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Biochemistry

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Published: September 13, 2021 doi: 10.3791/62992
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,2,3, 1,2,3,5
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्रिड के लक्षित क्षेत्रों में सेल आसंजन और विकास को निर्देशित करना है। यह एक एंटी-फाउलिंग परत को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट पैटर्न में एब्लेटेड होता है, जिसके बाद सेल सीडिंग से पहले पैटर्न वाले क्षेत्रों में अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन का जमाव होता है।

Abstract

होल-सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) एक शक्तिशाली तकनीक है जिसका उपयोग सेलुलर संदर्भ में मौजूद मैक्रोमोलेक्यूल्स की नैनोमीटर-स्तर की रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए किया जाता है और निकट-देशी जमे हुए-हाइड्रेटेड राज्य में संरक्षित किया जाता है। हालांकि, टीईएम ग्रिड पर कोशिकाओं को संवर्धित करने और / या पालन करने से जुड़ी चुनौतियां हैं जो कोशिकाओं को उनकी शारीरिक स्थिति में बनाए रखते हुए टोमोग्राफी के लिए उपयुक्त है। यहां, टीईएम ग्रिड पर यूकेरियोटिक सेल विकास को निर्देशित करने और बढ़ावा देने के लिए माइक्रोपैटर्निंग के उपयोग पर एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। माइक्रोपैटर्निंग के दौरान, सेल विकास को टीईएम ग्रिड की पन्नी पर निर्दिष्ट पैटर्न और पदों के भीतर अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन जमा करके निर्देशित किया जाता है, जबकि अन्य क्षेत्र एंटी-फाउलिंग परत के साथ लेपित रहते हैं। सतह कोटिंग और पैटर्न डिजाइन की पसंद में लचीलापन माइक्रोपैटर्निंग को सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए व्यापक रूप से लागू करता है। माइक्रोपैटर्निंग व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर संरचनाओं के अध्ययन के साथ-साथ मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन या विभेदित बहु-सेलुलर समुदायों जैसे अधिक जटिल प्रयोगात्मक प्रणालियों के अध्ययन के लिए उपयोगी है। Micropatterning को कई डाउनस्ट्रीम पूरे-सेल क्रायो-ईटी वर्कफ़्लो में भी एकीकृत किया जा सकता है, जिसमें correlative light and electron microscopy (cryo-CLEM) और focused-ion beam milling (cryo-FIB) शामिल हैं।

Introduction

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के विकास, विस्तार और बहुमुखी प्रतिभा के साथ, शोधकर्ताओं ने मैक्रोमोलेक्यूलर (~ 1 एनएम) से उच्च (~ 2 Å) संकल्प तक एक निकट-देशी राज्य में जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच की है। एकल-कण क्रायो-ईएम और इलेक्ट्रॉन विवर्तन तकनीकों को क्रमशः समाधान में या क्रिस्टलीय अवस्था में शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूल्स पर सबसे अच्छा लागू किया जाता है। जबकि क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) बैक्टीरिया, प्लियोमॉर्फिक वायरस और यूकेरियोटिक कोशिकाओं जैसे बड़े, हेटरोलॉगस वस्तुओं के निकट-देशी संरचनात्मक और अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन के लिए विशिष्ट रूप से उपयुक्त है। क्रायो-ईटी में, तीन आयामी (3 डी) जानकारी को माइक्रोस्कोप चरण पर नमूने को शारीरिक रूप से झुकाकर और विभिन्न कोणों पर नमूने के माध्यम से छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करके प्राप्त किया जाता है। ये छवियां, या झुकाव-श्रृंखला, अक्सर एक-से-तीन-डिग्री वृद्धि में +60 /-60 डिग्री की सीमा को कवर करती हैं। झुकाव-श्रृंखला को तब कम्प्यूटेशनल रूप से 3 डी वॉल्यूम में पुनर्निर्मित किया जा सकता है, जिसे टोमोग्राम 4 के रूप में भी जाना जाता है।

सभी क्रायो-ईएम तकनीकों के लिए नमूने को अनाकार, गैर-क्रिस्टलीय, विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली क्रायो-फिक्सेशन तकनीकों में से एक डुबकी ठंड है, जहां नमूना ईएम ग्रिड पर लागू होता है, धब्बा लगाया जाता है, और तेजी से तरल इथेन या तरल एथेन और प्रोपेन के मिश्रण में डूब जाता है। यह तकनीक <100 एनएम से ~ 10 μm मोटाई में नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए पर्याप्त है, जिसमें सुसंस्कृत मानव कोशिकाएं शामिल हैं, जैसे कि हेला कोशिकाएं 5,6। मोटे नमूने, जैसे मिनी-ऑर्गेनोइड्स या ऊतक बायोप्सी, मोटाई में 200 μm तक, उच्च दबाव ठंड 7 द्वारा विट्रिफाइड किया जा सकता है। हालांकि, मोटे नमूनों के इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन में वृद्धि के कारण, क्रायो-ईटी के लिए नमूना और बर्फ की मोटाई 300 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ~ 0.5 - 1 μm तक सीमित है। इसलिए, कई यूकेरियोटिक कोशिकाओं के पूरे सेल क्रायो-ईटी सेल परिधि या कोशिकाओं के एक्सटेंशन तक सीमित है जब तक कि अतिरिक्त नमूना तैयारी चरणों का उपयोग नहीं किया जाता है, जैसे क्रायो-सेक्शनिंग 8 या केंद्रित-आयन बीम मिलिंग 9,10,11।

कई पूरे सेल क्रायो-ईटी इमेजिंग प्रयोगों की एक सीमा डेटा संग्रह थ्रूपुट 12 है। एकल-कण क्रायो-ईएम के विपरीत, जहां हजारों अलग-अलग कणों को अक्सर एक एकल टीईएम ग्रिड वर्ग से चित्रित किया जा सकता है, कोशिकाएं बड़ी, फैल-आउट होती हैं, और कोशिकाओं को विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में संरक्षित करने की अनुमति देने के लिए कम घनत्व पर उगाया जाना चाहिए। अक्सर ब्याज का क्षेत्र सेल की एक विशेष विशेषता या उप-क्षेत्र तक सीमित होता है। आगे सीमित थ्रूपुट उन क्षेत्रों पर बढ़ने के लिए कोशिकाओं की प्रवृत्ति है जो टीईएम इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जैसे कि टीईएम ग्रिड सलाखों पर या उसके पास। टीईएम ग्रिड पर सेल संस्कृति से जुड़े अप्रत्याशित कारकों के कारण, डेटा अधिग्रहण के लिए नमूना पहुंच और थ्रूपुट में सुधार करने के लिए तकनीकी विकास की आवश्यकता होती है।

अनुयायी अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ सब्सट्रेट माइक्रोपैटर्निंग लाइव-सेल लाइट माइक्रोस्कोपी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जो कठोर, टिकाऊ और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी सतहों जैसे कि ग्लास और अन्य ऊतक संस्कृति सब्सट्रेट्स 13,14 पर कोशिकाओं के विकास को निर्देशित करती है। माइक्रोपैटर्निंग को नरम और / या तीन आयामी (3 डी) सतहों पर भी किया गया है। इस तरह की तकनीकों ने न केवल कोशिकाओं की सटीक स्थिति के लिए अनुमति दी है; उन्होंने बहुकोशिकीय नेटवर्क के निर्माण का भी समर्थन किया है, जैसे कि पैटर्न वाले तंत्रिका सेल सर्किट 15। क्रायो-ईटी में माइक्रोपैटर्निंग लाने से न केवल थ्रूपुट में वृद्धि होगी, बल्कि यह जटिल और गतिशील सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट की खोज के लिए नए अध्ययन भी खोल सकता है।

हाल ही में, कई समूहों ने कई दृष्टिकोणों के माध्यम से TEM ग्रिड पर micropatterning तकनीकों का उपयोग करना शुरू कर दिया है16,17। यहां, TEM ग्रिड के लिए एक maskless photopatterning तकनीक का उपयोग Alvéole PRIMO micropatterning प्रणाली है, जो उच्च संकल्प और संपर्क रहित patterning सुविधाएँ का उपयोग कर वर्णित है. इस micropatterning प्रणाली के साथ, एक विरोधी fouling परत सब्सट्रेट के शीर्ष पर लागू किया जाता है, एक फोटोकैटालिस्ट के आवेदन के बाद और एक यूवी लेजर के साथ उपयोगकर्ता परिभाषित पैटर्न में विरोधी fouling परत के ablation द्वारा पीछा किया. ईसीएम प्रोटीन को तब उपयुक्त सेल संस्कृति के लिए पैटर्न में जोड़ा जा सकता है। इस विधि का उपयोग रेटिना वर्णक उपकला -1 (आरपीई 1), मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी -II (एमडीसीकेआईआई), मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफएफ), और एंडोथेलियल सेल लाइनों 16,17,18 के क्रायो-ईटी अध्ययन के लिए कई समूहों द्वारा किया गया है। यह micropatterning प्रणाली कई विरोधी fouling परत substrates के रूप में के रूप में अच्छी तरह से या तो एक तरल या जेल photocatalyst अभिकर्मक के साथ संगत है. विभिन्न प्रकार के ईसीएम प्रोटीन को सेल लाइन की विशिष्टता के लिए चुना और अनुकूलित किया जा सकता है, जो उपयोगकर्ता के लिए बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है।

Micropatterning सफलतापूर्वक प्रयोगशाला 19 के भीतर परियोजनाओं की एक संख्या के लिए लागू किया गया है। यहां, एक माइक्रोपैटर्निंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें सुसंस्कृत हेला कोशिकाओं, श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी) -संक्रमित बीईएएस -2 बी कोशिकाओं और प्राथमिक लार्वा ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर न्यूरॉन्स 20 का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट अनुकूलन शामिल हैं।

Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल संस्कृति, माइक्रोपैटर्निंग और इमेजिंग विधियों का एक संकलन है जिसका उपयोग राइट लैब और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन में क्रायो-ईएम रिसर्च सेंटर द्वारा किया जाता है। वर्कफ़्लो चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है। अतिरिक्त प्रशिक्षण और अनुदेशात्मक सामग्री निम्नलिखित साइटों पर उपलब्ध हैं: https://cryoem.wisc.edu या https://wrightlab.wisc.edu

1. पैटर्निंग के लिए ग्रिड की तैयारी

  1. TEM ग्रिड को एक साफ ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें, कार्बन साइड अप (कार्बन पन्नी की मानक मोटाई 12 एनएम है)। एक कार्बन बाष्पीकरणकर्ता, ACE600 का उपयोग करके, समग्र कार्बन फिल्म स्थायित्व को बढ़ाने के लिए ग्रिड पर अतिरिक्त कार्बन के 5-8 एनएम को वाष्पित करें।
    नोट:: यह चरण SiO2 ग्रिड के लिए आवश्यक नहीं है। यह कदम पहले से भी किया जा सकता है; इस तरह के एक वैक्यूम desiccator के रूप में एक कम आर्द्रता वातावरण में लेपित ग्रिड की दुकान.
  2. ग्रिड को एक ग्रिड प्रेप धारक को स्थानांतरित करें और चमक ग्रिड कार्बन पक्ष ऊपर निर्वहन. एक चमक निर्वहन प्रणाली का उपयोग करते हुए, चमक एक 80 मिमी काम दूरी और 1.0 x 10-3 mbar के वैक्यूम दबाव के साथ 10 mA पर 60 s के लिए ग्रिड निर्वहन। अगले चरण के 15-30 मिनट के भीतर ऐसा करें।
    नोट: ग्रिड prep धारकों को व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या एक छोटे से पेट्री डिश पर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ घर का बना हो सकता है।

