Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolation og kultur af primære menneskelige gingivale epitelceller ved hjælp af Y-27632

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62978
Automatic Translation
1,2,3, 4, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,5, 1
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Summary

Her præsenterer vi en modificeret metode til isolering og kultur af menneskelige gingivale epitelceller ved at tilføje Rock-hæmmeren, Y-27632, til den traditionelle metode. Denne metode er lettere, mindre tidskrævende, forbedrer stamcelleegenskaberne og producerer et større antal højpotentialede epitelceller både til laboratoriet og til kliniske anvendelser.

Abstract

Den gingival væv er den første struktur, der beskytter paradentose væv og spiller meningsfulde roller i mange mundtlige funktioner. Gingival epitel er en vigtig struktur af gingivalt væv, især i reparation og regenerering af paradentosevæv. Undersøgelse af gingival epitelcellers funktioner har afgørende videnskabelig værdi, såsom reparation af orale defekter og detektering af biomaterialers kompatibilitet. Som menneskelige gingival epitelceller er meget differentierede keratiniserede celler, deres levetid er kort, og de er vanskelige at passere. Indtil videre er der kun to måder at isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Men den tid, der kræves for at opnå epitelceller ved hjælp af den direkte explant metode er længere, og cellen overlevelsesraten for den enzymatiske metode er lavere. Klinisk er erhvervelsen af gingivalt væv begrænset, så der er behov for et stabilt, effektivt og simpelt in vitro-isolations- og kultursystem. Vi forbedrede den traditionelle enzymatiske metode ved at tilføje Y-27632, en Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer, som selektivt kan fremme væksten af epitelceller. Vores modificerede enzymatiske metode forenkler trinene i den traditionelle enzymatiske metode og øger effektiviteten af dyrkning af epitelceller, hvilket har betydelige fordele i forhold til den direkte explant-metode og den enzymatiske metode.

Introduction

Den menneskelige gingiva, den første linje forsvarsstruktur, der beskytter paradentvæv, er ikke kun en fysisk og kemisk barriere1, men udskiller også forskellige klasser af inflammatoriske mæglere, der deltager i immunrespons og udgør en immunbarriere2,3. Den gingival epitel spiller en vigtig rolle i reparation og regenerering af paradentose væv. Derfor er det af stor betydning at studere gingival epitels forsvar og immunitet for at forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen af parodontitis. Isolationen og kulturen af gingivale epitelceller fra human gingivalt væv er det første skridt, der kræves for at studere gingival epitel. En sådan procedure kræver grundlæggende operationer såsom fremstilling af frøceller til vævsteknik, in vitro-modeller af paradentose tilknyttede sygdomme og materialer til reparation af paradentosedefekter.

Primære gingival epitelceller er karakteriseret ved en lav division sats in vitro4, forskere har været på udkig efter en optimal isolation og dyrkning metode i årtier. Til dato er to forskellige teknikker, en direkte explant metode og en enzymatisk metode, almindeligt anvendt i laboratorier til at opnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant metode har fordele såsom kravet om en lavere mængde vævsprøver og simpel isolationsprocedure, men det har ulemperne ved længere kulturtid og modtagelighed for forurening5. Selvom den enzymatiske metode forkorter den nødvendige kulturtid, er effektiviteten relativt lav og varierer afhængigt af de anvendte enzymer og medium. Kedjarune et al.6 viste, at den direkte explant metode, som kræver mere tid før subkultur (2 uger), syntes at være mere vellykket for dyrkning gingival epitelceller i forhold til den enzymatiske metode. Men ved at sammenligne disse to metoder fandt Klingbeil et al.7, at den enzymatiske metode havde de bedste resultater for primære kulturer af orale epitelceller, og det var muligt at opnå det optimale celleudbytte inden for den korteste periode (11,9 dage mod 14,2 dage).

