и 19) в эпителиальных клетках дева, в то время как(B)и(E)показывают низкую экспрессию CK10 и виментина в эпителиальных клетках дева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Новый метод увеличил экспрессию ki67, p63 и p75NGFR (рецептор фактора роста нервов с низким сродством p75) в первичных эпителиальных клетках рогов. Клетки Пассажа 3 были отобраны для иммунофлуоресцентного анализа, который показал, что положительная экспрессия ki67, p63 и p75NGFR была выше, чем у эпителиальных клеток ресниц, полученных методом прямого эксплантата(Рисунок 4A,C,E). Положительные показатели экспрессии ki67, p63 и p75NGFR составили 80%, 98% и 96% в новом методе соответственно, которые были значительно выше, чем у ki67 (35%), p63 (40%) и p75NGFR (47%), полученных прямым методом(рисунок 4B,D, F). Ki67, p63 и p75NGFR являются маркерами оральных эпителиальных стволовых клеток17. Эти результаты показали, что первичные эпителиальные клетки области, выделенные и культивируемые с использованием нового метода, содержали популяции стволовых клеток, обладали высоким потенциалом пролиферации и поддерживали свойства стволовых клеток эпителиальных клеток области.
Фиг.4:Характеристики стволовых клеток эпителиальных клеток ресниц (Р3), полученные методом прямого эксплантата и новым ферментативным методом. (А),(С)и(Е)показывают репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения эпителиальных клеток ресниц при пассаже 3 (Р3), соответственно, показывая ki67 (красный), p63 (красный) и p75NGFR (красный) положительные клетки, полученные методом прямого экспланта и новым ферментативным методом. DAPI (синий) использовался для окрашивания ядер. Шкала баров = 50 мкм. (B), (D) и (F) показывают количественный анализ ki67-положительных клеток, p63-положительных клеток и p75NGFR-положительных клеток, соответственно, в эпителиальных клетках рогов (P3), полученных методом прямого экспланта и новым ферментативным методом. В общей сложности было подсчитаны 400 клеток для количественной оценки каждой группы, и показано среднее количество положительных клеток ki67, p63 и p75NGFR. B, D и F: использовался t-тестстудента; в полосах ошибок отображается стандартное отклонение; эксперимент повторяли четыре раза независимо (n = 4); **p < 0,01 при сравнении нового ферментативного метода с методом прямого эксплантата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Денцевая ткань является ключевой структурой, которая поддерживает целостность пародонта и здоровье. Эпителиальные клетки десна играют значительную роль в восстановлении и регенерации ткани пародонта и могут быть использованы в научных исследованиях и клинических применениях и смежных областях, включая биологию полости рта, фармакологию, токсикологию и дефицит слизистой оболочки полости рта18. Поэтому необходимо разработать стабильный и эффективный метод сбора эпителиальных клеток полости рта19. Первичные эпителиальные клетки представляют собой разновидность полностью дифференцированных клеток с небольшим количеством проходов и короткой продолжительностью жизни. Культивирование эпителиальных клеток оказалось более сложным, чем культивирование фибробластов5.