2. विरोधी fouling परत के आवेदन

नोट: ग्रिड को संभालते समय उचित बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए, और सभी समाधानों को बाँझ और / या फ़िल्टर निष्फल किया जाना चाहिए।

  1. ग्रिड (कार्बन साइड अप) को एक साफ ग्लास स्लाइड या ग्रिड के बीच कम से कम 1 सेमी अलगाव के साथ कवरस्लिप में स्थानांतरित करें। पिपेट 10 μL 0.05% पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) प्रत्येक ग्रिड पर। एक आर्द्र कक्ष में ग्रिड को इनक्यूबेट करें, जैसे कि नम कागज तौलिए के साथ एक संलग्न प्लास्टिक बॉक्स, कम से कम 30 मिनट के लिए।
    नोट:: इस चरण को रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि कक्ष में आर्द्रता का स्तर ग्रिड को सूखने से रोकने के लिए पर्याप्त है।
  2. 0.1 M HEPES pH 8.5 के 15 μL के साथ प्रत्येक ग्रिड को तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ग्रिड को सूखने दिए बिना एक पिपेट के साथ ग्रिड से अधिकांश तरल को हटा दें। ताजा बफर के 15 μL जोड़ें, कम से कम 30 s के लिए इनक्यूबेट और दोहराएँ। अंतिम धोने के बाद 0.1 M HEPES के 15 μL में प्रत्येक ग्रिड को छोड़ दें।
    नोट:: इस चरण और भविष्य के चरणों में, ग्रिड गीला रखने के लिए और पिपेट और ग्रिड के बीच संपर्क से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
  3. प्रत्येक ग्रिड के लिए 0.1 M HEPES pH 8.5 में 100 mg/mL polyethylene glycol-succinimidyl valerate (PEG-SVA) का 10 μL तैयार करें। PEG-SVA एक स्पष्ट समाधान में जिसके परिणामस्वरूप कोमल मिश्रण के साथ जल्दी से भंग हो जाएगा।
    नोट:: PEG-SVA समाधान पहले से तैयार न करें। PEG-SVA का pH 8.5 पर 10 मिनट का आधा जीवन है। पीईजी-एसवीए स्टॉक को अत्यधिक नमी के लिए उजागर करने से बचें, इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर एक डेसिकेटर या शुष्क वातावरण में संग्रहीत करके और खोलने से पहले कमरे के तापमान पर वार्मिंग करें।
  4. PEG-SVA समाधान तैयार करने के तुरंत बाद, प्रत्येक ग्रिड से HEPES pH 8.5 की 15 μL बूंद को हटा दें (ग्रिड को सुखाने के लिए ध्यान न रखें) और PEG-SVA समाधान की 10 μL बूंद जोड़ें। कम से कम 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: इस चरण को रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि कक्ष में आर्द्रता ग्रिड को सूखने से रोकने के लिए पर्याप्त है।
  5. बाँझ पानी के 15 μL के साथ प्रत्येक ग्रिड को तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ग्रिड को सूखने दिए बिना एक पिपेट के साथ ग्रिड से अधिकांश तरल को हटा दें, ताजे पानी के 15 μL जोड़ें, कम से कम 30 s के लिए इनक्यूबेट करें और दोहराएं। अंतिम धोने के बाद प्रत्येक ग्रिड को 15 μL पानी में छोड़ दें।

3. PLPP जेल लागू करना

  1. प्रत्येक ग्रिड के लिए एक साफ माइक्रोस्कोप कवरस्लिप तैयार करें। ग्रिड के सूखने की संभावना को कम करने के लिए प्रत्येक ग्रिड, एक समय में एक ग्रिड के लिए निम्न चरणों को पूरा करें।
  2. कवरस्लिप पर ग्रिड रखने और ग्रिड को गीला रखने में मदद करने के लिए कवरस्लिप के केंद्र पर पानी की एक 1.0 μL बूंद रखें। ध्यान से ग्रिड को 15 μL पानी की बूंद से कवरस्लिप पर 1.0 μL पानी की बूंद में स्थानांतरित करें। ग्रिड कार्बन पक्ष ऊपर रखने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. ग्रिड पर एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) स्टेंसिल को ध्यान से रखें, ग्रिड को केंद्रित रखने और ग्रिड के कार्बन पन्नी के साथ स्टेंसिल संपर्क को कम करने के लिए ध्यान रखें।
  4. ग्रिड पर 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium क्लोराइड (PLPP) जेल के 1.0 μL जोड़ें। Pipette धीरे मिश्रण करने के लिए (पिपेट टिप के साथ ग्रिड को स्पर्श न करें)।
  5. ग्रिड के साथ कवरस्लिप को सूखने के लिए एक अंधेरे स्थान पर ले जाएं। जेल लगभग 15-30 मिनट में सूख जाएगा।

4. अंशांकन और micropattern के डिजाइन

  1. एक हाइलाइटर के साथ एक ग्लास कवरस्लिप के एक तरफ रंग। ध्यान केंद्रित करना आसान बनाने के लिए एक ठीक-इत्तला वाले स्थायी मार्कर से काली रेखाएं जोड़ें। माइक्रोस्कोप पर कवरस्लिप को इस तरह रखें कि रंगीन पक्ष उद्देश्य लेंस का सामना करे। ब्राइटफील्ड मोड का उपयोग करके, हाइलाइटर पर ध्यान केंद्रित करें।
  2. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप और माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम पर संचालित है, और सही प्रकाश पथ सेट किया गया है। माइक्रोस्कोप कंप्यूटर पर माइक्रोमैनेजर और लियोनार्डो सॉफ्टवेयर (प्लगइन्स > लियोनार्डो) खोलें।
  3. कैलिब्रेट का चयन करें और ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। माइक्रोस्कोप फ़ोकस समायोजित करें ताकि स्लाइड पर प्रक्षेपित छवि फ़ोकस में हो. एक्सपोजर समय को कम करने की आवश्यकता हो सकती है। अंशांकन के बाद, अब प्रतिमान का चयन करें।
  4. प्रोग्राम की शीर्ष बाईं विंडो में अंशांकन डेटा के तहत रिपोर्ट किए गए माइक्रोमीटर /पिक्सेल (μm/ px) अनुपात को रिकॉर्ड करें (चित्र2, क्षेत्र 1)। किसी पैटर्न को डिज़ाइन करते समय प्रति माइक्रोमीटर का उपयोग करने के लिए पिक्सेल की संख्या निर्धारित करने के लिए इस अनुपात का उपयोग करें.
  5. अंशांकन के बाद, सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर अब माइक्रोस्कोप से लाइव ब्राइटफील्ड दृश्य के साथ खुला है। उद्देश्य लेंस का सामना करने वाले ग्रिड के साथ मंच पर एक कवरस्लिप (अनुभाग 3) पर एक तैयार ग्रिड लोड करें। चरण की स्थिति और फ़ोकस को समायोजित करें ताकि ग्रिड सॉफ़्टवेयर विंडो में दिखाई दे।
  6. माइक्रोमीटर में ग्रिड वर्गों और ग्रिड सलाखों के आकार को मापें। सॉफ़्टवेयर में ग्रिड को मापने के लिए नीचे बाएं कोने के पास बटन द्वारा सक्रिय एक मापनी शामिल है (चित्रा 2, क्षेत्र 2)। उदाहरण के लिए, 200 जाल ग्रिड के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले पैटर्न ~ 87 × 87 μm ग्रिड वर्गों और ~ 36 μm ग्रिड सलाखों के अनुरूप हैं।
    नोट: सॉफ्टवेयर मक्खी पर पैटर्न का आकार बदलने में लचीलापन प्रदान करता है, इसलिए माप में मामूली अशुद्धियों को सहन किया जा सकता है।
  7. ऊपर दिए गए माप और अनुपात के आधार पर, किसी भी छवि निर्माण सॉफ़्टवेयर के साथ पैटर्न (ओं) बनाएं। 20× उद्देश्य के साथ न्यूनतम सुविधा आकार 1.2 μm है। पैटर्न को असंपीड़ित 8-बिट .tiff फ़ाइलों के रूप में सहेजा जाना चाहिए।
    1. सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर सहेजते समय छवियों को किसी भिन्न पिक्सेल आकार में रीस्केल नहीं करता है. पैटर्न को 800 × 800 पिक्सेल बॉक्स के भीतर फिट होना चाहिए, जो चार ग्रिड वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
      नोट: 255 (सफेद) के मान के साथ पिक्सेल उच्चतम तीव्रता (लेजर की कुल खुराक) पर पैटर्न किया जाएगा और शून्य (काले) के मूल्य के साथ पिक्सेल पैटर्न नहीं किया जाएगा। एक मध्यवर्ती मूल्य के साथ किसी भी पिक्सेल को लगभग (एक्स / 255) * कुल खुराक की खुराक के साथ पैटर्न किया जाएगा। चित्रा 3A में, ग्रेस्केल पैटर्न के लिए 255 और 129 के पिक्सेल मानों का उपयोग किया गया था। एक बार पैटर्न डिजाइन किया जाता है तो इसे सहेजा जा सकता है और संशोधन के बिना पुन: उपयोग किया जा सकता है।