Derfor var det vigtigt at udvikle en mere bekvem og effektiv metode til isolering og kultur af orale epitelceller4. Vi har tidligere rapporteret, at tilføje Y-27632, en hæmmer af Rho-associeret protein kinase (ROCK), forenkler isolationsproceduren for menneskelige primære epidermale celler og keratinocytter fra voksne hudvæv8,9,10. Vi udviklede G-medium, et nyt betinget podningsmedium, der spontant adskiller epidermale fra dermale celler og understøtter væksten og udbyttet af primære epidermale celler8,9,10. I dette studie udviklede vi en ny serumfri isolations- og kulturteknik til gingivale epitelceller ved at kombinere G-medium med Y-27632. I det væsentlige er vores metode baseret på en forenkling af den traditionelle totrins enzymatiske metode, så vi sammenlignede vores nye metode med den direkte explant-metode. Denne modificerede enzymatiske metode forkorter betydeligt den tid, der kræves for at adskille gingivale epitelceller fra gingivalt væv og øger effektiviteten af dyrkning af gingivale epitelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane væv, der anvendes i denne protokol er friske voksne gingival væv kasseres fra ekstraktioner af påvirkede tænder i Maxillofacial Surgery Department i henhold til retningslinjerne for institutionens Human Research Ethics Committee (Protokol Nr. GR201711, Dato: 02-27-2017).

1. Forberedelser

  1. Frisk voksen gingival væv i 15 mL rør, der indeholder 10 mL fosfat-buffered saltvand (PBS) suppleret med 3% penicillin/streptomycin (P/S) og holde væv på 4 °C.
    BEMÆRK: Behandl vævene som beskrevet nedenfor inden for 24 timer efter udskillelse.

2. Forbered reagenser og kulturmedium

  1. Vaskeopløsningen forberedes: 3% P/S. Bland 50 mL PBS med 1,5 mL penicillin (100 U/mL) og 1,5 mL streptomycin (100 mg/L).
  2. Der fremstilles 500 mL vækstfaktorholdigt medium (kaldet G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium, der indeholder 1% P/S, 2% B27-tillæg, 20 ng/mL af epidermal vækstfaktor (EGF), 40 ng/mL fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2) og 40 μg/mL fungizone.
  3. Forbered enzymfordøjelsesløsninger til den nye metode: Opløs 125 mg Dispasepulver og 125 mg type I kollagenasepulver i 50 mL DMEM.
    BEMÆRK: Filtrer alle enzymopløsningerne gennem en 0,22 μm si og opbevares ved 4 °C.
  4. 500 mL af mediet til at neutralisere den enzymatiske fordøjelse: 10% føtalt kvæg serum (FBS) og 1% P /S i DMEM medium.

3. Direkte explant metode

  1. Gingival væv forbehandling
    1. Vask gingivalt væv med 5 mL 75% ethanol til 30 s. Skyl derefter to gange med 5 mL af vaskeopløsningen (trin 2.1) i 5 min.
      BEMÆRK: Udfør alle vaske i cellekultur retter med en diameter på 50 mm.
  2. Gingival epitelcellekultur
    1. Skær gingivalvævet i 1 mm3 stykker og spred dem i en 100 mm cellekulturskål. Brug fine spidse pincet og oftalmologiske saks til skæreoperationerne.
    2. G-medium (trin 2.2) til kulturretten. Inkuber derefter kulturskålen i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C. Brug et omvendt mikroskop (40x) til at undersøge vævene hver 24. time.
    3. Fjern gingival væv stykker, når epitelcellerne har formeret sig til en 2-5 mm i diameter omkring vævsstykkerne. Skift G-medium hver 2-4 dage.

4. Den nye modificerede enzymatiske metode

  1. Gingival væv forbehandling
    1. I dette forbindelse skal du følge de samme trin som beskrevet for den direkte explantmetode, trin 3.1.1.
  2. Fordøjelse af gingivalt væv
    1. Skær gingivalvævet i små stykker, ca. <1 mm i størrelse, med to steriliserede knive. Gentag makuleringsprocessen med to kirurgiske knive.
    2. Der tilsættes 1 mL 2,5 mg/mL dispase + kollagenaseopløsning til et 1,5 mL centrifugerør, der indeholder gingivalvævsstykkerne, og inkuberes derefter røret i 15-20 min. i en inkubator ved 37 °C.
    3. Når vævet bliver gennemsigtigt og flocculent, tilsættes 1 mL af neutraliseringsopløsningen for at afslutte fordøjelsen. Bland opløsningen grundigt ved at pipetter op og ned 10-15 gange. Før opløsningen gennem et 100 μm mesh filter.
    4. Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
    5. Supernatanten fjernes, og cellepillen fjernes i bunden i 10 mL vækstfaktorholdigt medium (trin 2.2). Overfør celleaffjedringen til en 100 mm cellekulturskål. Der tilsættes 10 μM Y-27632 til cellekulturskålen.
    6. Kulin cellerne ved 37 °C i en CO 2-inkubator på 5 %. Udskift det gamle G-medium med det friske G-medium hver anden dag. Overhold cellerne på dag 1 og dag 3.