В настоящее время опубликованная литература показывает, что существуют различные протоколы для выделения и культивной эпителиальных клеток. Однако два метода, метод прямого экспланта и ферментативный метод, являются наиболее часто используемыми среди этих протоколов. В 1910 году Каррель и Барроуз впервые описали способ получения эпителиальных клеток области рысен и щечек, названный методом прямого эксплантата20. Метод прямого эксплантирования имеет преимущества низкой массы для образцов тканей, менее сложные процедуры, меньшую вариацию и меньшее участие в этапах, но он имеет недостатки, требующие длительного времени культивирования и очень восприимчивый к загрязнению5. В 1975 году Райнвальд и Грин впервые сообщили о ферментативном методе с использованием облученных фибробластов мыши 3T3 в качестве фидерного слоя для культивирования эпителиальных клеток полости рта in vitro21. Хотя этот метод значительно улучшил выход кератиноцитов, облученный слой клеток мышиной кормушки имел потенциальные биологические риски22. После этого были разработаны культуральные системы без фидерных клеток22 и без сыворотки23,24, которые доказали, что клетки 3T3 не нужны для эпителиальных клеточных культур. Хотя ферментативный метод требует меньше времени культивирования, эффективность относительно низкая и варьируется в зависимости от ферментов и используемой среды25. Несколько лабораторий сравнили два метода, и Kedjarune et al.6 отметили, что метод прямого эксплантата был более успешным, чем ферментативный метод, и обнаружили более высокую скорость пролиферации клеток. Shwetha et al.26 пришли к выводу, что метод прямого эксплантата представляется простым и успешным методом выделения слизистых кератиноцитов слизистой оболочки полости рта. Однако Klingbeil et al.7 пришли к выводу прямо противоположного, т. е. ферментативный метод показал наилучшие результаты за меньшее время при хорошей продолжительности жизни. Опрос, проведенный в Великобритании Daniels et al.19, рассмотрел методы выделения и культивирования клеток кератиноцитов человека и сообщил, что 21 из 34 лабораторий, которые ответили, использовали ферментативный метод с некоторыми вариациями. Хотя метод прямого экспланта требует меньше ткани и имеет меньше этапов обработки, чем ферментативный метод, было высказано предположение, что ферментативный метод быстрее и проще в управлении6. Поэтому необходимо было разработать более удобный и эффективный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток полости рта4. Наш новый метод, упрощенный ферментативный метод, который использует Y-27632, значительно увеличил производство эпителиальных клеток области и сократил время, необходимое для отделения эпителиальных клеток области от ткани области области.
Рисунок 2А показывает, что новый метод значительно увеличил выработку эпителиальных клеток ески на третий и седьмой день. На рисунке 2B показано, что время удвоения клеток, полученных с использованием нового ферментативного метода, составило около 1-2 дней, но использование метода прямого экспланта заняло около 5-6 дней. Количество клеток, полученных с помощью нового ферментативного метода (9 х 106),было более чем в три раза больше, чем методом прямого экспланта (3 х 106)на седьмой день(рисунок 2С). Клеткам, приготовленным с использованием нового ферментативного метода, потребовалось 13 дней, чтобы стать 80% конфлюентом, что согласуется с предыдущими исследованиями, в то время как метод прямого эксплантата занял около 2 недель6,20,25 ±1,05 дня 18 и 14,2 ± 2,76дня 7, чтобы клетки стали полностью слиться до субкультуры. Тем не менее, новому ферментативной методике потребовалось всего 6 дней, чтобы стать 80% конфлюентом, что намного короче, чем метод прямого экспланта в 13 дней в нашей лаборатории и ферментативный метод Klingbeil et al.7 11,9 ± 2,36 дня. Мы также обнаружили интересное явление, то есть колонии эпителиальных клеток росли в многослойной структуре методом прямого эксплантата, в то время как однородная однослойная структура наблюдалась с помощью нового ферментативного метода. Очевидно, что более толстые многослойные колонии продлевают время, необходимое для того, чтобы стать 80%-100% слиянием. Причиной, по которой новый ферментативный метод способствует пролиферации клеток, является добавление Y-27632, ингибитора ROCK1 и ROCK2. Первоначально сообщалось о Y-27632 за его положительное влияние на пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток человека в 2008году 27. Chapman et al.28 сообщили, что лечение Y-27632 значительно увеличило пролиферативную способность кератиноцитов и привело к эффективному увековечению без обнаруживаемого клеточного криза. В наших предыдущих исследованиях мы обнаружили, что Y-27632 упрощает процедуру выделения первичных клеток эпидермиса человека и кератиноцитов из ткани кожи взрослого человека8,9,10. Strudwick et al.29 сообщили, что использование 10 мкМ Y-27632 вместе с низким содержанием кальция позволило культивировать первичные кератиноциты человека без слоя клеточной кормушки в течение более длительных периодов времени, сохраняя при этом способность дифференцировать и образовывать стратифицированный эпителий. В этом исследовании новый ферментативный метод с использованием Y-27632 значительно увеличил сбор эпителиальных клеток, увеличивая их продолжительность жизни и способствуя их пролиферативной способности.