5. Micropatterning

  1. अंशांकन के बाद, सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर अब माइक्रोस्कोप से लाइव ब्राइटफील्ड दृश्य के साथ खुला है। उद्देश्य लेंस का सामना करने वाले ग्रिड के साथ मंच पर एक कवरस्लिप (अनुभाग 3) पर एक तैयार ग्रिड लोड करें। मंच की स्थिति और सॉफ़्टवेयर में ग्रिड को देखने के लिए फ़ोकस समायोजित करें।
  2. प्रारंभिक रन के लिए, कोई नया टेम्पलेट डिज़ाइन करें. सॉफ़्टवेयर में, ROI जोड़ें ( चित्र 2 क्षेत्र 3 के स्थान में नहीं दिखाया गया है) का चयन करें और एक 3,000 μm सर्कल चुनें। एक गाइड के रूप में स्क्रीन पर brightfield छवि का उपयोग कर ग्रिड पर सर्कल ROI की स्थिति. ROI को सुरक्षित करने के लिए लॉक दबाएँ.
  3. ROI को स्थान में लॉक करने के बाद, पैटर्न जोड़ें का चयन करें (नहीं दिखाया गया है, चित्र 2 क्षेत्र 3 के स्थान में)। अनुभाग 4 में डिज़ाइन किया गया पैटर्न चुनें. ग्रिड को छह क्षेत्रों में विभाजित करें ताकि प्रत्येक क्षेत्र में असमान ग्रिड के लिए कारक के लिए स्वतंत्र ध्यान केंद्रित करने और स्थिति की अनुमति मिल सके। ग्रिड के प्रत्येक कोने के लिए एक 8 × 8 ग्रिड वर्ग क्षेत्र और केंद्र के प्रत्येक तरफ एक 2 × 8 ग्रिड वर्ग क्षेत्र, केंद्र को चार ग्रिड वर्गों को अनपैटर्ड (चित्रा 2, केंद्र छवि) छोड़ देता है।
  4. पैटर्न की कुल प्रतियों की वांछित संख्या तक पहुँचने के लिए प्रारंभिक प्रतिमान की प्रतिलिपियाँ जनरेट करने के लिए प्रतिकृति विकल्पों (चित्र2, क्षेत्र 4) का उपयोग करें. यदि आवश्यक हो तो ग्रिड वर्गों के बीच रिक्ति से मेल खाने के लिए प्रतियों के बीच रिक्ति समायोजित करें.
  5. पैटर्न के लिए कुल खुराक सेट करें। 30 mJ/mm2 एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
  6. विशेषज्ञ विकल्प (चित्रा 2, क्षेत्र 4) के तहत ग्रिड वर्गों से मेल खाने के लिए क्षेत्र के कोण को समायोजित करें। माउस का उपयोग करके क्षेत्रों को पुनर्स्थापित किया जा सकता है। पैटर्न के अनुपात (आकार) को भी समायोजित किया जा सकता है। पैटर्न ग्रिड वर्गों के साथ लाइन अप तक पैटर्न के कोण, स्थिति, स्थान और अनुपात को समायोजित करने के माध्यम से पुनरावृत्ति करें। लाइव ब्राइटफील्ड डिस्प्ले में ग्रिड के क्षेत्र को बदलने के लिए माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करें।
  7. क्षेत्र में किए गए परिवर्तनों को सहेजने के लिए अवरोध दबाएँ .
  8. किसी क्षेत्र की प्रतिलिपि बनाने के लिए, बाईं ओर क्रियाएँ फलक में उसके नाम के आगे डुप्लिकेट बटन (चित्र 2, क्षेत्र 5, काग़ज़ की दो पत्रक चिह्न) क्लिक करें. प्रतिलिपि को पुनर्स्थापित करने, नाम बदलने या संपादित करने के लिए, क्रिया फलक में इसके नाम पर क्लिक करें.
  9. सभी वांछित क्षेत्रों को भरने के लिए आवश्यक के रूप में चरण 5.4-5.9 को दोहराएँ।
  10. एक बार जब पूरा टेम्पलेट डिज़ाइन और तैनात हो जाता है, तो सॉफ़्टवेयर के भीतर टेम्पलेट फ़ाइल सहेजें (चित्रा 2, क्षेत्र 6, शीर्ष टूलबार में ऊपर तीर आइकन के साथ बार)।
  11. पहले से सहेजे गए टेम्पलेट को लोड करते समय (नीचे तीर आइकन के साथ पट्टी) ग्रिड पर ROI को केंद्र में रखें और लॉक दबाएं। कोण, स्थिति, खुराक, और / या पैटर्न फ़ाइल को बदलने के लिए एक्शन पैनल में प्रत्येक क्षेत्र पर क्लिक करें।
  12. एक बार टेम्पलेट और पैटर्न तैनात होने के बाद, सॉफ़्टवेयर में एक्शन पैनल में क्षेत्रों में से एक को छोड़कर सभी को अनचेक करें।
  13. उस क्षेत्र में नेविगेट करने और कार्बन पन्नी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करें। एक्शन पैनल (चित्रा 2, क्षेत्र 5) में नेत्रगोलक आइकन पर क्लिक करने से पैटर्न ओवरले के प्रदर्शन को चालू या बंद कर दिया जाएगा।
  14. एक बार ग्रिड फोकस में होने के बाद, ब्राइटफील्ड शटर को बंद कर दें और पैटर्निंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर के निचले दाएं कोने में प्ले आइकन दबाएं, जिसकी लाइव निगरानी की जा सकती है।
  15. क्रिया फलक में, अगले क्षेत्र के लिए बॉक्स का चयन करें. ब्राइटफील्ड शटर खोलें ताकि ग्रिड दिखाई दे और माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करके उस क्षेत्र को केंद्र में रख सके। क्रिया फलक में प्रत्येक क्षेत्र के लिए चरण 5.13-5.14 दोहराएँ।
  16. माइक्रोस्कोप से ग्रिड के साथ coverslip निकालें, और तुरंत ग्रिड पर बाँझ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के 10 μL पिपेट।
  17. 10 मिनट के बाद, चिमटी के साथ स्टेंसिल को हटा दें, फिर पीबीएस के 15 μL के साथ ग्रिड 3x को धो लें। अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक ग्रिड को पीबीएस के 15 μL में रखें और ग्रिड को एक अंधेरे स्थान पर ले जाएं।

6. ईसीएम प्रोटीन का निक्षेपण

  1. सुसंस्कृत कक्षों के लिए, चरण 6.2-6.5 का पालन करें; प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए, चरण 6.6-6.10 का पालन करें।
  2. प्रत्येक ग्रिड के लिए ईसीएम के कम से कम 15 μL तैयार करें। बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के लिए, बाँझ पीबीएस में 0.01 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन और 0.01 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरोफोर-संयुग्मित फाइब्रिनोजेन की अंतिम एकाग्रता तैयार करें। हेला कोशिकाओं के लिए, बाँझ पीबीएस में 0.01 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय कोलेजन I और 0.1 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरोफोर-संयुग्मित फाइब्रिनोजेन तैयार करें।
  3. प्रत्येक ग्रिड से पीबीएस के अधिकांश को निकालें और ईसीएम के 15 μL लागू करें। कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: इस चरण को 4 °C पर रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है।
  4. ईसीएम में इनक्यूबेशन के बाद, बाँझ पीबीएस के साथ प्रत्येक ग्रिड 5x को धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ग्रिड को सूखने दिए बिना एक पिपेट के साथ अधिकांश तरल को हटा दें, ताजा पीबीएस के 15 μL जोड़ें, कम से कम 30 s के लिए इनक्यूबेट करें, और दोहराएं। अंतिम धोने के बाद पीबीएस में प्रत्येक ग्रिड छोड़ दें।
    नोट: ग्रिड को पीबीएस में एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जिसमें गुणवत्ता में कोई गिरावट नहीं देखी गई है।
  5. पैटर्निंग की पुष्टि करने के लिए ईसीएम में फ्लोरोफोर का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और कार्बन पन्नी बरकरार रही। कुछ टूटे हुए वर्ग आमतौर पर सहनीय होते हैं।
  6. प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए, पैटर्न वाले ग्रिड को 30 मिमी ग्लास बॉटम डिश में ले जाएं जिसमें बाँझ पीबीएस होता है।
  7. पकवान से PBS aspirate और 0.5 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरोफोर-संयुग्मित concanavalin ए के 2 मिलीलीटर लागू होते हैं एक बाँझ वातावरण में 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  8. कोकानावलिन डिश से एक समाधान निकालें (ग्रिड को सुखाने के बिना) और पीबीएस के साथ ग्रिड 3x को धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, पकवान से 2 एमएल पीबीएस जोड़ें और निकालें।
  9. पैटर्निंग की पुष्टि करने के लिए ईसीएम में फ्लोरोफोर का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और कार्बन पन्नी बरकरार रही। कुछ टूटे हुए वर्ग आमतौर पर सहनीय होते हैं।
  10. अंतिम धोने के बाद, ग्लास बॉटम डिश से पीबीएस को हटा दें और ताजा तैयार, बाँझ-फ़िल्टर किए गए पूरक श्नाइडर के ड्रोसोफिला मीडिया 21 के 2 एमएल जोड़ें, जिसमें 20% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 5 μg / एमएल इंसुलिन, 100 μg / mL पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10 μg / mL टेट्रासाइक्लिन शामिल हैं। एक बाँझ वातावरण में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि न्यूरॉन्स मढ़वाया जाने के लिए तैयार न हों।

7. सीडिंग से पहले प्राथमिक ड्रोसोफिला कोशिकाओं की तैयारी

  1. 70% EtOH के साथ एक 55 मिमी विच्छेदन पकवान sterilize, और फिर 2-3 mL बाँझ-फ़िल्टर किए गए 1× विच्छेदन लवण (9.9 mM HEPES pH 7.5, 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.17 mM NaH2PO4, 0.22 mM KH2PO4, 3.3 mM ग्लूकोज, 43.8 mM सुक्रोज) 21 के पकवान में जोड़ें।
  2. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके भोजन से धीरे से 30-40 3 rd instar लार्वा चुनें।
  3. लार्वा को 1× पीबीएस के साथ ट्यूब में रखें, फिर उन्हें लार्वा को धोने के लिए 1× पीबीएस के साथ दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. पीबीएस को धोने के लिए 70% EtOH के साथ ट्यूब में लार्वा को स्थानांतरित करें, फिर उन्हें 70% EtOH के साथ दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। लार्वा को निष्फल करने के लिए लार्वा को 2-3 मिनट के लिए दूसरी ट्यूब में छोड़ दें।
  5. लार्वा को 1× विच्छेदन लवणीय के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर तुरंत उन्हें 1× विच्छेदन खारा के साथ दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 1× विच्छेदन खारा युक्त विच्छेदन पकवान पर व्यक्तिगत लार्वा स्थानांतरण. संदंश और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की एक जोड़ी के साथ, मस्तिष्क को निकालने के लिए प्रत्येक लार्वा को जल्दी से फाड़ दें और इसे 1× विच्छेदन खारा के साथ तीसरी ट्यूब में स्थानांतरित कर दें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी दिमाग निकाले न जाएं।
  7. 1 मिनट के लिए 300 x g पर मस्तिष्क युक्त ट्यूब centrifuge.
  8. supernatant त्यागें, और 1× विच्छेदन खारा के 1 मिलीलीटर के साथ धोना और 1 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब centrifuge। इस चरण को एक बार और दोहराएँ.
  9. 200-250 μL ट्यूब में छोड़ दिया है जब तक supernatant त्यागें और 1x विच्छेदन खारा में 2.5 मिलीग्राम / mL Liberase के 20 μL जोड़ें।
  10. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर ट्यूब घुमाएं; इस घंटे के दौरान, हर 10 मिनट में 25-30 बार समाधान को पिपेट करें। अंत तक, समाधान थोड़ा अपारदर्शी होना चाहिए।
  11. 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. supernatant को त्यागें, तो पूरक श्नाइडर मीडिया के 1 mL जोड़ें. मिश्रण करने के लिए 30 बार समाधान pipette.
  13. 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  14. supernatant त्यागें और पूरक श्नाइडर मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़कर सेल गोली धोएं। मिश्रण करने के लिए 30 बार समाधान pipette.
  15. 5 मिनट के लिए 300 × जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  16. supernatant को त्यागें, तो पूरक श्नाइडर मीडिया के 300 μL के साथ सेल गोली resuspend. मिश्रण करने के लिए 30-40 बार समाधान pipette.