5. Cellepasaging

  1. Tag fadet ud af inkubatoren, fjern det brugte medium og vask to gange med PBS. Tilsæt 2 mL 0,05% trypsin for hver 100 mm skål.
    BEMÆRK: Ryst fadet for at sikre, at der er tilstrækkelig kontakt mellem Trypsin-opløsningen og fadbunden.
  2. Lad fadet stå i en inkubator ca. 5 min ved 37 °C til fordøjelsesprocessen.
  3. Brug et mikroskop (40x) til at undersøge cellerne og sørg for, at de fleste celler er adskilt fra bunden af skålen.
  4. Tilsæt 2 mL af neutraliseringsopløsningen for at stoppe fordøjelsen og overføre cellerne til et 15 mL rør. Pipette op og ned 10-15 gange. Centrifugere cellerne ved 200 x g i 5 min.
  5. Fjern supernatanten langsomt. Brug cellerne igen med 10 mL G-medium, og antallet af celler tælles.
  6. Der tilsættes ca. 1 x 106 celler i 10 mL G-medium og 10 μM Y-27632 til hver 100 mm skål.
  7. Forny G-medium og Y-27632 hver 2. dag. Se cellerne på dag 1 og dag 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et skemat diagram over den direkte explantmetode og den ændrede enzymatiske metode. Den direkte explant metode behøver ikke noget fordøjelsesenzym under hele processen. I modsætning hertil har den traditionelle enzymatiske metode normalt brug for to sæt fordøjelsesenzymer, dispase og kollagenase, for at adskille epitelarket fra det underliggende fibroblastlag og derefter trypsin for at frigive epitelcellerne i suspension. Vores nye metode udelader adskillelsestrinnet og er en forenklet enzymatisk metode. Desuden, tilføjer Y-27632 til G-medium effektivt fremmer epitelcellevækst. Den direkte explant metode tager normalt omkring 2 uger for gingival epitelceller til at vokse tilstrækkeligt til passage og er let forurenet. Antallet af gingivale epitelceller, der opnås ved den nye metode, er imidlertid betydeligt større end det, der opnås ved den direkte explantmetode, og tager kun i gennemsnit 8 dage at opfylde kravene til passaging.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af den direkte explantmetode og den nye metode. Gingival vævsstykkerne er placeret i en kulturret. Epitelcellerne dyrkes i G-medium og vokser ud af vævsstykkerne. Den direkte explant metode tager normalt omkring 13 dage for epitelcellerne at nå 80% sammenløb. (B) Ordning, der viser processen med den nye enzymatiske metode. Gingival vævsfragmenter fordøjes af dispase og kollagen I, hvorefter cellepillerne dyrkes i G-medium med Y-27632. Den nye enzymatiske metode tager normalt ca. 6 dage at nå 80% sammenløb, hvilket er egnet til passaging. Klik her for at se en større version af dette tal.

Voksne gingivale epitelceller fremstillet ved hjælp af den direkte explantmetode og efter den nye metode blev observeret i et mikroskop på den tredje og syvende dag (figur 2A). Det kan ses, at den nye metode øgede produktionen af gingivale epitelceller betydeligt på den tredje og syvende dag. Vækstkurverne for gingivale epitelceller, der er opnået ved den nye metode og ved den direkte explantmetode, blev målt ved hjælp af et celletællingssæt (CCK-8) på forskellige tidspunkter (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figur 2B). Fordoblingstiden for celler, der blev forberedt ved hjælp af den nye metode, var ca. 1-2 dage, men fordoblingstiden for celler, der blev forberedt ved hjælp af den direkte explantmetode, var ca. 5-6 dage. Celleudbyttet ved de to metoder blev beregnet på den syvende dag (Figur 2C) og viste, at antallet af celler, der blev produceret ved den nye metode (9 x 106), var mere end tre gange højere end antallet af celler, der blev produceret ved den direkte explantmetode (3 x 106). Figur 2D viser, at det tog omkring halvdelen af tiden for den nye metode (6 dage) at opnå 80% sammenløb sammenlignet med den direkte explant metode (13 dage).