Традиционный ферментативный метод содержит две операции пищеварения. Первое пищеварение заключается в отделении эпителиальной ткани от соединительной ткани с помощью диспазы, которая работает со стромальной стороны4,5. Второе пищеварение обычно использует трипсин для отделения эпителиальных клеток от эпителиальнойткани 4,5. Из-за разрушения эпителиальных клеток трипсином эффективность ферментативного метода затрагивается4. Новый ферментативный метод, описанный здесь, представляет собой упрощенный метод, который опускает один этап пищеварения. Основные различия между новыми и традиционными ферментативными методами относятся к протоколам отделения эпителиальной ткани от соединительнойткани 5. Кроме того, новый метод использует диспазу и коллагеназу вместо трипсина на этапе пищеварения, и, следовательно, целостность эпителиальных клеток хорошо защищена. Клинически гораздо сложнее получить такое же количество ткани из десны человека, чем из кожи и слизистой оболочки щечки. Метод прямого эксплантирования требовал только небольших кусочков ткани рысей и культивировал большее количество клеток по сравнению с ферментативным методом18. Мы обработали небольшое количество эпителиальной ткани денки с помощью нового метода и собрали очень удовлетворительную плотность клеток. Это показывает, что новый метод не зависит от относительно больших количеств ткани, которые должны быть первоначально предоставлены. Одним из возможных ограничений нового метода является то, что может появиться небольшое количество (<5%) загрязнения фибробластов при начальной культуре (проход 0), но оно может быть легко удалено путем краткосрочной обработки 0,05% трипсина, как сообщалосьдовизули 9.
В этом исследовании CK5, CK18 и Pan-CK (CK14, CK15, CK16 и CK19) были положительными(рисунок 3A,C, D). Это говорит о том, что изолированные эпителиальные клетки десна смогли сохранить свою функцию базальной мембраны, что согласуется с исследованиями Orazizadeh et al.30 и Kedjarune et al.6. CK5 и CK14 экспрессируются недифференцированными клетками, локализованными в эпителиально-базальном слое. CK19 обычно обнаруживается в простом эпителии и в неорогованном стратифицированном эпителии31. Иммунофлуоресцентный анализ эпителиальных клеток (Р3), полученный с использованием нового ферментативного метода, показал, что уровни экспрессии ki67, p63 и p75NGFR были выше, чем в клетках, полученных с помощью метода прямого экспланта(Рисунок 4). Этот результат указывает на то, что новый метод может поддерживать свойства стволовых клеток эпителиальных клеток ека и способствует пролиферации эпителиальных клеток области. Наше предыдущее исследование показало, что Y-27632 поддерживает потенциал эпидермальных стволовых клеток кожи после расширения8. Wang et al. обнаружили, что Y-27632 способствует пролиферации, миграции и плюрипотентности стволовых клеток пародонтальной связки человека32.
Таким образом, новый модифицированный ферментативный метод обеспечивает упрощенную и эффективную процедуру выделения и культивирования первичных эпителиальных клеток человека из ткани деска взрослого человека. Этот новый метод является более простым, менее трудоемким и усиливает их свойства стволовых клеток, и, таким образом, имеет очевидные преимущества по сравнению с методом прямого эксплантата по многим параметрам. Этот усовершенствованный метод больше подходит для получения большого количества высокофектриальных эпителиальных клеток как для лабораторных, так и для клинических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Ключевой программой Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ZR2019ZD36) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Шаньдун (2019GSF108107) для X.W.; Ключевая программа исследований и разработок провинции Шаньдун (2018GSF118240) для J.G.; Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2018WS163) для Z.X. и Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2019WS045) для J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