8. संस्कृति और BEAS-2B और HeLa कोशिकाओं के RSV संक्रमण

  1. T75 फ्लास्क में HeLa कोशिकाओं और BEAS-2B कोशिकाओं को 37 °C और 5% CO2 पर बनाए रखें। हर 3-4 दिनों में मार्ग कोशिकाएं एक बार लगभग 80% confluency तक पहुंचने के बाद। DMEM + 10% FBS + 1× एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक में हेला कोशिकाओं को बनाए रखें। RPMI + 10% FBS + 1× एंटीबायोटिक-Antimycotic6,22,23 में BEAS-2B बनाए रखें।
  2. असंक्रमित कोशिकाओं के सीडिंग के लिए, अनुभाग 9 पर जाएं। BEAS-2B और HeLa कोशिकाएं RSV संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हैं; बीईएएस -2 बी कोशिकाओं का उपयोग यहां दिखाए गए आरएसवी से जुड़े सभी प्रयोगों के लिए किया गया था।
    नोट: एक उपयुक्त जैव सुरक्षा कैबिनेट (BSC) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करके संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुपालन में सभी BSL-2 चरणों का प्रदर्शन करें।
  3. कोशिकाओं के आरएसवी संक्रमण से पहले, मार्ग 5 × 104 कोशिकाओं को एक 6-अच्छी तरह से प्लेट (सतह क्षेत्र ~ 9.6 सेमी 2) में 2 मिलीलीटर विकास मीडिया और रातोंरात इनक्यूबेट के साथ प्रति अच्छी तरह से।
  4. ट्रिप्सिनाइज़ करें और कोशिकाओं के एक कुएं की गिनती करें। ट्रिप्सिनाइज़ करने के लिए, एक अच्छी तरह से एस्पिरेट मीडिया और अवशिष्ट मीडिया को हटाने के लिए Mg2 + और Ca2 + के बिना बाँझ पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ धोएं। 0.25% ट्रिप्सिन समाधान के 500 μL जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। समय-समय पर यह देखने के लिए कोशिकाओं की जांच करें कि क्या वे सतह से जारी किए गए हैं। एक बार जब कोशिकाएं जारी हो जाती हैं, तो 1.5 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया जोड़ें।
  5. ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के 100 μL को ट्रिपपैन नीले रंग के 100 μL के साथ मिलाएं। एक हेमोसाइटोमीटर में पतला सेल मिश्रण के पिपेट 10 μL. कोशिकाओं की गणना करें और प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। नीचे MOI की गणना करने के लिए इस संख्या का उपयोग करें।
  6. मीडिया के 750 μL में 10 प्रति-अच्छी तरह से एमओआई प्राप्त करने के लिए विकास मीडिया में RSV-A2mK + 24 का एक कमजोर पड़ने की तैयारी करें। RSV-A2mK + के MOI की गणना स्टॉक के फ्लोरोसेंट फोकस इकाइयों (FFU) टिटर्स से की जा सकती है (उदाहरण के लिए: 1.0 × प्रति अच्छी तरह से 105 कोशिकाओं के लिए और 1.0 × 108 FFU / mL के RSV स्टॉक के लिए, वायरल स्टॉक 1: 75 से 1 × 106 FFU / 750 μL या 1.33 × 106 FFU / mL) को पतला करें।
  7. 6-अच्छी तरह से पकवान में कोशिकाओं से मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर से वायरल समाधान के 750 μL जोड़ें।
  8. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रॉक।
  9. 1 घंटे के बाद, विकास मीडिया के साथ 2 एमएल तक कुल मात्रा को 37 डिग्री सेल्सियस तक लाएं और प्लेट को 6 घंटे के लिए 5 % सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए इनक्यूबेटर में रखें।
  10. Trypsinize कोशिकाओं को उन्हें जारी करने के लिए और नीचे वर्णित के रूप में सीडिंग के लिए आगे बढ़ें। सीडिंग के बाद, डुबकी ठंड से पहले अतिरिक्त 18 घंटे के लिए ग्रिड को इनक्यूबेट करें (कुल 24 घंटे के बाद संक्रमण के लिए)।

9. माइक्रोपैटर्न ग्रिड पर सेल सीडिंग

  1. सुसंस्कृत कक्षों के लिए, चरण 9.2-9.8 का पालन करें; प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए, 9.9-9.11 का पालन करें।
  2. उन्हें जारी करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें (ऊपर अनुभाग 8 में चरण 4 देखें)। सेल एकत्रीकरण को कम करने के लिए, 60% या उससे कम confluency पर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें।
  3. ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के 100 μL को ट्रिपपैन नीले रंग के 100 μL के साथ मिलाएं। पतला सेल के पिपेट 10 μL एक हेमोसाइटोमीटर में मिश्रण करते हैं और कोशिकाओं की गिनती करते हैं।
  4. मीडिया में कोशिकाओं को 2 × 104 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
  5. ग्रिड को रखने और इसे सूखने से रोकने में सहायता करने के लिए 30 मिमी ग्लास बॉटम डिश के केंद्र में 1 μL मीडिया जोड़ें। ग्लास नीचे पकवान के केंद्र के लिए coverslip पर PBS से ग्रिड स्थानांतरण. ग्रिड में सेल समाधान के 10 μL जोड़ें।
  6. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 5 मिनट के बाद ग्रिड के लिए सेल आसंजन का निरीक्षण करें। यदि अधिकांश पैटर्न खाली रहते हैं, तो सेल समाधान की एक अतिरिक्त 10 μL ड्रॉप जोड़ें। ऊष्मायन के दौरान ग्रिड और सेल समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. चरण 9.6 को दोहराएं जब तक कि अधिकांश पैटर्न पर कब्जा नहीं कर लिया जाता है या कई कब्जे वाले पैटर्न में कई कोशिकाएं शुरू हो जाती हैं। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में 2 घंटे के लिए ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
  8. पूर्व गर्म मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ पकवान बाढ़ और रात भर इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
  9. प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए, ग्रिड युक्त पकवान से मीडिया को हटा दें और कोशिकाओं को पकवान पर प्लेट करें।
  10. कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए 30-60 मिनट प्रतीक्षा करें, फिर पूरक श्नाइडर के मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  11. डुबकी-ठंड से पहले कम से कम 2-3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में न्यूरॉन्स को संस्कृति करें।

10. इमेजिंग और patterned ग्रिड के vitrification

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर पैटर्न ग्रिड और सुसंस्कृत कोशिकाओं युक्त ग्लास नीचे पकवान जगह है।
  2. ब्राइटफील्ड और उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके ग्रिड की छवियों को प्राप्त करें ताकि पैटर्न और कोशिकाओं में किसी भी अन्य लेबलिंग का पता लगाया जा सके। सुनिश्चित करें कि सेल घनत्व और स्थिति डाउनस्ट्रीम इमेजिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।
    नोट: ब्राइटफ़ील्ड और फ्लोरोसेंट छवियों को फिजी सॉफ़्टवेयर पैकेज25 में संसाधित किया गया था।
  3. एक क्रायो-डुबकी फ्रीजर तैयार करें; फ्रीजिंग डिवाइस का प्रकार उपलब्धता, लागत और सुविधाओं पर निर्भर करेगा जो नमूने के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
    नोट: प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स को एक स्वचालित डुबकी-फ्रीजर पर तैयार किया गया था, और बीईएएस -2 बी कोशिकाओं को अर्ध-स्वचालित डुबकी-फ्रीजर का उपयोग करके तैयार किया गया था।
  4. झुकाव श्रृंखला के उचित संरेखण के लिए नमूनों के लिए सोने fiducials लागू होते हैं। अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए धब्बा नमूने, फिर नमूनों को क्रायोजेन में डुबो-फ्रीज करें, जैसे तरल एथेन तरल नाइट्रोजन द्वारा ठंडा किया गया। प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए, बैकसाइड से 4 एस के लिए धब्बा। HeLa और BEAS-2B कोशिकाओं के लिए, 4-6 s के लिए दोनों पक्षों से धब्बा। जमे हुए ग्रिड को तब तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आगे का उपयोग न हो।
  5. एक क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में छवि विट्रिफाइड कोशिकाएं, एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर कैमरे के साथ 300 केवी पर संचालित होती हैं। क्रायो-ईएम/क्रायो-ईटी डेटा संग्रह के लिए सीरियलईएम 26 जैसे सॉफ़्टवेयर के साथ रुचि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए झुकाव-श्रृंखला संग्रह सेट करें।
    नोट: प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स की झुकाव-श्रृंखला को -60 डिग्री से 60 डिग्री तक एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर पर 70-75 ई-/ Å2 की कुल खुराक के लिए 4.628 Å के पिक्सेल आकार के साथ -8 μm defocus पर द्विदिश रूप से 2 ° वृद्धि पर एकत्र किया गया था। RSV-संक्रमित BEAS-2B की झुकाव-श्रृंखला को एक ऊर्जा फ़िल्टर (20 eV भट्ठा) के साथ एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर पर 4.603 Å के पिक्सेल आकार और ~ 80 e-/ Å2 की कुल खुराक के साथ -5 μm defocus पर एकत्र किया गया था।
  6. टोमोग्राम के पुनर्निर्माण के लिए झुकाव श्रृंखला को संसाधित करें।
    नोट:: यहाँ प्रस्तुत Tomograms IMOD पैकेज27 का उपयोग कर पुनर्निर्मित किए गए थे; Lowpass फ़िल्टरिंग EMAN2 सॉफ़्टवेयर package28 का उपयोग कर किया गया था।

Representative Results

इस प्रक्रिया का उपयोग पूरे सेल क्रायो-ईटी प्रयोगों के लिए ईएम ग्रिड को पैटर्न करने के लिए किया गया था। इस अध्ययन में प्रस्तुत पूरे वर्कफ़्लो, जिसमें प्रारंभिक सेल संस्कृति तैयारी, माइक्रोपैटर्निंग (चित्रा 1), और इमेजिंग शामिल हैं, में 3-7 दिन शामिल हैं। ग्रिड पर पीएलएल लागू करके एंटी-फाउलिंग परत उत्पन्न करने के लिए एक दो-चरणीय प्रक्रिया का उपयोग किया गया था और बाद में प्रतिक्रियाशील पीईजी-एसवीए के अलावा पीईजी को जोड़कर पीईजी को जोड़ा गया था। एंटी-फाउलिंग परत को एक ही चरण में एक इनक्यूबेशन में पीएलएल-जी-पीईजी जोड़कर भी लागू किया जा सकता है। पीएलपीपी जेल यूवी माइक्रोपैटर्निंग के लिए एक उत्प्रेरक है, जो कम केंद्रित तरल के रूप में भी उपलब्ध है। जेल तरल की तुलना में काफी कम खुराक पर पैटर्निंग की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत तेज पैटर्निंग होती है। इस प्रणाली के साथ, एक पूर्ण TEM ग्रिड का वास्तविक पैटर्निंग समय ~ 2 मिनट था। अकेले माइक्रोपैटर्निंग वर्कफ़्लो आमतौर पर 5-6 घंटे तक फैलता है और एक व्यक्ति को टीईएम ग्रिड पर मानक सेल-संस्कृति के लिए आठ ग्रिड पैटर्न करने की अनुमति देता है।