Figure 2
Figur 2: Den nye enzymatiske metode øger produktionen af primære gingivale epitelceller. (A) Billeder af gingivale epitelceller, der er fremstillet ved den direkte explantmetode (nederste række) og den nye enzymatiske metode (øverste række) på tredje og syvende dag efter den første podning. Skalastænger = 200 μm. (B) Gingivale epitelceller, der dyrkes ved den direkte metode, og den nye enzymatiske metode blev indsamlet på dag 1, 2, 3, 4, 5 og 6, og antallet af gingivale epitelceller blev analyseret ved hjælp af et CCK-8-sæt. (C) Efter 7 dages kultur blev gingivale epitelceller løsrevet ved trypsin og indsamlet. En celletælling plade blev brugt til at bestemme antallet af gingival epitelceller udarbejdet separat ved de to metoder. Antallet af celler blev beregnet ud fra de to metoder, som blev gentaget tre gange separat, og resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal celler pr. 100 mm skål. (D) Den gennemsnitlige tid til at nå op på 80 % sammenløb af primære gingivale epitelceller (passage 0), der fremstilles ved den nye enzymatiske metode, og ved hjælp af den direkte explantmetode sammenlignes. B, C og D: Student's t-testblev brugt; fejllinjerne viser standardafvigelsen. n = 4; ** p < 0,01, * p < 0,05, når man sammenligner den nye enzymatiske metode med den direkte explant metode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Immunofluorescenceanalyse af gingivale epitelceller (ved passage 3) opnået ved den nye metode viste, at udtrykket CK5, CK18 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) var positivt (Figur 3A, C,D)11,12,13,14,15, mens udtrykket CK10 og vimentin var lav ( Figur3B,E)11,16. CK5 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) blev hovedsageligt lokaliseret i det basale lag af epitelceller, hvilket er et tegn på deres høje differentieringspotentiale11,14,15. CK10 er en markør for differentieret epitel11, og vimentin er en markør for gingival fibroblaster16. Den keratin positive sats af gingival epitelceller isoleret af den nye metode var højere, især CK5, CK18, og Pan-CK (Figur 3A,C,D), som indikerede, at de isolerede gingival epitelceller kunne opretholde en god kældermembran funktion. Det lave udtryk for differentieringsmarkøren CK10 (Figur 3B) indikerede, at de gingivale epitelceller havde et højt differentieringspotentiale. In vitro kulturer viste, at gingival epitelceller isoleret af den nye metode kunne dyrkes til ottende generation, og det lave udtryk for vimentin viste, at gingival epitelceller havde en høj renhed, at ingen gingival fibroblaster forurenet dem, og at isolationseffektiviteten var høj (Figur 3E).

Figure 3
Figur 3: Specifikke markører for gingivale epitelceller (P3) udarbejdet ved den nye enzymatiske metode. (A-E) viser CK5 (rød), CK10 (rød), CK18 (rød), Pan-CK (rød) og vimentin (rød) positive celler, DAPI (blå) blev brugt til at plette kerner. (A-C) skalastænger = 100 μm; (D) oge) skalastænger = 50 μm eksperimentet blev gentaget fire gange uafhængigt. (A), (C) og (D) viser det positive udtryk af CK5, CK18 og pan-ck (CK14, 15, 16 og 19) i gingivale epitelceller, mens (B) og (E) viser det lave udtryk for CK10 og vimentin i gingivale epitelceller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den nye metode øgede udtrykket af ki67, p63, og p75NGFR (lav affinitet nerve vækstfaktor receptor p75) i primære gingival epitelceller. Passage 3 celler blev udvalgt til Immunofluorescence analyse, som viste, at det positive udtryk for ki67, p63, og p75NGFR var højere end for gingival epitelceller opnået ved direkte explant metode (Figur 4A, C,E). De positive udtryksrater for ki67, p63 og p75NGFR var henholdsvis 80%, 98% og 96% i den nye metode, som var betydeligt højere end for ki67 (35%), p63 (40%) og p75NGFR (47%) opnået ved den direkte metode (figur 4B, D, F). Ki67, p63 og p75NGFR er markører for oral epitel stamceller17. Disse resultater viste, at de primære gingivale epitelceller, der var isoleret og kultiveret ved hjælp af den nye metode, indeholdt stamcellepopulationer, havde et højt spredningspotentiale og opretholdt stamcelleegenskaberne for gingivale epitelceller.