माइक्रोपैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान कई चरणों को लंबे इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता होती है (चरण 2.1, 2.3, 6.4 देखें)। सुविधाजनक रूप से, इनमें से कुछ चरण, जैसे कि पीएलएल passivation (2.1) या PEG-SVA passivation (2.3), को रात भर के इनक्यूबेशन तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ग्रिड को पहले से पैटर्न किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए ईसीएम प्रोटीन या पीबीएस के समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है। हमारे अध्ययन में, ये विकल्प उन उदाहरणों में मूल्यवान थे जहां सेल की तैयारी और सीडिंग का समय महत्वपूर्ण है, जैसे कि प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स और बीईएएस -2 बी कोशिकाओं का आरएसवी-संक्रमण।

ग्रिड को एक सामान्य जैव सुरक्षा-स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला सेटिंग में स्वच्छ उपकरण, बाँझ समाधानों का उपयोग करके तैयार किया गया था, और विकास मीडिया 6,22,29,30 में एंटीबायोटिक्स / एंटीमाइकोटिक्स शामिल थे। विशेष रूप से माइक्रोबियल संदूषण के प्रति संवेदनशील नमूनों के लिए, एंटी-फाउलिंग परत और ईसीएम को ऊतक संस्कृति हुड या अन्य बाँझ वातावरण में लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ग्रिड को पैटर्निंग और ईसीएम एप्लिकेशन के बीच इथेनॉल में धोया जा सकता है। यदि संक्रामक एजेंटों के साथ काम कर रहे हैं, तो उचित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।

इस वर्कफ़्लो और प्रस्तुत प्रक्रियाओं (चित्रा 1) ने HeLa कोशिकाओं (चित्रा 4), RSV-संक्रमित BEAS-2B कोशिकाओं (चित्रा 3, चित्रा 5), और प्राथमिक ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरॉन्स (चित्रा 6, चित्रा 7) को इष्टतम क्रायो-ईटी डेटा संग्रह के लिए पैटर्न वाले ईएम ग्रिड पर सीड करने की अनुमति दी।

HeLa कोशिकाओं micropatterned TEM ग्रिड पर seeded के रूप में एक calcein-AM और ethidium homodimer-1 आधारित सेल व्यवहार्यता परख (चित्रा 4A, बी) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट धुंधला द्वारा निर्धारित रहते हैं. कोलेजन और फाइब्रिनोजेन के मिश्रित ईसीएम का उपयोग करते हुए, हेला कोशिकाएं आसानी से ग्रिड में पैटर्न का पालन करती हैं (चित्रा 4 ए, सी)। पैटर्न के साथ विस्तारित होने वाली कोशिकाओं की समग्र आकृति विज्ञान अनपेक्षित ग्रिड (चित्रा 4 सी, डी) पर उगाई गई कोशिकाओं के समान है। हेला कोशिकाओं के मामले में, कुल सेल मोटाई ~ < 10 μm काफी पतले क्षेत्रों के साथ ~ < सेल परिधि (चित्रा 4E, F) के पास 1 μm मोटी बनी हुई है।

आरएसवी अध्ययनों के लिए, हमने एक ढाल का उपयोग करके पूरे ग्रिड वर्गों को पैटर्न किया, जिसमें किनारों पर कम खुराक जोखिम और केंद्र की ओर एक उच्च खुराक पैटर्न (चित्रा 3 ए) था। ग्रेडिएंट पैटर्न ने कोशिकाओं की परिधि के पास मौजूद जारी वायरस की खोज करते समय बेहतर परिणाम दिए। इन पैटर्नों के साथ, कोशिकाओं को उच्च ईसीएम एकाग्रता का पालन करने के लिए अधिमानतः पाया गया था, लेकिन कम ईसीएम सांद्रता का पालन करने और बढ़ने में भी सक्षम हैं। क्षेत्रों के बीच सापेक्ष खुराक को कई खुराक की आवश्यकता वाले पैटर्न का उपयोग करते समय अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। यदि खुराक और इस प्रकार ईसीएम सांद्रता एक दूसरे के समान या बहुत अलग हैं, तो कई खुराक का उपयोग करने का प्रभाव खो जाएगा।

चित्रा 3 में, एक TEM ग्रिड को पैटर्न किया गया था और बाद में RSV संक्रमित BEAS-2B कोशिकाओं के साथ सीड किया गया था और क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए उपयोग किया गया था। चित्रा 4A ईसीएम की एक फ्लोरोसेंट छवि है जो एक ग्रेडिएंट पैटर्न का उपयोग करके एक टीईएम ग्रिड पर पैटर्न की जाती है। पैटर्न के केंद्रीय क्षेत्र के साथ सेल आसंजन और विकास को चित्रा 3 बी में कोशिकाओं की एक ब्राइटफील्ड छवि के रूप में 18 घंटे के बाद सीडिंग के बाद देखा जा सकता है। चित्रा 3 C में, RSV-A2mK+ की प्रतिकृति से फ्लोरोसेंट सिग्नल (लाल) को ECM से संकेत के साथ ओवरलेड किया जाता है। संक्रमित कोशिकाओं के बहुमत ढाल पैटर्न के उच्च घनत्व केंद्रीय क्षेत्र के साथ तैनात कर रहे हैं। क्रायो-फिक्सेशन के बाद ग्रिड का एक कम-मैग टीईएम मानचित्र कई कोशिकाओं को प्रकट करता है, जिसमें आरएसवी-संक्रमित कोशिकाएं शामिल हैं, जो ग्रिड वर्गों के केंद्र के पास कार्बन पन्नी पर स्थित हैं। जैसा कि पहले मानक TEM ग्रिड 22 पर उगाई गई कोशिकाओं के लिए दिखाया गया था, झुकाव-श्रृंखला स्थित थी और माइक्रोपैटर्न ग्रिड (चित्रा 5A, B) पर उगाए गए संक्रमित BEAS-2B कोशिकाओं की परिधि के करीब निकटता में RSV virions के एकत्र किए गए थे। आरएसवी संरचनात्मक प्रोटीन के कई को टोमोग्राम के भीतर पहचाना जा सकता है जिसमें न्यूक्लियोकैप्सिड (एन) और वायरल संलयन प्रोटीन (एफ) (चित्रा 5 सी, नीले और लाल तीर क्रमशः) शामिल हैं।

प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन अध्ययनों के लिए, यह पाया गया कि सॉफ्टवेयर द्वारा पेश की गई रिज़ॉल्यूशन सीमा के पास संकीर्ण पैटर्न (जहां पैटर्न की मोटाई 2 μm थी), एक से कुछ कोशिकाओं को ग्रिड वर्ग (चित्रा 6) के भीतर अलग करने की अनुमति दी गई थी। न्यूरोनल सोमा पैटर्न के भीतर कई दिनों की अवधि में अपने न्यूराइट्स का विस्तार करने में सक्षम था। इसने बिना पैटर्न वाले ग्रिड (चित्रा 7) पर सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की तुलना में न्यूराइट्स की आसान पहचान और झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण की अनुमति दी। यह भी पाया गया कि फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले कोकानावलिन ए, एक लेक्टिन जिसे इन विट्रो ड्रोसोफिला न्यूरोनल संस्कृतियों के लिए ईसीएम के रूप में उपयोग किया गया है20,21, पैटर्निंग के लिए उपयुक्त है।

तीसरे इंस्टार लार्वा से ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 20,21,31 के अनुसार अलग किया गया था। न्यूरोनल तैयारी को माइक्रोपैटर्न्ड क्रायो-ईएम ग्रिड पर लागू किया गया था जहां सेल प्लेसमेंट, प्रसार और संगठन को विनियमित करने के लिए पैटर्न पर कॉन्कानावलिन ए जमा किया गया था। पैटर्न वाले या अनपैटर्न ग्रिड पर न्यूरॉन्स को कम से कम 48-72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दी गई थी, और ग्रिड को तब जमे हुए डुबकी लगाई गई थी। पैटर्न वाले क्षेत्रों में वितरित कई ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के साथ एक माइक्रोपैटर्नेड ईएम ग्रिड की एक प्रतिनिधि छवि को चित्र 6 ए में दिखाया गया है। ये न्यूरॉन्स, एक ट्रांसजेनिक फ्लाई स्ट्रेन से व्युत्पन्न होते हैं जिसमें झिल्ली में पैन-न्यूरोनल जीएफपी अभिव्यक्ति होती है, न केवल इसके फ्लोरोसेंट लेबलिंग के कारण प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से ट्रैक किया जा सकता है, बल्कि माइक्रोपैटर्न के भीतर इसके स्थान के कारण भी। जबकि unpatterned ग्रिड पर सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7 ए, पीला सर्कल) द्वारा अपने जीएफपी सिग्नलिंग के माध्यम से भी ट्रैक किया जा सकता है, उन्हें क्रायो-ईएम में ढूंढना सेलुलर मलबे की उपस्थिति और मीडिया से संदूषण के कारण काफी अधिक कठिन हो गया (चित्रा 7 बी, पीला सर्कल)। इस तरह की उपस्थिति को पैटर्न वाले ग्रिड पर न्यूरॉन्स के लिए कम किया गया था, संभवतः गैर-पैटर्न वाले क्षेत्रों की एंटी-फाउलिंग परत में पीईजी के कारण सेल मलबे का पालन करने से पीछे हटा दिया गया था। न्यूरॉन सेल शरीर के आयामों और विस्तारित न्यूराइट्स (चित्रा 6 ए, बी, पीला सर्कल) के कारण, क्रायो-ईटी झुकाव श्रृंखला को कोशिकाओं के पतले क्षेत्रों (चित्रा 6 सी, डी, लाल सर्कल) के साथ एकत्र किया गया था। न्यूरोनल सेल झिल्ली, एक माइटोकॉन्ड्रियन (सियान), सूक्ष्मनलिकाएं (बैंगनी), एक्टिन फिलामेंट्स (नीला), वेसिकुलर संरचनाएं (नारंगी और हरा), और राइबोसोम (लाल) जैसे मैक्रोमोलेक्यूल्स को 3 डी टोमोग्राम (चित्रा 6 ई) के माध्यम से उच्च-आवर्धन छवि असेंबल्स और स्लाइस में अच्छी तरह से हल किया गया था। जबकि इसी तरह की उप-सेलुलर विशेषताओं को अवांछित न्यूरॉन्स (चित्रा 7 ई) के 3 डी टोमोग्राम से देखा जा सकता है, डेटा संग्रह के लिए व्यवहार्य सेलुलर लक्ष्यों का पता लगाने में कठिनाई ने थ्रूपुट को काफी कम कर दिया।

चित्रा 8 में, इनमें से कुछ मुद्दों के साथ ग्रिड से प्रतिनिधि छवियों को उनकी पहचान और समस्या निवारण में सहायता करने के लिए इकट्ठा किया गया है। एक बार इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के बाद, माइक्रोपैटर्निंग क्रायो-टीईएम के लिए ग्रिड पर कोशिकाओं की स्थिति के लिए एक विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि है।