Figure 4
Figur 4: Stamcellekarakteristika for gingivale epitelceller (P3), der er opnået ved direkte explantmetode og den nye enzymatiske metode. (A),(C) og( E) viser repræsentative immunfluorescencebilleder af gingivale epitelceller ved henholdsvis passage 3 (P3), der viser ki67 (rød), p63 (rød) og p75NGFR (rød) positive celler opnået ved den direkte explantmetode og den nye enzymatiske metode. DAPI (blå) blev brugt til at plette kerner. Skalastænger = 50 μm. (B), (D) og (F) viser kvantitativ analyse af ki67-positive celler, p63-positive celler og p75NGFR-positive celler, henholdsvis i gingivale epitelceller (P3), der er opnået ved den direkte explantmetode og ved den nye enzymatiske metode. I alt 400 celler blev talt for at kvantificere hver gruppe, og det gennemsnitlige antal af ki67, p63 og p75NGFR positive celler vises. B, D og F: Student's t-testblev brugt; fejllinjerne viser standardafvigelsen. eksperimentet blev gentaget fire gange uafhængigt (n = 4) ** p < 0,01, når man sammenligner den nye enzymatiske metode med den direkte explant metode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den gingival væv er en central struktur, der opretholder paradentose integritet og sundhed. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparation og regenerering af paradentosevæv og kan anvendes i videnskabelig forskning og kliniske anvendelser og relaterede områder, herunder oral biologi, farmakologi, toksikologi, og mundslimhinden mangler18. Derfor er det nødvendigt at udvikle en stabil og effektiv metode til at høste orale epitelceller19. Primære epitelceller er en slags fuldt differentierede celler med få passager og en kort levetid. Dyrkning af epitelceller har vist sig at være mere komplekse end dyrkning af fibroblaster5.

På nuværende tidspunkt viser den offentliggjorte litteratur, at der findes forskellige protokoller for isolation og kultur af epitelceller. To metoder, den direkte explantmetode og den enzymatiske metode, er imidlertid de hyppigst anvendte blandt disse protokoller. I 1910, Carrel og Burrows først beskrevet en metode til at opnå gingival og buccal epitelceller kaldet direkte explant metode20. Den direkte explant metode har fordelene ved lavvægtsbehov for vævsprøver, mindre komplicerede procedurer, mindre variation og mindre involvering i trinene, men den har ulemperne ved at kræve lang kulturtid og er meget modtagelig for forurening5. I 1975 rapporterede Rheinwald og Green første gang den enzymatiske metode ved hjælp af bestrålede 3T3 musefibroblaster som et feederlag til kultur orale epitelceller in vitro21. Selv om denne metode i høj grad forbedret udbyttet af keratinocytter, den bestrålede mus feeder celle lag havde potentielle biologiske risici22. Derefter blev der udviklet kultursystemer uden feeder-celler22 og uden serum23,24, som beviste, at 3T3-celler ikke var nødvendige for epitelcellekulturer. Selvom den enzymatiske metode kræver mindre kulturtid, er effektiviteten relativt lav og varierer afhængigt af de enzymer og medium, der anvendes25. Flere laboratorier sammenlignede de to metoder, og Kedjarune et al.6 observerede den direkte explant teknik til at være mere vellykket end den enzymatiske metode og fandt en højere grad af cellespredning. Shwetha et al.26 konkluderede, at den direkte explant metode synes at være en enkel og vellykket teknik til isolering af mundslimhinden keratinocytter. Klingbeil et al.7 konkluderede dog lige det modsatte, dvs. den enzymatiske metode viste de bedste resultater på kortere tid med en god levetid. En undersøgelse foretaget i Storbritannien af Daniels et al.19 gennemgik isolations- og cellekulturmetoderne for menneskelige keratinocytter og rapporterede, at 21 ud af 34 laboratorier, der svarede, brugte den enzymatiske metode med nogle variationer. Selvom den direkte explant-metode kræver mindre væv og har færre håndteringstrin end den enzymatiske metode, er det blevet foreslået, at den enzymatiske metode er hurtigere og lettere at administrere6. Derfor var det nødvendigt at udvikle en mere bekvem og effektiv metode til isolering og kultur af orale epitelceller4. Vores nye metode, en forenklet enzymatisk metode, der bruger Y-27632, øgede produktionen af gingivale epitelceller betydeligt og forkortede den tid, det tager at adskille gingivale epitelceller fra gingivalt væv.

Figur 2A viser, at den nye metode øgede produktionen af gingivale epitelceller betydeligt på den tredje og syvende dag. Figur 2B viser, at fordoblingstiden for celler, der blev forberedt ved hjælp af den nye enzymatiske metode, var ca. 1-2 dage, men det tog ca. 5-6 dage at bruge den direkte explantmetode. Antallet af celler, der blev produceret ved hjælp af den nye enzymatiske metode (9 x 106), var mere end tre gange større end den direkte explantmetode (3 x 106) på den syvende dag (Figur 2C). Celler fremstillet ved hjælp af den nye enzymatiske metode tog 13 dage at blive 80% sammenløb, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, mens den direkte explant metode tog omkring 2 uger6, 20,25 ± 1,05 dage18 og 14,2 ± 2,76 dage7 for cellerne at blive fuldt sammenstillet før subkultur. Den nye enzymatiske metode tog dog kun 6 dage at blive 80% sammenflyttet, hvilket er meget kortere end den direkte explant-metode på 13 dage i vores laboratorium og Klingbeil et al.'s7 enzymatiske metode på 11,9 ± 2,36 dage. Vi fandt også et interessant fænomen, det vil sige, at epitelcellekolonierne voksede i en flerlags struktur i den direkte explant-metode, mens en ensartet monolagsstruktur blev observeret ved hjælp af den nye enzymatiske metode. Det er klart, tykkere flerlags kolonier forlænge den tid, der kræves for at blive 80% -100% sammenløb. Grunden til, at den nye enzymatiske metode fremmer cellespredning, er tilføjelsen af Y-27632, en hæmmer af ROCK1 og ROCK2. Y-27632 blev oprindeligt rapporteret for dens positive virkninger på spredning og differentiering af menneskelige epitelceller i 200827. Chapman et al.28 rapporterede, at behandling med Y-27632 i høj grad øget den proliferative kapacitet keratinocytter og resulterede i effektiv udødeliggørelse uden påviselig celle krise. I vores tidligere undersøgelser opdagede vi, at Y-27632 forenkler isolationsproceduren for menneskelige primære epidermale celler og keratinocytter fra voksent hudvæv8,9,10. Strudwick et al.29 rapporterede, at brugen af 10 μM Y-27632 sammen med lavt calcium gjorde det muligt at dyrke primære menneskelige keratinocytter uden et celleføderlag i længere tid, samtidig med at evnen til at differentiere og danne et stratificeret epitel bevares. I denne undersøgelse øgede den nye enzymatiske metode ved hjælp af Y-27632 i høj grad høsten af epitelceller ved at forlænge deres levetid og fremme deres proliferative kapacitet.