Figure 1
चित्रा 1: क्रायो-ईएम के लिए माइक्रोपैटर्निंग का सामान्य वर्कफ़्लो। वर्कफ़्लो को मोटे तौर पर चार भागों में विभाजित किया जा सकता है: ग्रिड तैयारी, माइक्रोपैटर्निंग, ईसीएम और सेल सीडिंग, और क्रायो-तैयारी और डेटा संग्रह। प्रत्येक अनुभाग के प्रमुख चरण शीर्षकों के नीचे सूचीबद्ध हैं और प्रत्येक अनुभाग को पूरा करने का अनुमानित समय बाईं ओर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्रिड पर स्थित पैटर्न के साथ सॉफ्टवेयर की स्क्रीन शॉट. क्षेत्र 1 में पैटर्न डिजाइन के लिए μm/pix अनुपात होता है। क्षेत्र 2 ग्रिड को मापने के लिए शासक है। क्षेत्र 3 वह जगह है जहां पैटर्न और आरओआई को जोड़ना या बदलना है। क्षेत्र 4 में पैटर्न पोजिशनिंग और खुराक के लिए सभी जानकारी शामिल है। क्षेत्र 5 में पैटर्न के लिए विकल्प शामिल हैं, जिसमें ओवरले को टॉगल करना, पैटर्न को कॉपी करना या हटाना और माइक्रोपैटर्निंग के लिए पैटर्न का चयन करना शामिल है। क्षेत्र 6 वह जगह है जहां टेम्पलेट्स को सहेजा और लोड किया जा सकता है। स्पष्टता के लिए नीचे दिए गए क्षेत्रों 4 और 5 के बड़े दृश्य दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पैटर्न वाले क्रायो-टीईएम ग्रिड पर RSV-संक्रमित BEAS-2B कोशिकाएं। (A) फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ECM को जोड़ने के बाद पैटर्न वाले ग्रिड की फ्लोरोसेंट छवि। इनपुट पैटर्न निचले बाएँ कोने में दिखाया गया है। (बी) ए में ग्रिड पर उगाई गई बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की ब्राइटफील्ड छवि (सी) ए (सियान) और बी (ग्रे) में छवि का विलय आरएसवी-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) की फ्लोरोसेंट छवि के साथ डुबकी-ठंड से ठीक पहले; संक्रमित कोशिकाएं mKate-2 को व्यक्त करती हैं। स्केल बार 500 μm हैं। (D) डुबकी-ठंड के बाद B में ग्रिड का कम-आवर्धन क्रायो-TEM मानचित्र। फ्लोरोसेंट छवियों को छद्म रंग दिया जाता है। स्केल बार 500 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पैटर्न और unpatterned कोशिकाओं के लाइव / मृत धुंधला. (ए) हेला कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवि एक पैटर्न ग्रिड पर उगाई जाती है और कैल्सीन-एएम (लाइव सेल दाग, हरा) और एथिडियम होमोडिमर -1 (मृत सेल दाग, लाल) के साथ दागदार होती है। (बी) हेला कोशिकाएं एक अनपैटर्न ग्रिड पर उगाई जाती हैं और ए के रूप में दागदार होती हैं (सी) 0.01 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन और फाइब्रिनोजेन 647 ईसीएम (लाल) के साथ एक पैटर्न वाले क्वांटिफॉइल आर 2 / 2 ग्रिड पर हेला सेल के कॉन्फोकल जेड-स्टैक का प्रक्षेपण। सेल calcein-AM (हरे) और Hoechst-33342 (नीले) के साथ दाग दिया गया था। (डी) 0.01 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन और फाइब्रिनोजेन 647 ईसीएम के साथ इनक्यूबेट किए गए बिना पैटरेड ग्रिड पर हेला कोशिकाएं, कैल्सीन-एएम और होक्सट -33342 के साथ इनक्यूबेट और दागदार। फ्लोरोसेंट छवियों को संचरित प्रकाश (ग्रेस्केल) के साथ विलय कर दिया गया था। (E) C. (F) X का X, Z प्रक्षेपण, D. छवियों का Z प्रक्षेपण छद्म रंग का होता है। (ए) और (बी) में स्केल बार 500 μm हैं; (C) - (F) में स्केल बार 10 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पैटर्न क्रायो-टीईएम ग्रिड पर RSV-संक्रमित BEAS-2B सेल का क्रायो-ET. (A) RSV संक्रमित BEAS-2B सेल का क्रायो-EM ग्रिड वर्ग मानचित्र. अनुमानित सेल सीमा धराशायी हरी रेखा द्वारा इंगित की जाती है। (बी) (ए) में लाल रंग में बॉक्स किए गए क्षेत्र की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवि। अनुमानित सेल सीमा डैश्ड ग्रीन लाइन द्वारा इंगित की जाती है। RSV virions सेल परिधि (सफेद तीर और पीला बॉक्स) के पास देखा जा सकता है। (C) (B) में पीले बॉक्स के क्षेत्र में एकत्र टोमोग्राम से एकल z-स्लाइस. लाल तीर RSV F संलयन प्रोटीन को इंगित करते हैं, नीले तीर राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) परिसर को इंगित करते हैं। (A)-(C) में स्केल बार छवि में एम्बेडेड हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्राथमिक न्यूरॉन्स पैटर्न क्रायो-टीईएम ग्रिड पर तीसरे इंस्टार ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा के दिमाग से व्युत्पन्न। (ए) ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के ओवरलेड लाइव-सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ग्रिड असेंबल 0.5 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरोसेंट कोनकानावलिन ए ग्रीन: ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के साथ पैटर्न वाले ग्रिड वर्गों पर झिल्ली-लक्षित जीएफपी को व्यक्त करते हैं। नीला: Photopattern. (बी) क्रायो-संरक्षण के बाद (ए) में ग्रिड की क्रायो-ईएम छवि असेंबल। पीला वृत्त (ए) के रूप में एक ही ग्रिड वर्ग नोट करता है। (C) (A) और (B) में पीले वृत्त द्वारा हाइलाइट किए गए वर्ग के क्रायो-EM छवि असेंबल. (डी) (सी) में लाल सर्कल से घिरे क्षेत्र की उच्च आवर्धन छवि, जहां सेल के न्यूराइट्स पर एक झुकाव श्रृंखला एकत्र की गई थी। एक टोमोग्राम का 25 एनएम मोटा टुकड़ा झुकाव श्रृंखला से पुनर्निर्मित किया गया था जिसे (सी) में लाल सर्कल से प्राप्त किया गया था। इस टोमोग्राम में विभिन्न ऑर्गेनेल देखे जा सकते हैं, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रिया (सियान), सूक्ष्मनलिकाएं (बैंगनी), घने कोर पुटिकाएं (नारंगी), हल्के पुटिकाएं (हरे), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (पीला), और एक्टिन (नीला)। मैक्रोमोलेक्यूल्स, जैसे राइबोसोम (लाल), ऊपरी दाएं कोने में भी देखे जा सकते हैं। फ्लोरोसेंट छवियों को छद्म रंग दिया जाता है। (A)-(E) में स्केल बार छवि में एम्बेडेड हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्राथमिक न्यूरॉन्स 3 instar ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा के मस्तिष्क से व्युत्पन्न unpatterned ग्रिड पर. (ए) ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लाइव-सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ग्रिड असेंबल 0.5 मिलीग्राम / एमएल कॉन्कानावलिन ए ग्रीन: ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के साथ ग्रिड वर्गों पर झिल्ली-लक्षित जीएफपी को व्यक्त करते हैं। (बी) क्रायो-ईएम ग्रिड असेंबल (ए) में एक ही ग्रिड का डुबकी-ठंड के बाद। पीला वृत्त (A) के समान ग्रिड वर्ग को दर्शाता है. सेलुलर मलबे और मीडिया संदूषण की उपस्थिति पर ध्यान दें, जिसने पैटर्न वाले ग्रिड की तुलना में लक्ष्य की पहचान को मुश्किल बना दिया। (C) (A) और (B) मानचित्रों में पीले वृत्तों द्वारा हाइलाइट किए गए वर्ग की क्रायो-EM छवि असेंबल. (डी) (सी) में लाल सर्कल से घिरे क्षेत्र की उच्च आवर्धन छवि, जहां सेल के न्यूराइट्स पर एक झुकाव श्रृंखला एकत्र की गई थी। (ई) (सी) और (डी) से झुकाव श्रृंखला से पुनर्निर्मित टोमोग्राम का 25 एनएम मोटा टुकड़ा। इस टोमोग्राम में कई ऑर्गेनेल दिखाई देते हैं, जैसे सूक्ष्मनलिकाएं (बैंगनी), एक्टिन (नीला), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (पीला), और घने कोर पुटिकाओं (नारंगी)। मैक्रोमोलेक्यूल्स, जैसे राइबोसोम (लाल), को भी देखा जा सकता है। फ्लोरोसेंट छवियों को छद्म रंग दिया जाता है। (A)-(E) में स्केल बार छवि में एम्बेडेड हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: पैटर्निंग के साथ संभावित समस्याओं के उदाहरण। लेबल ईसीएम की फ्लोरोसेंट छवियों micropatterned ग्रिड पर जमा. (ए) पीएलपीपी जेल के असमान वितरण के कारण ग्रिड में असमान पैटर्निंग। (बी) ईसीएम पैटर्निंग के दौरान पीडीएमएस स्टेंसिल द्वारा कवर किए गए क्षेत्रों का पालन नहीं कर सकता है। (सी) संतृप्त ढाल पैटर्न (दाईं ओर) या उल्टे पैटर्न (बाएं) एक ग्रिड पर बहुत अधिक कुल खुराक के साथ पैटर्न। (घ) ईसीएम पैटर्निंग के दौरान यूवी लेजर के प्रतिबिंबों के कारण ग्रिड बार के क्षेत्रों के साथ-साथ पैटर्न वाले क्षेत्र का पालन कर रहा है। छवियों को छद्म रंग दिया जाता है; इनपुट पैटर्न निचले बाईं ओर दिखाया गया है; स्केल बार 100 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समस्या संभावित कारण (कारण) समस्या निवारण
माइक्रोपैटर्निंग
PRIMO लेजर से रोशनी नहीं देख सकता • प्रकाश पथ सही ढंग से स्थापित नहीं है • जांचें कि माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ ठीक से स्थापित किया गया है
• प्राइमो लेजर पर नहीं है या लेजर interlocked है
कई टूटे हुए ग्रिड वर्गों • चिमटी या पिपेट के साथ ग्रिड पन्नी को छूते हुए हैंडलिंग • देखभाल के साथ ग्रिड संभाल
• ऊष्मायन या धोने के दौरान ग्रिड सूख गया • धोने और ऊष्मायन के दौरान ग्रिड को सूखने की अनुमति न दें
बड़े अनपेक्षित क्षेत्र • अपर्याप्त जेल कवरेज • सुनिश्चित करें कि जेल ग्रिड पर समान रूप से फैलता है जबकि जोड़ने
• पैटर्निंग के दौरान फोकस से बाहर ग्रिड पन्नी • जेल का एक अतिरिक्त माइक्रोलीटर जोड़ें
• स्टेंसिल द्वारा कवर क्षेत्र • प्रत्येक क्षेत्र patterning से पहले ध्यान केंद्रित की जाँच करें
• स्टेंसिल में सावधानीपूर्वक केंद्र ग्रिड
संतृप्त या उलटा पैटर्न • गलत खुराक • पैटर्न के लिए कुल खुराक की एक श्रृंखला का प्रयास करें
• अपर्याप्त जेल कवरेज • सुनिश्चित करें कि ग्रिड समान रूप से जेल के साथ कवर किया गया है
• ग्रेस्केल पैटर्न के लिए विभिन्न मूल्यों का प्रयास करें
धुंधला पैटर्न • पैटर्निंग के दौरान खराब ध्यान केंद्रित • दोहराएँ प्राइमो अंशांकन नमूना के रूप में एक ही ऊंचाई पर
• गलत अंशांकन • पैटर्निंग से पहले ग्रिड पन्नी पर ध्यान केंद्रित
• पैटर्निंग के लिए अतिरिक्त क्षेत्रों में पैटर्न को विभाजित करें
ईसीएम पैटर्न के बाहर का पालन • जेल या धूल से प्रतिबिंब • सुनिश्चित करें कि पैटर्निंग से पहले जेल सूखा है
• सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप और उद्देश्य लेंस साफ हैं
ईसीएम पैटर्निंग के बाद दिखाई नहीं दे रहा है • फोटो विरंजन • इमेजिंग से पहले ईसीएम के लिए प्रकाश जोखिम को कम से कम करें
• पैटर्निंग के दौरान गलत खुराक • पैटर्न के लिए कुल खुराक मूल्यों की एक श्रृंखला का प्रयास करें
• समय इनक्यूबेशन अपर्याप्त ईसीएम • ईसीएम के लिए इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं
सेल सीडिंग
कोशिकाएँ clumping • अधिक पाचन • अनुवर्ती कोशिकाओं की रिहाई के लिए ट्रिप्सिन या समय के कम प्रतिशत का उपयोग करें
• उच्च सेल घनत्व • पैसेज और / या कम confluency पर कोशिकाओं को पचाने
• रिलीज के दौरान कोशिकाओं को उत्तेजित न करें
• धीरे से पिपेट सेल समाधान या सेल छलनी का उपयोग करें
पैटर्न वाले क्षेत्रों का पालन नहीं करने वाली कोशिकाएं • ईसीएम सेल प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं है • विभिन्न ईसीएम सांद्रता और संरचना का प्रयास करें
• सीडिंग से पहले कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो जाती है • सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति और सेल रिलीज की स्थिति कोशिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचा रही है
आसंजन के बाद विस्तार नहीं हो रही कोशिकाएं • ईसीएम या पैटर्न सेल प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं है • विभिन्न पैटर्न और ईसीएम की कोशिश करो
• कुछ मामलों में एक अधिक निरंतर पन्नी (R1.2/20 बनाम R2/1) सेल विस्तार को बढ़ावा दे सकता है

तालिका 1: माइक्रोपैटर्निंग के दौरान संभावित मुद्दे। यह तालिका कुछ समस्याओं का वर्णन करती है जो उपयोगकर्ता माइक्रोपैटर्निंग या सेल-सीडिंग के दौरान अनुभव कर सकता है। संभावित कारण और समस्या निवारण प्रत्येक समस्या के लिए प्रदान किए जाते हैं। कुछ समस्याओं की प्रतिनिधि छवियों को चित्र 8 में देखा जा सकता है।

Discussion

आधुनिक, उन्नत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर पैकेज अब सुव्यवस्थित स्वचालित क्रायो-ईएम और क्रायो-ईटी डेटा संग्रह का समर्थन करते हैं जहां सैकड़ों से हजारों पदों को लक्षित किया जा सकता है और कुछ दिनों के भीतर चित्रित किया जा सकता है32,33,34,35। पूरे सेल क्रायो-ईटी वर्कफ़्लो के लिए एक महत्वपूर्ण सीमित कारक प्रति ग्रिड संग्रहणीय लक्ष्यों की पर्याप्त संख्या प्राप्त कर रहा है। हाल ही में, कई समूहों ने क्रायो-ईएम के लिए माइक्रोपैटर्निंग ग्रिड के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं, जिसमें एक लाभ में सुधार डेटा संग्रह दक्षता 16,17,18 है। यहां प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स और सुसंस्कृत मानव सेल लाइनों (असंक्रमित या आरएसवी-संक्रमित) के क्रायो-ईटी अध्ययन के लिए माइक्रोपैटर्न टीईएम ग्रिड के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह micropatterning प्रणाली बहुमुखी है और कई चरणों को अनुकूलित किया जा सकता है और विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों को फिट करने के लिए सिलवाया जा सकता है। TEM और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अनुभव के साथ एक उपयोगकर्ता जल्दी से ग्रिड तैयारी और micropatterning में कुशल हो सकता है। सावधानीपूर्वक अभ्यास के साथ, कुछ पुनरावृत्तियों के बाद अच्छे परिणाम प्राप्त करने योग्य होने चाहिए। नीचे, उपलब्ध विकल्पों में से कुछ, उपयोगकर्ता विचार, संभावित लाभ, और क्रायो-ईएम के लिए माइक्रोपैटर्निंग के भविष्य के अनुप्रयोगों पर चर्चा की गई है।

पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए महत्वपूर्ण विचारों में से एक ईएम ग्रिड चयन है। ईएम ग्रिड दो भागों से बने होते हैं: एक जाल फ्रेम (या संरचनात्मक समर्थन) और पन्नी (या फिल्म), जो निरंतर या छेदी फिल्म सतह है जिस पर कोशिकाएं बढ़ेंगी। कॉपर मेश ग्रिड का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन और पृथक परिसरों के क्रायो-ईएम के लिए किया जाता है। हालांकि, वे तांबे की साइटोटॉक्सिसिटी के कारण पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए अनुपयुक्त हैं। इसके बजाय, एक सोने की जाली आमतौर पर सेलुलर टोमोग्राफी के लिए उपयोग की जाती है। अन्य विकल्पों में निकल या टाइटेनियम शामिल हैं, जो सोने पर लाभ प्रदान कर सकते हैं जैसे कि बढ़ी हुई कठोरता 16। ईएम ग्रिड अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला का समर्थन करने के लिए विभिन्न जाल आयामों के साथ उपलब्ध हैं। बड़े जाल आकार ग्रिड सलाखों और अधिक क्षेत्रों के बीच बढ़ने के लिए कोशिकाओं के लिए अधिक जगह प्रदान करते हैं जो झुकाव श्रृंखला संग्रह के लिए उपयुक्त हैं, हालांकि समग्र नमूना नाजुकता में वृद्धि की कीमत पर। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली पन्नी छिद्रित या छेद अनाकार कार्बन है, जैसे कि क्वांटिफोल या सी-फ्लैट ग्रिड। जैविक लक्ष्यों को कार्बन में छेद के माध्यम से या इलेक्ट्रॉन-पारभासी कार्बन के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है। R 2/1 या R 2/2 जैसे ग्रिड, जहां छेद 2 μm चौड़े होते हैं जो क्रमशः 1 और 2 μm के अलावा होते हैं, बड़ी संख्या में छेद प्रदान करते हैं और इस प्रकार डेटा संग्रह के लिए बड़ी संख्या में संभावित क्षेत्र प्रदान करते हैं। हालांकि, कुछ कोशिकाएं आर 1.2/20 ग्रिड या निरंतर कार्बन जैसी अधिक समान सतहों पर बेहतर तरीके से बढ़ सकती हैं और विस्तार कर सकती हैं। केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) द्वारा डाउनस्ट्रीम नमूना प्रसंस्करण के लिए, पन्नी को मिलिंग के माध्यम से हटा दिया जाता है, जिससे अंतर्निहित फिल्म की निरंतर उपस्थिति पर चिंताओं को कम किया जाता है। जाल के साथ के रूप में, अन्य सामग्रियों से पन्नियों भी उपलब्ध हैं, यहां प्रस्तुत पैटर्निंग प्रोटोकॉल के साथ SiO2 ग्रिड के लिए समान रूप से उपयुक्त है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ग्रिड में पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए सोने के क्वांटिफोइल, निरंतर कार्बन, या SiO2 फिल्म 200-मेष ग्रिड (~ ग्रिड सलाखों के बीच 90 μm रिक्ति) शामिल हैं।

एक पैटर्न डिजाइन करते समय कई विचार हैं। इनमें से अधिकांश निर्णय प्रयोग के सेल प्रकार और उद्देश्य द्वारा निर्देशित होते हैं। एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक पैटर्न चुनना है जो संस्कृति में कोशिकाओं के आकार और आयामों का अनुमान लगाता है। कई अध्ययनों ने सेल विकास और साइटोस्केलेटल व्यवस्था 13,36,37 पर पैटर्न आकार के महत्वपूर्ण प्रभावों का प्रदर्शन किया है। पैटर्न डिजाइन के दौरान विशेष देखभाल की जानी चाहिए यदि यह ब्याज के लक्ष्य को बदल सकता है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए कई पैटर्न का परीक्षण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि कौन से पैटर्न सेलुलर आसंजन और विकास को बढ़ावा देते हैं। माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम का लचीलापन एक एकल ग्रिड पर कई पैटर्न के परीक्षण और एक ही प्रयोग के भीतर विभिन्न ग्रिड के लिए पैटर्न बदलने की अनुमति देता है। बड़े पैटर्न (~ 50-90 μm), जैसे कि यहां उपयोग किए जाने वाले, इस संभावना को बढ़ाते हैं कि कई कोशिकाएं पैटर्न के एक ही क्षेत्र का पालन करती हैं और आसंजन के बाद कोशिकाओं को विस्तारित करने और विस्तारित करने की अनुमति देती हैं। अधिक विवश पैटर्न (20-30 μm) प्रयोगों में उपयुक्त हो सकते हैं जहां सेल अलगाव सेल विस्तार की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है, जैसे कि केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) प्रयोगों के लिए। टोमोग्राफी अनुप्रयोगों के लिए, किसी को झुकाव-अक्ष के प्रभाव पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि एक पैटर्न को इस तरह से तैनात किया जाता है कि सभी कोशिकाएं एक ही दिशा में एक दूसरे के समानांतर बढ़ती हैं, तो यह संभव है कि माइक्रोस्कोप चरण पर लोड होने पर सभी कोशिकाएं झुकाव-अक्ष के लंबवत होंगी, जिसके परिणामस्वरूप डेटा की गुणवत्ता कम होगी।

अनपैटर्न किए गए ग्रिड पर, कोशिकाएं अक्सर ग्रिड सलाखों का पालन करती हैं, जहां उन्हें टीईएम द्वारा चित्रित नहीं किया जा सकता है। यहां तक कि पैटर्न वाले ग्रिड पर भी, कोशिकाओं को अक्सर ग्रिड वर्गों के कोनों में आंशिक रूप से पैटर्न वाले कार्बन पन्नी और ग्रिड बार दोनों पर तैनात किया जाता है। हाल ही में, माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग जानबूझकर ग्रिड बार 18 पर सेल के हिस्से को स्थिति में रखने के लिए किया गया था। यह प्रयोगों के लिए माना जा सकता है जहां पन्नी पर पूरे सेल परिधि होना महत्वपूर्ण नहीं है। यह उन कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जो एक ग्रिड वर्ग से बड़े हो सकते हैं, जैसे कि प्राथमिक न्यूरॉन्स कई दिनों में बढ़ते हैं।

ऐसे कई उपकरण हैं जिनका उपयोग पैटर्न डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, पैटर्न किसी भी आयाम में 800 पिक्सेल से कम तक सीमित था जैसे कि पैटर्न को किसी भी कोण पर घुमाया जा सकता है और अभी भी अधिकतम क्षेत्र के भीतर फिट किया जा सकता है जो इस माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम द्वारा एकल प्रक्षेपण में पैटर्न कर सकता है। यह उपयोगकर्ता को माइक्रोस्कोप पर ग्रिड के अभिविन्यास की परवाह किए बिना ग्रिड के साथ ठीक से उन्मुख होने के लिए पैटर्न को घुमाने की अनुमति देता है। यहां, ग्रिड को छह पैटर्निंग क्षेत्रों में विभाजित किया गया था। मुख्य रूप से, यह ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों के बीच फोकस समायोजन की अनुमति देता है। गोल्ड ग्रिड, विशेष रूप से, बहुत निंदनीय हैं और ग्लास पर पूरी तरह से फ्लैट नहीं हो सकते हैं। साफ, परिष्कृत पैटर्निंग परिणामों के लिए उचित फोकस आवश्यक है। खंडित पैटर्न का उपयोग करके, पैटर्न की स्थिति में केवल मामूली समायोजन करने की आवश्यकता होती है यदि ग्रिड पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान थोड़ा बदल जाता है, हालांकि पीडीएमएस स्टेंसिल के साथ पीएलपीपी जेल का उपयोग करते समय यह आमतौर पर एक मुद्दा नहीं है। अंत में, ग्रिड के केंद्रीय चार ग्रिड वर्गों unpatterned रहे। यह एक उपयोगकर्ता को ग्रिड के केंद्र को स्पष्ट रूप से पहचानने में सक्षम होने का समर्थन करता है, जो कोरिलेटिव-इमेजिंग प्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी है।

इस माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम, लियोनार्डो के लिए पैटर्निंग सॉफ्टवेयर में सिलाई और पीडीएफ के रूप में पैटर्न आयात करने की क्षमता जैसी अधिक उन्नत विशेषताएं भी हैं, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे हैं। इस सॉफ़्टवेयर में microstructure का पता लगाने और स्वचालित पैटर्न पोजिशनिंग भी शामिल है जिसका उपयोग TEM ग्रिड पर किया जा सकता है। यह सुविधा सबसे उपयोगी है जब ग्रिड बहुत सपाट है और विभिन्न क्षेत्रों के बीच ध्यान समायोजित करने की आवश्यकता के बिना पैटर्न किया जा सकता है।

एक ईसीएम प्रोटीन के चयन का सेल आसंजन और विस्तार पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। कुछ कोशिकाओं को शारीरिक परिवर्तनों से गुजरने के लिए जाना जाता है जब विशिष्ट सब्सट्रेट्स 38 पर उगाया जाता है। साहित्य में रिपोर्ट किए गए पूर्व कार्य के आधार पर किसी भी नए सेल प्रकार के लिए एकाधिक ईसीएम प्रोटीन और सांद्रता का परीक्षण किया गया था। लैमिनिन, फाइब्रिनोजेन, फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन व्यापक रूप से सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाते हैं और यदि अन्य डेटा उपलब्ध नहीं है तो इसे प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, अन्य ईसीएम प्रोटीन पर भी विचार किया जाना चाहिए यदि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ईसीएम प्रोटीन कोशिकाओं के लिए उचित अनुपालन गुण प्रदान करने में विफल रहते हैं। यह प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से सच था, क्योंकि उचित सेलुलर पालन के लिए पौधे के लेक्टिन कोकानावलिन ए की उच्च सांद्रता आवश्यक थी। ईसीएम के साथ सेलुलर आसंजन और विकास की संगतता का परीक्षण टीईएम ग्रिड में संक्रमण से पहले ग्लास डिश या स्लाइड पर पैटर्निंग द्वारा किया जा सकता है। यह पूर्व-स्क्रीनिंग दृष्टिकोण समय और लागत प्रभावी है यदि बड़ी संख्या में संयोजनों की जांच करने की आवश्यकता है। एक फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित ईसीएम प्रोटीन का समावेश पैटर्निंग की सफलता और गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मूल्यवान है।

सेल सीडिंग पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, या तो माइक्रोपैटर्निंग 6,16,39 के साथ या बिना। प्राथमिक ड्रोसोफिला या अन्य न्यूरॉन्स के लिए, जो नाजुक हैं, निलंबन में अस्थिर हैं, और मात्रा में सीमित हो सकते हैं, एकल सीडिंग दृष्टिकोण को मॉनिटर, अनुक्रमिक सेल सीडिंग पर पसंद किया जाता है। एक अनुकूलित सेल घनत्व पर एक एकल सीडिंग चरण, जैसा कि ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है, अधिकांश सेल प्रकारों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है। हालांकि, कम प्रारंभिक एकाग्रता पर सब्सट्रेट पर कोशिकाओं को बीज करना और यहां और अन्य साहित्य 18 में वर्णित के रूप में एक निगरानी फैशन में अधिक कोशिकाओं को जोड़ना भी संभव है। यह अनुक्रमिक सीडिंग कुछ मामलों में अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान कर सकती है। मानक सेल संस्कृति के समान, सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और अलगाव के दौरान सेल क्लम्पिंग को कम करने के लिए हमेशा देखभाल की जानी चाहिए।

जब पहली बार माइक्रोपैटर्निंग के साथ शुरू होता है, तो कुछ संभावित नुकसान होते हैं जो अंतिम परिणाम के लिए हानिकारक होते हैं। सावधानीपूर्वक ग्रिड हैंडलिंग और बाँझ तकनीक, PLPP जेल का एक समान वितरण, पैटर्निंग के दौरान उचित खुराक और ध्यान केंद्रित करना, और सीडिंग से पहले सेल व्यवहार्यता का रखरखाव सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक है। कुछ संभावित मुद्दों के साथ-साथ समाधानों की एक सूची तालिका 1 में एकत्र की गई थी।

माइक्रोपैटर्न्ड ग्रिड का उपयोग ग्रिड में एक सुसंगत सेल घनत्व स्थापित करने के लिए कोशिकाओं की स्थिति में मदद करने के लिए और झुकाव-श्रृंखला संग्रह 16,18 के लिए उपयुक्त क्षेत्रों में रुचि के क्षेत्रों की स्थिति में मदद करने के लिए किया जा सकता है। कोशिकाओं के प्लेसमेंट और स्थिति का उपयोग क्रायो-सीएलईएम प्रयोगों में सहसंबंध के लिए फिड्यूशियल मार्करों के रूप में किया जा सकता है, जिससे नाजुक खोजक-ग्रिड और फ्लोरोसेंट फिड्यूशियल मार्करों की आवश्यकता कम हो जाती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के fiducial मार्कर अभी भी उप-माइक्रोमीटर सटीकता सहसंबंध 29,40 के लिए उपयोगी हो सकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग कोशिकाओं का एक समान वितरण भी केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) प्रयोगों के लिए अत्यधिक फायदेमंद है ताकि कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम किया जा सके, जिसमें से लामेला को काटा जा सकता है।

क्रायो-ईएम वर्कफ़्लोज़ में माइक्रोपैटर्निंग के अतिरिक्त डेटा थ्रूपुट में औसत दर्जे के सुधार के परिणामस्वरूप और संभावित रूप से नए प्रयोगों को सक्षम किया जाएगा। जैसा कि तकनीक को आगे अपनाया और विकसित किया गया है, ईसीएम ग्रेडिएंट, कई ईसीएम जमाव, और माइक्रोस्ट्रक्चर असेंबली सहित माइक्रोपैटर्निंग के अधिक उन्नत अनुप्रयोग पूर्ण सेलुलर संदर्भ में जैविक लक्ष्यों और प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए क्रायो-ईटी की क्षमताओं का विस्तार करेंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ जिल Wildonger, डॉ Sihui Z. यांग, और श्रीमती जोसेफिन डब्ल्यू मिशेल जैव रसायन विभाग में धन्यवाद, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन उदारता से elav-Gal4, UAS-CD8 साझा करने के लिए: GFP मक्खी तनाव (Bloomington स्टॉक सेंटर, # 5146). हम इस परियोजना के दौरान अपने उदार समर्थन के लिए डॉ Aurélien Duboin, श्री लॉरेंट Siquier, और सुश्री मैरी-शार्लोट मानुस Alvéole से और श्री सर्गे Kaddoura Nanoscale लैब्स से धन्यवाद करना चाहते हैं। इस काम को विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन में जैव रसायन विभाग द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, और U24 GM139168 को E.R.W. और R01 AI150475 को P.W.S. NIH से। इस शोध का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान U24 GM129547 द्वारा समर्थित था और OHSU में PNCC में प्रदर्शन किया गया था और EMSL (grid.436923.9) के माध्यम से एक्सेस किया गया था, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान कार्यालय द्वारा प्रायोजित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक डीओई कार्यालय। हम विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन में जैव रसायन विभाग में क्रायो-ईएम रिसर्च सेंटर में सुविधाओं और इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग के लिए भी आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane Genesee 25-240
22x60-1 Glass cover slip Fisher 12545F
5/15 Tweezers EMS (Dumont) 0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher (Gibco) 15240096
BEAS-2B cells ATCC CRL-9609
Collagen I, bovine ThermoFisher (Gibco) A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) C11254
DMEM Fisher (Lonza) BW12-604F
EtOH Fisher (Decon Labs) 22-032-600
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher (Gibco) 33010018
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C
Glucose VWR 0643-1KG
Grid prep holder EMS 71175-01
HeLa cells ATCC CCL-2
Hemacytometer Fisher (SKC, Inc.) 22600100
HEPES Fisher (ACROS Organics) AC172572500
Hoechst 33342 ThermoFisher (Invitrogen) H3570
Insulin Fisher (Sigma Aldrich) NC0520015
KCl MP Bio 194844
KH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC212595000
Leica-DMi8 Leica Microsystems Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade Fisher (Supply Solutions) 50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit ThermoFisher (Invitrogen) L3224
Microscope camera Hammamatsu C13440-20CU
Motorized stage Märzhäuser Wetzlar 00-24-599-0000
NaCl Fisher (Fisher BioReagents) BP358-1
NaH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC207802500
NaOH Fisher (Alfa Aesar) AAA1603736
PBS Corning 21-040-CV
PDMS stencils nanoscaleLABS PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA nanoscaleLABS PEG-SVA-1GR mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin Fisher (Research Products International Corp) 50-213-641
pH strips Fisher (Millipore Sigma) M1095350001 pH probe can also be used
PLPP gel nanoscaleLABS PLPP-GEL-300UL https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) BEI Resources NR-36460 https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids EMS (Quantifoil) Q2100AR1 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI Fisher (Lonza) BW12-702F
RSV A2-mK+ see entry for pSynkRSV-19F - Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media ThermoFisher (Gibco) 21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers EMS (Dumont) 72812-D
Streptomycin Fisher (Fisher BioReagents) BP910-50
Sucrose Avantor 4097-04
Tetracycline Sigma T8032-10MG
Titan Krios electron microscope ThermoFisher 300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin ThermoFisher (Gibco) 15090046
Tube Revolver/Rotator Fisher (Thermo Scientific) 11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain Bloomington Drosophila Stock Center 5146 http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html

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References

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Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए
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Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows. J. Vis. Exp. (175), e62992, doi:10.3791/62992 (2021).

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