Den traditionelle enzymatiske metode indeholder to fordøjelsesoperationer. Den første fordøjelse er at adskille epitelvæv fra bindevæv ved hjælp af dispase, som virker fra stromal side4,5. Den anden fordøjelse bruger normalt trypsin til at adskille epitelceller fra epitelvæv4,5. På grund af ødelæggelsen af epitelceller ved trypsin påvirkes effektiviteten af enzymatisk metode4. Den nye enzymatiske metode, der er beskrevet her, er en forenklet metode, der udelader et fordøjelsestrin. De vigtigste forskelle mellem de nye og traditionelle enzymatiske metoder henviser til protokollerne for adskillelse af epitelvæv fra bindevæv5. Derudover bruger den nye metode dispase og kollagenase i stedet for trypsin i fordøjelsestrinnet, og dermed er epitelcellernes integritet godt beskyttet. Klinisk er det meget vanskeligere at opnå den samme mængde væv fra human gingiva end fra huden og buccal slimhinden. Den direkte explant metode krævede kun små stykker gingivalt væv og dyrkede et større antal celler sammenlignet med den enzymatiske metode18. Vi behandlede en lille mængde gingival epitelvæv ved hjælp af den nye metode og høstede en meget tilfredsstillende celletæthed. Dette viser, at den nye metode ikke afhænger af relativt store mængder væv, der i første omgang skal leveres. En mulig begrænsning af den nye metode er, at der kan forekomme en lille mængde (<5%) forurening af fibroblaster ved den oprindelige kultur (passage 0), men det kan let fjernes ved en kortsigtet behandling på 0,05% trypsin som rapporteret previsouly9.

I denne undersøgelse var CK5, CK18 og Pan-CK (CK14, CK15, CK16 og CK19) positive (Figur 3A, C,D). Dette antydede, at de isolerede gingivale epitelceller var i stand til at opretholde deres kældermembranfunktion, hvilket er i overensstemmelse med undersøgelserne af Orazizadeh et al.30 og Kedjarune et al.6. CK5 og CK14 udtrykkes af udifferentierede celler lokaliseret i epitel-basallaget. CK19 findes typisk i simpelt epitel og i ikke-keratiniseret stratificeret epitel31. Immunofluorescenceanalyse af gingivale epitelceller (P3), der blev opnået ved hjælp af den nye enzymatiske metode, viste, at udtryksniveauerne for ki67, p63 og p75NGFR var højere end i celler, der blev opnået ved hjælp af den direkte explantmetode (Figur 4). Dette resultat indikerer, at den nye metode kan opretholde stamcelleegenskaberne af gingivale epitelceller og fremmer spredningspotentialet i gingivale epitelceller. Vores tidligere undersøgelse viste, at Y-27632 opretholder hudens epidermale stamcellepotentiale efter ekspansion8. Wang et al. fandt, at Y-27632 letter spredning, migration og pluripotency af human parodontale ledbånd stamceller32.

Sammenfattende giver den nye modificerede enzymatiske metode en forenklet og effektiv procedure til at isolere og kultur menneskelige primære epitelceller fra voksen gingivalt væv. Denne nye metode er lettere, mindre tidskrævende og forbedrer deres stamcelleegenskaber og har således åbenlyse fordele i forhold til den direkte explant-metode på mange parametre. Denne avancerede metode er mere velegnet til fremstilling af et stort antal højpotentialende epitelceller både til laboratorie- og kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W.; det centrale forsknings- og udviklingsprogram i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Names Abbreviations & Comments
Countess automated cell counter Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. BBA0218AC Automatic cell counting
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubation
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50 ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifugation
1.5 ml microcentrifuge Tubes KIRGEN 190691J For cell digestion
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Gingival epithelial  cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HGGEPCs dissociation
Dilution Medium Life Technologies 50-9701 For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HGGEPCs isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HGGEPCs isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Gene Operation IAD1011 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies CK04 For Cell proliferation assay
Rabbit Anti-Human CK18 Abcam ab82254 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 Abcam ab76318 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts
Rabbit Anti-Human pan-ck BD 550951 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-Ki67 Abcam 15580 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p63 Biolegend 619002 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p75NGFR Abcam ab52987 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Tags

Bioengineering gingival epitelceller enzymatisk metode direkte explant metode celle isolation cellekultur Y-27632 Rho-associerede kinase hæmmer immunofluorescence analyse
Isolation og kultur af primære menneskelige gingivale epitelceller ved hjælp af Y-27632
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q.,… More

Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q., Liu, C., Wen, J., Zhang, Q., Liu, P., Liu, G., Guo, J., Wu, X. Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632. J. Vis. Exp. (177), e62978, doi:10.3791/62978 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter