Summary
このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。
Abstract
全細胞クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、細胞内に存在する高分子のナノメートルレベルの分解能構造を生成するために使用され、ほぼネイティブの凍結水和状態で保存される強力な技術です。しかし、細胞を生理学的状態に保ちながら断層撮影に適した方法でTEMグリッド上に細胞を培養および/または付着させることに関連する課題があります。ここでは、TEMグリッド上で真核細胞増殖を指示し、促進するためのマイクロパターニングの使用に関する詳細なステップバイステップのプロトコルが提示されています。マイクロパターニング中、細胞増殖は、TEMグリッドの箔上の指定されたパターンおよび位置内に細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を堆積させることによって指示され、他の領域は反汚れ層でコーティングされたままである。表面コーティングとパターン設計の選択の柔軟性は、マイクロパターニングが幅広い種類の細胞に広く適用可能です。マイクロパターニングは、個々の細胞内の構造の研究だけでなく、宿主と病原体の相互作用や分化された多細胞群などのより複雑な実験システムの研究に役立ちます。また、コマンス光と電子顕微鏡(cryo-CLEM)や集光イオンビームミリング(cryo-FIB)など、多くの下流全細胞クライオETワークフローにマイクロパターニングが組み込まれています。
Introduction
クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の開発、拡大、汎用性により、研究者は高分子(〜1nm)から高(〜2 Å)分解能に近いネイティブ状態の広範な生物学的サンプルを調べました。単粒子クライオEMと電子回折技術は、溶液中または結晶状態の精製された高分子にそれぞれ1,2を適用するのが最善です。一方、クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、細菌、多形性ウイルス、真核細胞などの大きな異種性の物体の近く天然の構造および超構造研究に独特に適しています3。cryo-ETでは、顕微鏡ステージ上でサンプルを物理的に傾け、サンプルを異なる角度で一連の画像を取得することで、3次元(3D)情報が得られます。これらの画像、またはチルトシリーズは、多くの場合、1〜3度の増分で+60/-60度の範囲をカバーしています。その後、チルトシリーズを計算的に3Dボリューム(トモグラム4とも呼ばれる)に再構築することができます。
すべてのクライオEM技術は、サンプルが非結晶性の氷の薄い層に埋め込まれる必要があります。最も一般的に使用される凍結固定技術の1つは、サンプルがEMグリッドに適用され、吸引され、液体エタンまたは液体エタンとプロパンの混合物に急速に突っ込むプランジ凍結である。この技術は、培養したヒト細胞を含む<100nmから~10μmの厚さのサンプルのガラス化に十分であり、例えばHeLa cells5,6のような培養ヒト細胞を含む。厚さ200μmまでの小オルガノイドや組織生検などの厚いサンプルは、高圧凍結によってガラス化することができます7。しかし、より厚い試料の電子散乱が増加したため、クライオETのサンプルおよび氷の厚さは、300kV透過電子顕微鏡において〜0.5〜1μmに制限されています。したがって、多くの真核細胞の全細胞クライオETは、凍結切片8や集光イオンビームミリング9,10,11などの追加のサンプル調製ステップが使用されない限り、細胞周辺または細胞の拡張に限定される。
多くの全細胞クライオETイメージング実験の制限は、データ収集スループット12である。1つのTEMグリッドの正方形から何千もの単粒子を画像化することが多い単粒子クライオEMとは異なり、細胞は大きく広がり、細胞が薄い層の氷の中に保存されるように十分な低密度で成長しなければならない。多くの場合、関心領域は、セルの特定の特徴またはサブエリアに限定されます。スループットをさらに制限することは、TEM グリッド バーの上または近くなど、TEM イメージングに適さない領域でセルが成長する傾向にあります。TEM グリッド上の細胞培養に関連する予測できない要因により、データ取得のサンプルのアクセシビリティとスループットを向上させるためには、技術開発が必要です。
接着性細胞外マトリックス(ECM)タンパク質による基質顕微鏡は、ガラスおよび他の組織培養基質などの硬質、耐久性、光学的に透明な表面上の細胞の成長を指示する生細胞光顕微鏡法のための確立された技術です13,14。マイクロパターン化は、ソフトまたは 3 次元(3D)サーフェスでも実行されています。このような技術は、細胞の正確な位置を可能にしただけではありません。また、パターン化された神経細胞回路15などの多細胞ネットワークの構築もサポートしています。マイクロパターニングをcryo-ETに持ち込むことは、スループットを向上させるだけでなく、複雑で動的な細胞マイクロ環境を探索するための新しい研究を開くことができます。
最近、複数のアプローチを通じて、TEMグリッド上でマイクロパターン化技術を使用するグループがいくつかある16,17。ここでは、TEMグリッド用のマスクレスフォトパターニング技術の使用について、高解像度で非接触パターンを特徴とするAlvéole PRIMOマイクロパターニングシステムを用いて説明します。このマイクロパターニングシステムでは、反ファリング層が基板の上部に塗布され、続いて光触媒の適用とUVレーザーを用いたユーザ定義パターンにおける防汚層のアブレーションが行われます。次いで、ECMタンパク質を適切な細胞培養のためのパターンに添加することができる。この方法は、網膜色素上皮-1(RPE1)、マディン・ダービー・イヌ腎臓II(MDCKII)、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、および内皮細胞株16,17,18のクライオ-ET研究のためにいくつかのグループで使用されてきた。このマイクロパターニングシステムは、液体またはゲル光触媒試薬と同様に、複数の反ファリング層の基質と互換性があります。さまざまなECMタンパク質を細胞株の特異性に合わせて選択し、適合させることができ、ユーザに汎用性を与える。
マイクロパターン化は、実験室19内の多数のプロジェクトにうまく適用されている。ここでは、培養HeLa細胞、呼吸間胞ウイルス(RSV)感染したBEAS-2B細胞、および原発性幼虫 ショウジョウバエメラノガスター ニューロン20を研究するための特異的な適応を含むマイクロパターン化プロトコルが提示される。
Protocol
ここで説明するプロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校のライトラボとクライオEM研究センターで使用される細胞培養、マイクロパターニング、イメージング方法のコンパイルです。ワークフローは図 1 に示されています。その他のトレーニングおよび指導教材は、https://wrightlab.wisc.edu https://cryoem.wisc.edu 次のサイトで入手できます。
1. パターニング用グリッドの作成
- TEMグリッドをクリーンなガラススライドに移し、カーボンサイドアップ(カーボン箔の標準厚さは12nm)します。炭素蒸発器ACE600を使用して、5~8nmの追加炭素をグリッド上に蒸発させ、カーボンフィルムの耐久性を全体的に向上させます。
注: このステップは SiO2 グリッドには必要ありません。この手順は、事前に行うこともできます。真空デシケータなどの低湿度環境でコーティングされたグリッドを保管してください。 - グリッドをグリッド準備ホルダーに移し、グリッドのカーボンサイドをグロー放電します。グロー放電システムを使用して、グロー放電は、80 mmの作動距離と1.0 x 10-3 mbarの真空圧で10 mAで60 sのグリッドを排出します。次のステップから15~30分以内に行います。
注:グリッドの準備ホルダーは、商業的に購入したり、小さなペトリ皿にフィルターペーパーの一部で自家製することができます。
2. 反汚れ層の適用
注:適切な滅菌技術は、グリッドを扱うときに使用する必要があり、すべてのソリューションは滅菌および/またはフィルタ滅菌する必要があります。
- グリッド(カーボンサイドアップ)を、グリッド間の分離を少なくとも1cmで、きれいなガラススライドまたはカバースリップに移します。ピペット10 μLの0.05%ポリL-リジン(PLL)を各グリッドに取り付けます。湿ったペーパータオルで囲まれたプラスチック製の箱など、湿った部屋にグリッドを少なくとも30分間インキュベートします。
注: この手順は夜間に拡張できます。チャンバーの湿度レベルは、グリッドが乾燥するのを防ぐために十分であることを確認してください。 - 0.1 M HEPES pH 8.5の15 μLで各グリッドを3回洗浄します。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなく、ピペットでグリッドから液体のほとんどを取り除きます。15 μLの新鮮なバッファーを加え、少なくとも 30 秒分インキュベートして繰り返します。最終洗浄後、各グリッドを0.1 M HEPESの15 μLに残します。
注: この手順と今後の手順では、グリッドを濡に保ち、ピペットとグリッドの間の接触を避けることが重要です。 - 100 mg/mL ポリエチレングリコール-コシニミジル(PEG-SVA)を0.1 M HEPES pH 8.5で各グリッドに10μL調製します。PEG-SVAは、穏やかな混合ですぐに溶解し、明確な溶液をもたらします。
注: PEG-SVA ソリューションを事前に準備しないでください。PEG-SVAは、pH 8.5で10分の半減期を有する。ペグ-SVAストックを-20°Cの乾燥環境に保管し、開封前に室温に温めることで、過度の水分にさらすことを避けてください。 - PEG-SVA溶液を準備した直後に、各グリッドからHEPES pH 8.5の15μLドロップを取り除き(グリッドを乾燥させないように注意して)、PEG-SVA溶液の10 μLドロップを追加します。少なくとも1時間湿度の高いチャンバーにグリッドをインキュベートします。
注: この手順は夜間に拡張できます。チャンバーの湿度が十分であり、グリッドが乾燥するのを防ぎます。 - 各グリッドを15μLの無菌水で3回洗います。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなく、ピペットでグリッドから液体の大部分を取り出し、15 μLの淡水を加え、少なくとも30秒インキュベートして繰り返します。最終洗浄後、各グリッドを15μLの水に入れておきます。
3. PLPPゲルの塗布
- 各グリッドにクリーンな顕微鏡カバースリップを用意します。グリッドが乾燥する可能性を最小限に抑えるために、グリッドごとに一度に 1 つのグリッドに対して次の手順を実行します。
- カバースリップの中央に1.0 μLの水滴を置くと、カバースリップの上にグリッドを配置し、グリッドを濡らします。15 μLの水滴からカバースリップの1.0 μLの水滴に慎重にグリッドを移します。グリッドカーボン側を上に置くようにしてください。
- グリッドの中央に保ち、グリッドのカーボンフォイルとのステンシル接触を最小限に抑えるように注意して、グリッドの上にポリジメチルシロキサン(PDMS)ステンシルを慎重に配置します。
- 4-ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)ゲルの1.0 μLをグリッドに加えます。ピペットを軽く混ぜ合わせます(ピペットチップでグリッドに触れないでください)。
- グリッド付きのカバースリップを暗い場所に移動して乾燥させます。ゲルは約15〜30分で乾燥します。
4. マイクロパターンの較正と設計
- ガラスカバースリップの片側に蛍光ペンを塗ります。細かい先端のパーマネントマーカーから黒い線を追加して、焦点を合わせやすくします。色付きの側が対物レンズに面するような顕微鏡の上にカバースリップを置きます。明視野モードを使用して、蛍光ペンに焦点を当てます。
- 顕微鏡とマイクロパターニングシステムの電源が入っており、正しい光路が設定されていることを確認します。マイクロマネージャーとレオナルドソフトウェア(レオナルド>プラグイン)を顕微鏡コンピュータで開きます。
- [調整]を選択し、画面の指示に従います。スライドに投影された画像が焦点になるように、顕微鏡の焦点を調整します。露光時間を短縮する必要があります。キャリブレーション後、[ 今すぐパターン]を選択します。
- プログラムの左上のウィンドウで、キャリブレーションデータで報告されたマイクロメートル/ピクセル(μm/px)比を記録します(図2、エリア1)。この比率を使用して、パターンを設計する際に 1 マイクロメートル当たりのピクセル数を決定します。
- キャリブレーション後、ソフトウェアがマイクロスコープからのライブ明視野で開かれていることを確認します。準備したグリッドをカバースリップ(セクション3)にロードし、グリッドを対物レンズに向けてステージに置きます。ステージを配置し、ソフトウェア ウィンドウにグリッドが表示されるようにフォーカスを調整します。
- グリッドの正方形とグリッド バーのサイズをマイクロメートル単位で測定します。ソフトウェアには、グリッドを測定するために左下隅付近のボタンでアクティブにされた定規が含まれています(図2、領域2)。たとえば、200 メッシュグリッドに使用されるパターンは、87 μm のグリッド正方形と約 36 μm のグリッドバー× 87 に対応します。
注:ソフトウェアは、その場でパターンのサイズを変更する柔軟性を提供するので、測定のわずかな不正確さを許容することができます。 - 上記の測定と比率に基づいて、任意のイメージ作成ソフトウェアでパターンを作成します。20×の目標を持つ最小特徴サイズは1.2 μmです。パターンは、非圧縮の8ビット.tiffファイルとして保存する必要があります。
- 保存時に、イメージが別のピクセルサイズに再スケールされないようにします。パターンは、4 つのグリッド正方形をカバーするのに十分な 800 × 800 ピクセルのボックス内に収まる必要があります。
注: 値が 255 (白) のピクセルは、最大強度 (レーザーの総線量) でパターン化され、ゼロ (黒) の値を持つピクセルはパターン化されません。中間値を持つピクセルは、およそ(X/255)*合計線量の線量でパターン化されます。 図3Aでは、グレースケールパターンに255と129のピクセル値が使用されました。パターンが設計されると、変更せずに保存して再利用することができます。
- 保存時に、イメージが別のピクセルサイズに再スケールされないようにします。パターンは、4 つのグリッド正方形をカバーするのに十分な 800 × 800 ピクセルのボックス内に収まる必要があります。
5. マイクロパターン
- キャリブレーション後、ソフトウェアがマイクロスコープからのライブ明視野で開かれていることを確認します。準備したグリッドをカバースリップ(セクション3)にロードし、グリッドを対物レンズに向けてステージに置きます。ステージを配置し、ソフトウェアのグリッドを表示するようにフォーカスを調整します。
- 最初の実行では、新しいテンプレートをデザインします。ソフトウェアで、[ ROI の追加 ]( 図 2 領域 3 の場所に示されていない)を選択し、3,000 μm の円を選択します。画面の明視野画像をガイドとして使用して、グリッド上に円 ROI を配置します。ロックを押して ROI を固定します。
- ROI を所定の位置にロックしたら、[ パターンの追加 ] を選択 します (図 2 の領域 3 の位置には表示されません)。セクション 4 でデザインしたパターンを選択します。グリッドを 6 つの領域に分割して、各領域での独立した焦点と位置決めを行い、不均一なグリッドを考慮します。グリッドの各コーナーに 8 グリッド正方形の領域を×し、中心の両側に 2 × 8 グリッド正方形の領域を設定し、中央の 4 つのグリッド四角形をパターン化しません (図 2、中央の画像)。
- レプリケーション・オプション (図 2、エリア 4) を使用して、初期パターンのコピーを生成して、パターンの合計コピーの所望の数に達します。必要に応じて、コピーの間隔をグリッドの正方形の間隔に合わせて調整します。
- パターンの 総線量 を設定します。30 mJ/mm2 は良い出発点です。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。
- [ エキスパート オプション] (図 2、エリア 4)で、グリッドの正方形に合わせて領域の角度を調整します。領域はマウスを使用して再配置できます。パターンの比率(サイズ)も調整できます。パターンがグリッドの正方形に合わせるまで、パターンの角度、位置、間隔、および比率を調整します。ライブ明視野ディスプレイでグリッドの領域を変更するために顕微鏡のステージを移動します。
- [ロック]を押して、領域に加えた変更を保存します。
- リージョンをコピーするには、左側のアクションパネルで、名前の横にある「複製」ボタン(図2、領域5、用紙2枚のアイコン)をクリックします。コピーの位置を変更、名前変更、編集するには、[アクション]パネルでコピーの名前をクリックします。
- 必要な領域をすべて埋めるために、必要に応じて手順 5.4 ~ 5.9 を繰り返します。
- テンプレート全体をデザインして配置したら、ソフトウェア内にテンプレート ファイルを 保存 します (図 2、領域 6、上のツールバーの上矢印アイコンを付けて横棒)。
- 以前に保存したテンプレート(下矢印アイコンのバー)をロードすると、ROIがグリッドの中央に配置され、[ ロック]を押します。 アクションパネル の各領域をクリックして、角度、位置、線量、パターンファイルを変更します。
- テンプレートとパターンを配置したら、ソフトウェアの アクションパネル でリージョンの1つを除くすべてのチェックボックスをオフにします。
- 顕微鏡ステージを使用して、その領域に移動し、炭素箔に焦点を当てます。アクションパネル(図2、エリア5)で眼球アイコンをクリックすると、パターンオーバーレイの表示/非表示が切り替わります。
- グリッドにフォーカスが合ったら、明視野シャッターを閉じてソフトウェアの右下隅にある 再生 アイコンを押して、ライブで監視できるパターニングプロセスを開始します。
- アクションパネルで、次のリージョンのボックスを選択します。明視野シャッターを開けてグリッドが見えるようにし、顕微鏡ステージを使用してその領域を中央に配置します。 アクションパネルの各領域について、手順 5.13 ~ 5.14 を繰り返します。
- 顕微鏡からグリッド付きのカバースリップを取り外し、すぐに10μLの無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)をグリッドにピペットします。
- 10分後、ピンセットでステンシルを取り外し、15 μLのPBSでグリッド3xを洗います。最後の洗浄の後、各グリッドをPBSの15 μLに入れ、グリッドを暗い場所に移動します。
6. ECMタンパク質のデポジション
- 培養細胞の場合は、手順 6.2 ~ 6.5 に従います。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合、ステップ6.6-6.10に従ってください。
- 各グリッドに対して、少なくとも15 μLのECMを用意します。BEAS-2B細胞の場合、滅菌PBSで0.01mg/mLウシフィブロネクチンおよび0.01mg/mLフルオロフォア共役フィブリノーゲンの最終濃度を調製します。HeLa細胞の場合、0.01 mg/mLウシコラーゲンIと0.1mg/mLフルオロフォア共役フィブリノーゲンを滅菌PBSで調製します。
- 各グリッドからPBSの大部分を取り出し、15 μLのECMを適用します。少なくとも1時間室温で湿気の多いチャンバーにグリッドをインキュベートします。
注:このステップは、4°Cで一晩まで延長することができます。 - ECMでインキュベーションした後、各グリッド5xを滅菌PBSで洗浄します。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなくピペットで液体の大部分を取り出し、新鮮なPBSを15 μL加え、少なくとも30秒インキュベートし、繰り返します。最終洗浄後、各グリッドをPBSに残します。
注:グリッドは、PBSで4°Cで最大1週間保存することができ、品質の劣化は観察されません。 - 蛍光顕微鏡を使用してECMの蛍光素を検出し、パターニングを確認し、カーボン箔がそのまま残っていることを確認します。いくつかの壊れた正方形は、一般的に許容可能です。
- 第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、パターン化されたグリッドを滅菌PBSを含む30mmガラス底皿に移動します。
- 皿からPBSを吸引し、無菌環境で25°Cで一晩インキュベート0.5mg/mLフルオロフォアコンジュゲートコンジュゲートコンジュ化コンカナバリンA.インキュベートの2 mLを適用します。
- コンカナリンA溶液を皿から取り出し(グリッドを乾燥させることなく)、グリッド3xをPBSで洗います。洗うごとに、皿から2mL PBSを加えて取り出します。
- 蛍光顕微鏡を使用してECMの蛍光素を検出し、パターニングを確認し、カーボン箔がそのまま残っていることを確認します。いくつかの壊れた正方形は、一般的に許容可能です。
- 最後の洗浄後、 ガラス底皿からPBSを取り出し、20%の加熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、100 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 mL/μgを含む、新たに調製した無菌濾過されたシュナイダーの ショウジョウバエ 培地21を加えます。ニューロンがメッキされる準備ができるまで、滅菌環境で25°Cでインキュベートします。
7. 播種前の第 一次ショウジョウバエ 細胞の調製
- 70%のEtOHで55mm解剖皿を殺菌し、 そして、滅菌濾過1×解剖生理食動の皿に追加します(9.9 mM HEPES pH 7.5、137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.17 mM NaH2PO4、0.22 mM KH2PO4、3.3 mMグルコース、43.8mucm sucs)21)。
- ピンセットを使用して食品から優しく30-40第3イン スター幼虫を選びます。
- 1×PBSで幼虫をチューブに入れ、1×PBSで2番目のチューブに移して幼虫を洗います。
- 70%のEtOHで幼虫をチューブに移してPBSを洗い流し、70%のEtOHで2番目のチューブに移します。幼虫を殺菌するために2-3分間2番目のチューブに幼虫を残します。
- 幼虫を1×解剖生理食音でチューブに移し、すぐに1×解剖生理食音で2番目のチューブに移します。
- 1×解剖生理食糸を含む解剖皿に個々の幼虫を移す。鉗子と解剖顕微鏡を使用して、各幼虫を素早く引き裂いて脳を抽出し、1×解剖生理で3番目の管に移します。すべての脳が抽出されるまで繰り返します。
- 脳を含むチューブを1分間300xgで遠心分離する。
- 上清を捨て、1mLの1×解剖生理食置で洗浄し、チューブを300xgで1分間遠心分離します。この手順をもう一度繰り返します。
- 上清を200~250μLまでチューブに残し、2.5mg/mLリベラーゼを20μL1x解剖サリンに加えます。
- 室温で1時間回転する回転器のチューブを回します。この時間の間に、10分ごとに溶液を25〜30回ピペットします。最終的には、ソリューションは少し不透明になります。
- 300× g で細胞を遠心分離して5分間行います。
- 上清を捨て、シュナイダーのメディアを1mL追加します。溶液を30回混合するピペット。
- 300× g で5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、補助シュナイダーの培地を1mL加えて細胞ペレットを洗います。溶液を30回混合するピペット。
- 300× g で細胞を5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、次に、300 μLのシュナイダーの培地で細胞ペレットを再懸濁します。溶液を30〜40回混合するピペット。
8. BEAS-2BおよびHeLa細胞の培養およびRSV感染
- 37°Cおよび5%CO2でT75フラスコのHeLa細胞およびBEAS-2B細胞を維持する。3~4日毎に細胞が約80%の合流度に達する。DMEM + 10% FBS + 1×抗生物質抗ミコティックでHeLa細胞を維持します。BEAS-2B を RPMI + 10% FBS + 1×抗生物質抗菌薬 6,22,23 で維持します。
- 感染していない細胞のシード処理については、セクション 9 に進みます。BEAS-2B および HeLa 細胞は RSV 感染の影響を受けやすい;BEAS-2B細胞は、ここに示すRSVを含むすべての実験に使用した。
注:適切なバイオセーフティキャビネット(BSC)と個人用保護具(PPE)を使用して、機関プロトコルに準拠してBSL-2手順をすべて実行します。 - 細胞のRSV感染前に、2mLの増殖培地を用いて6ウェルプレート(表面積〜9.6cm2)に1ウェルあたり5×104個の細胞を通し、一晩インキュベートする。
- トリプシン化し、細胞の1つの井戸を数えます。トリプシン化するには、1つのウェルから培地を吸引し、Mg2+ およびCa2+ なしで2mLの無菌PBSで洗浄し、残留培地を除去する。0.25%のトリプシン溶液を500μL加えます。37°Cで5~10分間インキュベートします。セルがサーフェスから放出されているかどうかを定期的にチェックします。細胞が放出されたら、1.5mLの培養培地を加える。
- トリパンブルーの100 μLとトリプシン化細胞の100 μLを混合します。ピペット10μLの希釈細胞をヘモサイトメーターに混合する。セルをカウントし、ウェルあたりのセル数を計算します。この数値を使用して、以下の MOI を計算します。
- 750 μL のメディアで 1 ウェルあたり 10 の MOI を達成するために、成長メディアで RSV-A2mK+24 の希釈を準備します。RSV-A2mK+のMOIは、ストックの蛍光焦点単位(FFU)力素(例えば、1.0×105細胞のウェルと1.0×108 FFU/mLのRSVストック)から計算することができ、ウイルスストック1:75~1×106 FFU/750 μLまたは1.33×106FFUL/
- 6ウェル皿の細胞から培地を吸引し、上から各ウェルに750 μLのウイルス溶液を加えます。
- 室温でプレートを1時間揺らす。
- 1時間後、成長培地を37°Cに予め温めて2mLまでのウェルあたりの総体積を持ち込み、プレートを37°Cに設定し、5%CO2 を6時間調整してインキュベーターに入れる。
- 細胞をトリプシン化してそれらを放出し、以下に説明するように播種に進む。播種後、凍結する前に、さらに18時間グリッドをインキュベートします(感染後の合計24時間)。
9. マイクロパターン化されたグリッドにセルをシード
- 培養細胞の場合は、手順 9.2 ~ 9.8 に従います。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、9.9-9.11に従ってください。
- 細胞をトリプシン化して放出する(上記のセクション8のステップ4を参照)。細胞凝集を減らすには、細胞を60%以下の合流度でトリプシン化する。
- トリパンブルーの100 μLとトリプシン化細胞の100 μLを混合します。希釈した細胞のピペット10μLは、ヘモサイトメーターに混合し、細胞を数えます。
- 培地中の細胞を2×104 細胞/mLに希釈します。
- 30 mm ガラス底皿の中央に 1 μL のメディアを加え、グリッドの配置を支援し、乾燥を防ぎます。カバースリップのPBSからガラス底皿の中央にグリッドを移します。10 μLのセル溶液をグリッドに追加します。
- 明視野顕微鏡を使用して、5分後にグリッドへの細胞接着を観察します。パターンの大部分が占有されていない場合は、セル溶液の10 μLドロップを追加します。インキュベーション中は、グリッドとセル溶液を37°Cに保ちます。
- ほとんどのパターンが占有されるか、または多数のパターンが複数のセルを持ち始めるまで、ステップ 9.6 を繰り返します。インキュベーター(37°C、5%CO2)で2時間グリッドをインキュベートします。
- 2 mLの事前温めた培地で皿をあふれさせ、一晩(37°C、5%CO2)インキュベートします。
- 第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、グリッド含有皿から培地を取り出し、細胞を皿に盛り付けます。
- 細胞が取り付けるまで30〜60分待ってから、2mLの補足シュナイダーの培地を加えます。
- 25°Cインキュベーターで、2~3日間、プランジ凍結前にニューロンを培養する。
10. パターン化されたグリッドのイメージングとガラス化
- パターングリッドと培養細胞を含むガラス底皿を蛍光顕微鏡に置きます。
- 明視野と適切な蛍光チャネルを使用してグリッドの画像を取得し、細胞内のパターンおよびその他の標識を検出します。細胞密度と位置決めが下流のイメージングと解析に適していることを確認します。
注意:ブライトフィールドと蛍光画像は、フィジーソフトウェアパッケージ25で処理されました。 - クライオプランジ冷凍庫を準備します。凍結デバイスの種類は、サンプルに最適な可用性、コスト、および機能によって異なります。
注:一次 ショウジョウバエ ニューロンは自動プランジフリーザーで調製され、BEAS-2B細胞は半自動プランジ冷凍庫を使用して調製されました。 - チルトシリーズの適切な位置合わせのために、サンプルに金の受託者を適用します。余分な培地を除去するためにサンプルをブロットし、液体窒素で冷却した液体エタンなどの凍結物質にサンプルを突っ込んで凍結する。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合、裏側から4 sのブロット。HeLaおよびBEAS-2B細胞の場合、4-6sの両側からブロットする。凍結されたグリッドは、さらに使用されるまで液体窒素に保存することができます。
- クリオ電子顕微鏡でガラス化細胞を画像化し、直接電子検出器カメラで300kVで操作した。クライオEM/cryo-ETデータ収集用のシリアルEM26 などのソフトウェアで、対象地域ごとにチルトシリーズコレクションを設定します。
注:一次ショウジョウバエニューロンの傾きシリーズは、70-75 e/Å2の総用量で4.628 Åのピクセルサイズで-8 μmの焦点を離して2°増分で-60°から60°の双方向に直接電子検出器上で収集しました。RSV感染BEAS-2Bのチルトシリーズは、4.603 Åのピクセルサイズと〜80 e/Å2の合計用量で-5 μmの焦点が焦点を当てたエネルギーフィルター(20 eVスリット)を備えた直接電子検出器上で収集した。 - 傾斜系列を処理して、トモグラムを再構築します。
注: ここで紹介したトモグラムは IMOD パッケージ27を使用して再構築されました。ローパスフィルタリングは、EMAN2ソフトウェアパッケージ28を使用して行われました。
Representative Results
この手順は、全細胞cryo-ET実験のためのEMグリッドをパターン化するために使用された。この研究で示したワークフロー全体は、初期細胞培養調製物、マイクロパターニング(図1)、およびイメージングを含み、3〜7日間を包含する。2段階の手順を使用して、PLLをグリッドに適用し、その後反応性PEG-SVAを添加してPEGをリンクさせることによって、反汚れ層を生成しました。また、PLL-g-PEGを1インキュベーションで添加することで、反ファリング層を単一のステップで適用することもできます。PLPPゲルは、より少ない濃縮液としても利用できるUVマイクロパターニング用の触媒です。ゲルは液体と比較して著しく減らされた線量でパターニングを可能にし、それははるかに速いパターニングをもたらす。このシステムでは、完全なTEMグリッドの実際のパターニング時間は約2分でした。マイクロパターン化ワークフローだけでも、一般に 5 ~ 6 時間に及び、TEM グリッド上の標準的な細胞培養用に 8 つのグリッドをパターン化できます。
マイクロパターニングプロセス中のステップの多くは、長いインキュベーション時間を必要とします(ステップ2.1、2.3、6.4を参照)。便利なことに、PLLパッシベーション(2.1)やPEG-SVAパッシベーション(2.3)のようなこれらのステップのいくつかは、一晩のインキュベーションまで拡張されてもよい。さらに、グリッドは、事前にパターン化され、後で使用するためにECMタンパク質またはPBSの溶液に保存されてもよい。我々の研究では、これらの選択肢は、原発性 ショウジョウバエ ニューロンおよびBEAS-2B細胞のRSV感染など、細胞調製および播種のタイミングが重要な場合に有用であった。
グリッドは、クリーンツール、滅菌溶液を使用した一般的なバイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボ設定で調製され、成長培地6,22,29,30に抗生物質/抗菌薬が含まれていました。特に微生物汚染に敏感なサンプルについては、防汚層およびECMを組織培養フードまたは他の滅菌環境に適用することができる。さらに、グリッドは、パターニングとECMアプリケーションの間にエタノールで洗浄することができます。感染性物質を使用する場合は、適切なバイオセーフティプロトコルに準拠するように手順を適応させることが重要です。
このワークフローと示された手順(図1)は、HeLa細胞(図4)、RSV感染BEAS-2B細胞(図3、 図5)、および主要な ショウジョウバエ 幼虫ニューロン(図6、 図7)をパターン化されたEMグリッドに播種して最適なcryo-ETデータ収集を行うことを可能にしました。
マイクロパターン化されたTEMグリッドに播種されたHeLa細胞は、カルセインAMおよびエチジウムホモジマー-1ベースの細胞生存アッセイを用いた蛍光染色によって決定されるとおりに生存可能なままである(図4A、B)。コラーゲンとフィブリノーゲンの混合ECMを使用して、HeLa細胞はグリッド全体のパターンに容易に付着する(図4A、C)。パターンに沿って拡大する細胞の全体的な形態は、パターン化されていないグリッド上で増殖した細胞の形態と類似している(図4C、D)。HeLa細胞の場合、細胞の全厚さは、細胞周辺の近くで、厚<1μmの大きな薄い領域で、細胞の全厚さは10μm~<のままです(図4E、F)。
RSVの研究では、エッジに低線量の露出と中心に向かって高い線量パターンを使用して、グリッドの正方形全体をパターン化しました(図3A)。勾配パターンは、細胞の周辺付近に存在する放出されたウイルスを検索する際に、より良い結果をもたらした。これらのパターンにより、細胞はECM濃度が高いほど優先的に接着することが分かったが、より低いECM濃度に接着し成長することもできる。複数の用量を必要とするパターンを使用する場合、領域間の相対線量を最適化する必要があります。.用量としたがってECM濃度が互いにあまりにも類似しているか、またはあまりにも異なる場合は、複数の用量を使用する効果が失われます.
図3では、TEMグリッドをパターン化し、その後RSV感染BEAS-2B細胞を播種し、クライオEMデータ収集に使用した。図4Aは、勾配パターンを用いてTEMグリッド上にパターン化されたECMの蛍光像である。パターンの中央領域に沿った細胞接着および成長は、播種後18時間の細胞の明視野画像として図3Bに示すことができる。図3Cでは、RSV-A2mK+の複製による蛍光信号(赤色)がECMからの信号でオーバーレイされています。感染細胞の大部分は、勾配パターンの高密度中央領域に沿って配置されます。グリッドポスト凍結固定の低マグTEMマップは、グリッド四角形の中心近くの炭素箔の上に位置するRSV感染細胞を含む多くの細胞を明らかにします。標準TEMグリッド22で増殖した細胞について既に示したように、チルトシリーズは、マイクロパターン化されたグリッド上で増殖した感染したBEAS-2B細胞の周辺に近接してRSVビリオンを配置し、収集した(図5A、B)。RSV構造タンパク質の多くは、ヌクレオキャプシド(N)およびウイルス融合タンパク質(F)を含むトモグラム内で同定することができる(図5C、青および赤色の矢印それぞれ)。
一次ショウジョウバエニューロンの研究では、狭いパターンが、ソフトウェアによって提供される解像度限界(パターンの厚さが2μmであった)に近い、グリッド四角形内で単離される1〜数個の細胞を可能にすることがわかった(図6)。ニューロンソーマは、パターン内の数日間にわたって神経突起を拡張することができました。これにより、パターン化されていないグリッド上で培養されたニューロンと比較して、神経突起の識別とチルトシリーズの取得が容易に行われた(図7)。また、インビトロショウジョウバエ神経培養20,21のECMとして使用されてきたレクチンである蛍光標識コンカナバリンAがパターニングに適していることも判明した。
第3インスター幼虫由来のショウジョウバエニューロンは、以前に公表されたプロトコル20,21,31に従って単離された。ニューロン製剤は、細胞の配置、広がり、組織を調節するパターンにコンカナバリンAが堆積したマイクロパターン化されたクライオEMグリッドに適用された。パターン化されたまたはパターン化されていないグリッド上のニューロンは、最低48〜72時間インキュベートすることができ、グリッドは凍結して急落した。パターン化された領域に分布する複数のショウジョウバエニューロンを有するマイクロパターン化EMグリッドの代表的な画像を図6Aに示す。これらのニューロンは、膜内に汎神経GFP発現を有するトランスジェニックフライ株に由来し、蛍光標識だけでなく、マイクロパターン内の位置からも光顕微鏡検査によって容易に追跡することができる。パターン化されていないグリッド上で培養されたニューロンは、光顕微鏡(図7A、黄色の円)によってGFPシグナル伝達を通して追跡することもできますが(図7A、黄色の円)、細胞の破片の存在とメディアからの汚染のために、それらをクライオEMに配置することはかなり困難になりました(図7B、黄色の円)。このような存在は、パターン化された格子上のニューロンに対して減少した、おそらく、接着から細胞の破片を撃退する非パターン化領域の反ファウリング層におけるPEGによる。ニューロン細胞体と拡張神経突起の寸法(図6A、B、黄色の円)により、細胞のより薄い領域に沿ってクライオETチルト系列が採取された(図6C、D、赤い円)。ニューロン細胞膜は、ミトコンドリア(シアン)、微小管(紫色)、アクチンフィラメント(青)、小胞構造(オレンジと緑)、リボソームなどの高分子(赤)が3D断層画像モンタージュおよび3D断層を介してスライスしてよく解解された(図6E)。同様の細胞部分機能は、パターン化されていないニューロンの3Dトモグラムから見ることができますが(図7E)、データ収集のための実行可能な細胞ターゲットを見つけることの難しさは、スループットを大幅に低下させました。
図 8 では、これらの問題の一部をグリッドから示す代表的なイメージが、識別とトラブルシューティングを支援するために組み立てられています。最適な条件が決定されると、マイクロパターニングは、クライオ-TEMのグリッド上の細胞の位置決めのための信頼性と再現性の高い方法です。
図1:クライオEMのマイクロパターニングの一般的なワークフロー ワークフローは、グリッド準備、マイクロパターン化、ECMとセルシード、およびクライオ調製とデータ収集の4つの部分で大きく分けることができます。各セクションの主な手順は見出しの下にリストされ、各セクションを完了するためのおおよその時間が左に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:グリッド上に配置されたパターンを持つソフトウェアのスクリーン ショット。 領域1には、パターン設計用のμm/pix比が含まれています。エリア 2 は、グリッドを測定するための定規です。領域 3 は、パターンと ROI を追加または変更する場所です。領域4には、パターンの位置づけおよび線量に関するすべての情報が含まれています。エリア 5 には、オーバーレイの切り替え、パターンのコピーまたは削除、マイクロパターン作成のパターンの選択など、パターンのオプションが含まれています。エリア 6 は、テンプレートを保存してロードできる場所です。エリア 4 と 5 の大きなビューを以下に示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:パターン化されたクライオTEMグリッド上のRSV感染BEAS-2B細胞(A)蛍光標識ECMを添加した後のパターン化グリッドの蛍光像。入力パターンは左下隅に表示されます。(B)A.(C)のグリッド上で増殖したBEAS-2B細胞のブライトフィールド画像(C)は、プランジ凍結の直前にRSV感染細胞(赤)の蛍光画像とA(シアン)とB(灰色)の画像をマージする。感染細胞はmKate-2を発現する。スケールバーは、プランジ凍結後のBのグリッドの低倍率クライオ-TEMマップである500 μm(D)蛍光画像は疑似色です。スケールバーは500 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: パターン化された細胞とパターン化されていない細胞のライブ/デッド染色 (A)パターン状の格子上で増殖し、カルセイン-AM(生細胞染色、緑色)およびエチジウムホモジマー-1(死細胞染色、赤色)で染色したHeLa細胞の蛍光像。(B)パターン化されていない格子上で増殖し、A.(C)パターン化されたクアンチフォイルR2/2グリッド上のHeLa細胞の共焦点zスタックの投影と0.01mg/mLコラーゲンおよびフィブリノーゲン647 ECM(赤)のように染色されたHeLa細胞。細胞はカルセインAM(緑色)およびHoechst-33342(青)で染色した。(D)0.01 mg/mLコラーゲンおよびフィブリノーゲン647 ECMでインキュベートされた未パターンのグリッド上のHeLa細胞は、カルセインAMおよびHoecsht-33342でインキュベートおよび染色した。蛍光画像は透過光(グレースケール)と結合した。(E)C.(F)のX、Z投影は、D.画像の投影が擬似着色されている。(A)と(B)のスケールバーは500 μmです。スケールバー (C) - (F) は 10 μm です。
図5:パターン化されたクライオTEMグリッド上のRSV感染BEAS-2B細胞のクライオET. (A)RSV感染BEAS-2B細胞のクライオEMグリッド正方形マップ。近似セル境界は、緑色の破線で示されます。(B) (A)に赤でボックス化された領域の高解像度画像。近似セル境界は、緑色の破線で示されます。RSVビリオンは、細胞周辺(白い矢印と黄色のボックス)の近くに見ることができます。(C)(B)の黄色いボックスの領域に集められたトモグラムから単一のzスライス。赤い矢印はRSV F融合タンパク質を指し、青い矢印はリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を指す。(A)-(C)のスケールバーは、画像に埋め込まれます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:パターン化されたクライオ-TEMグリッド上の第3インスターショウジョウバエメラノガスター幼虫の脳由来の一次ニューロン。 (A)0.5mg/mL蛍光コンカナバリンA.グリーン:ショウジョウバエニューロンを有するパターングリッド正方形上で膜標的GFPを発現するショウジョウバエニューロンのオーバーレイド生細胞蛍光顕微鏡グリッドモンタージュ。青:フォトパターン。(B)クライオ保存後の(A)におけるグリッドのクライオEM画像モンタージュ。黄色い円は(A)と同じグリッドの正方形を示します。(C)(A)と(B)の黄色い円で強調された正方形のクライオEM画像モンタージュ。(D) セルの神経突起に傾きシリーズが集められた(C)の赤い円で囲まれた領域のより高い拡大画像。E. (C)の赤丸から取得した傾斜シリーズから再構成された断食の25nm厚いスライス。ミトコンドリア(シアン)、微小管(紫)、密なコア小胞(オレンジ)、軽小胞(緑色)、小胞(黄)、アクチン(青)など、様々な小器官が見られます。また、リボソーム(赤)などの高分子も右上隅に見られます。蛍光画像は疑似色です。(A)-(E)のスケールバーは画像に埋め込まれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:パターン化されていない格子上の第3インスターショウジョウバエメラノガスター幼虫の脳に由来する一次ニューロン。 (A)0.5mg/mLコンカナバリンA.グリーン:ショウジョウバエニューロンを有するグリッド四角上に膜標的GFPを発現するショウジョウバエニューロンの生細胞蛍光顕微鏡グリッドモンタージュ。(B)プランジ凍結後(A)の同じグリッドのクライオEMグリッドモンタージュ。黄色の円は(A)と同じグリッドの正方形を示します。細胞の破片やメディア汚染の存在に注意してください, パターン化されたグリッドと比較してターゲットの識別が困難になりました.(C)(A)と(B)マップの黄色い円で強調された正方形のクライオEM画像モンタージュ。(D) セルの神経突起に傾きシリーズが集められた(C)の赤い円で囲まれた領域のより高い拡大画像。(E)(C)および(D)から傾斜系列から再構成された断食計の厚さ25nmのスライス。このトモグラムには、微小管(紫色)、アクチン(青)、小胞体(黄色)、高密度コア小胞(オレンジ)など、多数のオルガネラが見られます。リボソーム(赤)などの高分子も見られます。蛍光画像は疑似色です。(A)-(E)のスケールバーは画像に埋め込まれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: パターン化に関する問題の例 マイクロパターン化されたグリッドに堆積した標識されたECMの蛍光画像。(A) PLPPゲルの不均一な分布によるグリッド全体の不均一なパターニング。(B) ECM は、パターニング中に PDMS ステンシルで覆われた領域に付着できません。(C)飽和勾配パターン(右側)または反転パターン(左)が高すぎる総線量でパターン化されたグリッド上。(D) ECMは、パターン化中のUVレーザーの反射によるパターン化された領域と同様に、グリッドバー上の領域に付着している。画像は擬似色です。入力パターンは左下に表示されます。スケールバーは100 μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 発行 | 考えられる原因 | トラブルシューティング |
| マイクロパターン化 | ||
| プリモレーザーからの照明を見ることができません | • ライトパスが正しく設定されていません | • 顕微鏡のライトパスが正しく設定されていることを確認します。 |
| • PRIMOレーザーがオンでないか、レーザーがインターロックされている | ||
| 多くの壊れたグリッド正方形 | •取り扱い中にピンセットまたはピペットでグリッド箔をタッチ | • 慎重にグリッドを処理 |
| • グリッドは、インキュベーションまたは洗濯中に乾燥した | • 平式化やインキュベーション時にグリッドを乾燥させないでください | |
| パターン化されていない大きな領域 | • ゲルのカバレッジが不十分 | • 追加中にゲルがグリッド上に均等に広がることを確認 |
| • パターン作成中にグリッドフォイルがフォーカスを外れる | • 追加のマイクロリットルのゲルを追加する | |
| •ステンシルで覆われた領域 | • 各領域をパターン化する前にフォーカスを確認する | |
| • 慎重にステンシル内のグリッドを中央に配置 | ||
| 飽和または反転パターン | • 誤った線量 | •パターンの総用量の範囲を試してみてください |
| • ゲルのカバレッジが不十分 | • グリッドがゲルで均等に覆われていることを確認 | |
| • グレースケールパターンに対して異なる値を試す | ||
| ぼやけたパターン | • パターニング中の焦点が悪い | • サンプルと同じ高さで PRIMO キャリブレーションを繰り返す |
| • 正しいキャリブレーション | •パターニング前にグリッドフォイルに焦点を当てる | |
| • パターン作成用の追加領域にパターンを分割 | ||
| パターンの外側に付着するECM | • ゲルまたは埃からの反射 | • パターニング前にゲルが乾燥していることを確認する |
| • カバースリップと対物レンズが清潔であることを確認する | ||
| パターン化後に ECM が表示されない | • 写真の漂白 | • イメージング前にECMへの光の露出を最小限に抑える |
| • パターニング中の不適切な線量 | •パターンの総線量の範囲を試してみてください | |
| • ECM インキュベーション時間が不十分 | • ECMのインキュベーション時間を増加 | |
| 細胞の播種 | ||
| 細胞の束 | • 過剰消化 | • 付着細胞の放出にトリプシンまたは時間の低い割合を使用する |
| • 高い細胞密度 | • より低い合流度での細胞の通過および/または消化 | |
| • 放出中に細胞を攪拌しない | ||
| • 穏やかにピレットセル溶液または細胞のストレーナーを使用 | ||
| パターン化された領域に付着していないセル | • ECMは細胞タイプには適さない | •異なるECM濃度と組成を試してみてください |
| • 細胞の生存率はシード前に減少する | • 細胞培養および細胞放出条件が細胞にダメージを与えないようにする | |
| 接着後に細胞が膨張しない | • ECMまたはパターンがセルタイプに適さない | •異なるパターンとECMを試してみてください |
| • より連続的なフォイル(R1.2/20対R2/1)が細胞の拡張を促進する場合がある |
表1:マイクロパターン化中の潜在的な問題 この表では、マイクロパターン化またはセルシードの際にユーザーが経験する可能性のある問題について説明します。問題ごとに、考えられる原因とトラブルシューティングが提供されます。いくつかの問題の代表的なイメージは 図8に見ることができる。
Discussion
最新の高度な電子顕微鏡とソフトウェアパッケージは、合理化された自動化されたクライオEMとクライオETデータ収集をサポートし、数日以内に数百から数千の位置をターゲットにして画像化することができます32,33,34,35。全細胞cryo-ETワークフローの重要な制限要因の1つは、グリッドごとに収集可能なターゲットの十分な数を得た。最近では、多くのグループがクライオEM用のマイクロパターニンググリッド用のプロトコルを開発しており、データ収集効率が向上する利点が16,17,18です。ここでは、市販のマイクロパターニングシステムを使用して、主要なショウジョウバエニューロンおよび培養ヒト細胞株(未感染またはRSV感染)のクライオET研究のためのTEMグリッドをマイクロパターン化するためのプロトコルが提示される。このマイクロパターン化システムは多目的で、特定の実験目標に合わせて多くのステップを最適化し、調整することができます。TEMと蛍光顕微鏡経験を持つユーザーは、グリッド調製およびマイクロパターニングにすぐに熟練することができます。慎重な練習では、数回の反復の後で良い結果を得ることができます。以下では、利用可能なオプション、ユーザーの考慮事項、潜在的な利点、およびcryo-EMのマイクロパターニングの将来の応用について説明します。
全細胞cryo-ETのための重要な考慮事項の1つは、EMグリッドの選択です。EM グリッドは、メッシュ フレーム(または構造支持)と、セルが成長する連続または穴のあいたフィルム表面であるホイル(またはフィルム)の 2 つの部分で構成されます。銅メッシュグリッドは、タンパク質および単離された複合体のクライオEMに一般的に使用されます。しかし、銅の細胞毒性のために全細胞クライオETには適していません。代わりに、細胞断層撮影には金メッシュが一般的に使用されます。その他のオプションは、ニッケルまたはチタンを含む、 剛性の増加などの金よりも利益を提供する可能性があります16。EM グリッドは、さまざまな用途をサポートするために、さまざまなメッシュ寸法で使用できます。メッシュサイズが大きいほど、グリッドバーとチルトシリーズの収集に適した領域の間でセルが成長する余地が増えますが、全体的な標本の脆弱性が高まります。最も一般的に使用される箔は、クアンチフォイルやCフラットグリッドなどの穴あきまたは穴のあいたアモルファスカーボンです。生物学的ターゲットは、炭素の正孔を通して、または電子半透明炭素を通して画像化することができる。R 2/1やR2/2などのグリッドは、穴がそれぞれ1と2μmの間隔で配置された幅2μmで、多数の穴を提供し、データ収集のための潜在的な領域を多数提供します。しかし、一部の細胞は、R 1.2/20 グリッドや連続カーボンなどのより均一な表面で成長し、より良く拡大する可能性があります。焦点イオンビームミリング(cryo-FIB)による下流のサンプル処理では、ホイルを切削によって除去し、基礎となるフィルムの継続的な存在に対する懸念を軽減します。メッシュと同様に、他の材料からの箔も利用可能で、ここで提示されるパターニングプロトコルはSiO2グリッドにも同様に適しています。一般的に使用されるグリッドには、全細胞クライオET用の金クアンチフォイル、連続カーボン、またはSiO2フィルム200メッシュグリッド(グリッドバー間の約90 μm間隔)が含まれます。
パターンを設計する際には、いくつかの考慮事項があります。これらの決定の大部分は、実験の細胞タイプと目的によって導かれます。良い出発点は、培養中の細胞の形状と寸法に近似するパターンを選択することです。多くの研究は、細胞の成長および細胞骨格配置に対するパターン形状の有意な効果を実証した13,36,37。対象を変更する可能性がある場合は、パターン設計時に特別な注意を払う必要があります。各細胞タイプのいくつかのパターンをテストし、どのパターンが細胞接着および成長を促進するかを決定した。マイクロパターン化システムの柔軟性により、単一のグリッド上で複数のパターンをテストし、1つの実験で異なるグリッドのパターンを変更できます。ここで使用されるような大きなパターン(〜50〜90μm)は、複数の細胞がパターンの単一領域に付着する可能性を高め、接着後に細胞が拡大および拡張することを可能にする。より制約のあるパターン(20~30 μm)は、細胞の拡張よりも細胞の分離が重要な実験(例えば、焦点イオンビームミリング(cryo-FIB)実験など)に適している場合があります。断層撮影アプリケーションでは、傾き軸の影響を考慮する必要があります。パターンが配置され、すべてのセルが互いに平行に単一の方向に成長する場合、すべてのセルが顕微鏡ステージにロードされたときにチルト軸に対して垂直になり、データの品質が低下する可能性があります。
パターンなしのグリッドでは、セルはグリッド バーに優先的に付着し、TEM ではイメージ化できません。パターン化されたグリッド上でも、細胞は、パターン化されたカーボンフォイルとグリッドバーの両方のグリッド四角形の角に部分的に配置されることがしばしば観察されます。最近、マイクロパターン化は、意図的にグリッドbar18の上にセルの一部を配置するために使用された。これは、箔に細胞全体を周囲に置くことを重要ではない実験のために考慮することができる。これは、1 つのグリッド四角形よりも大きくなる可能性のある細胞 (1 次ニューロンが複数日にわたって成長するなど) で特に重要です。
パターンのデザインに使用できるツールは多数あります。ここで、パターンは、パターンを任意の角度に回転させ、このマイクロパターン化システムによって単一の投影でパターン化できる最大領域内に収まるように、任意の次元で800ピクセル未満に制限された。これにより、顕微鏡上のグリッドの向きに関係なく、グリッドに合ったパターンを回転させることができます。ここでは、グリッドを6つのパターン化領域に分割した。主に、グリッドの異なる領域間でフォーカス調整が可能です。特にゴールドグリッドは非常に可鍛性であり、ガラスの上に完全に平らに横たわっていない可能性があります。クリーンで洗練されたパターニング結果には、適切な焦点が不可欠です。セグメント化されたパターンを使用すると、パターン化プロセス中にグリッドがわずかにずれる場合にパターン位置を微調整するだけで済みますが、通常、PDMS ステンシルで PLPP ゲルを使用する場合は問題ではありません。最後に、グリッドの中央 4 つのグリッドの正方形はパターン化されていないままでした。これは、ユーザーが明確にグリッドの中心を識別することができ、これは相関イメージング実験に非常に有用であるサポートしています。
このマイクロパターニングシステムのパターニングソフトウェアであるLeonardoは、ステッチングや、このプロトコルの範囲を超えたPDFとしてパターンをインポートする機能など、より高度な機能を備えています。このソフトウェアには、TEM グリッドで使用できる微細構造検出と自動パターン位置決めも含まれています。この機能は、グリッドが非常に平坦で、異なる領域間でフォーカスを調整することなくパターン化できる場合に最も便利です。
ECMタンパク質の選択は、細胞接着および拡張に大きな影響を与える可能性があります。いくつかの細胞は、特定の基質38上で成長すると生理学的変化を起こすと知られている。複数のECMタンパク質および濃度は、文献で報告された以前の研究に基づいて、任意の新しい細胞タイプについて試験された。ラミニン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、コラーゲンは培養細胞に広く使用されており、他のデータが利用できない場合は出発点として使用することができます。しかし、一般的に使用されるECMタンパク質が細胞に適切な付着特性を与えることができない場合は、他のECMタンパク質も考慮する必要があります。これは、原発 性ショウジョウバエ ニューロンに特に当てはまり、植物のレクチンコンカナバリンAの高濃度が適切な細胞接着に必要であった。細胞接着とECMとの成長の両立性は、TEMグリッドに移行する前にガラス皿やスライドにパターニングすることによってテストすることができます。この事前審査アプローチは、多数の組み合わせを調べる必要がある場合、時間と費用対効果が高くなります。蛍光結合ECMタンパク質の含有は、パターニングの成功と品質を評価する上で重要です。
細胞播種は、マイクロパターニングの有無にかかわらず、全細胞cryo-ETにとって最も重要なステップの1つである6,16,39です。一次ショウジョウバエまたは他のニューロンは、壊れやすい、懸濁液中不安定であり、かつ量が制限される可能性がある場合、単一の播種アプローチは、監視される順次細胞の播種よりも好ましい。ショウジョウバエニューロンのプロトコルに記載されているように、最適化された細胞密度での単一のシードステップは、ほとんどの細胞タイプで実行可能な選択肢です。しかし、細胞を低い初期濃度で基質に播種し、ここで説明する他の文献18に記載されているように、監視された方法で細胞を追加することも可能である。このシーケンシャルシード処理により、一貫性のある結果が得られる場合があります。標準的な細胞培養と同様に、細胞の生存率を維持し、単離中の細胞凝集を最小限に抑えるために常に注意する必要があります。
マイクロパターニングから始めるとき、最終的な結果に有害ないくつかの潜在的な落とし穴があります。慎重なグリッド処理および滅菌技術、PLPPゲルの均一な分布、パターニング中の適切な用量と焦点、および播種前の細胞生存率の維持は、成功のための最も重要な考慮事項の一つです。いくつかの潜在的な問題の一覧と解決策を表 1 にまとめました。
マイクロパターン化されたグリッドを使用すると、セルをグリッド全体で一貫したセル密度を確立し、傾斜系列コレクションに適した領域に関心のある領域を配置するのに役立ちます16,18。細胞の配置と位置決めは、cryo-CLEM実験における相関性の受託マーカーとして使用することができ、脆弱なファインダーグリッドおよび蛍光受託者マーカーの必要性を減らします。しかし、このような受託者マーカーは、サブマイクロメータ精度相関29,40に対して依然として有用であり得る。さらに、単離された細胞の均等な分布は、ラメラを切断できる細胞の数を最大化する集光イオンビームミリング(cryo-FIB)実験にも非常に有益です16。
cryo-EM ワークフローにマイクロパターン化を追加すると、データスループットが測定可能に改善され、新しい実験が可能になる可能性があります。この技術がさらに採用され、開発されるにつれて、ECM勾配、複数のECM堆積物、および微細構造アセンブリを含むマイクロパターニングのより高度なアプリケーションは、完全な細胞コンテキストで生物学的標的およびプロセスを研究するcryo-ETの能力をさらに拡大する。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ウィスコンシン大学生化学科のジル・ワイルドンガー博士、シホイ・Z・ヤン博士、ジョセフィーヌ・W・ミッチェル夫人に感謝します。また、アウレリアン・デュボイン博士、ローラン・シキエ氏、アルヴェオールのマリー=シャーロット・マヌス氏、ナノスケール研究所のセルジュ・カドゥーラ氏の皆様に感謝申し上げます。この研究は、ウィスコンシン大学によって部分的にサポートされました, ウィスコンシン大学マディソン校生化学科のマディソンと公衆衛生サービスは、R01 GM114561、R01 GM104540、R01 GM104540-03W1、U24 GM139168をE.R.W.に付与し、R01 AI150475をI.W.S.に付与します。この研究の一部はNIH助成金U24 GM129547によって支援され、OHSUのPNCCで行われ、生物環境研究局が主催するDOE科学ユーザー施設(grid.436923.9)を通じてアクセスされました。また、ウィスコンシン大学マディソン校生化学部のクライオEM研究センターで施設や計装を利用してくれたことに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% (w/v) Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | |
| 0.22 µm syringe filters PVDF membrane | Genesee | 25-240 | |
| 22x60-1 Glass cover slip | Fisher | 12545F | |
| 5/15 Tweezers | EMS (Dumont) | 0203-5/15-PO | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher (Gibco) | 15240096 | |
| BEAS-2B cells | ATCC | CRL-9609 | |
| Collagen I, bovine | ThermoFisher (Gibco) | A1064401 | |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | C11254 | |
| DMEM | Fisher (Lonza) | BW12-604F | |
| EtOH | Fisher (Decon Labs) | 22-032-600 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | F35200 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher (Gibco) | 33010018 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Glucose | VWR | 0643-1KG | |
| Grid prep holder | EMS | 71175-01 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Hemacytometer | Fisher (SKC, Inc.) | 22600100 | |
| HEPES | Fisher (ACROS Organics) | AC172572500 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher (Invitrogen) | H3570 | |
| Insulin | Fisher (Sigma Aldrich) | NC0520015 | |
| KCl | MP Bio | 194844 | |
| KH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC212595000 | |
| Leica-DMi8 | Leica Microsystems | Can be customized with camera, stage, and objective attachments | |
| Leonardo | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ | |
| Liberase Research Grade | Fisher (Supply Solutions) | 50-100-3280 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | ThermoFisher (Invitrogen) | L3224 | |
| Microscope camera | Hammamatsu | C13440-20CU | |
| Motorized stage | Märzhäuser Wetzlar | 00-24-599-0000 | |
| NaCl | Fisher (Fisher BioReagents) | BP358-1 | |
| NaH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC207802500 | |
| NaOH | Fisher (Alfa Aesar) | AAA1603736 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| PDMS stencils | nanoscaleLABS | PDMS_STENCILS_EM | https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/ |
| PEG-SVA | nanoscaleLABS | PEG-SVA-1GR | mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 |
| Penicillin | Fisher (Research Products International Corp) | 50-213-641 | |
| pH strips | Fisher (Millipore Sigma) | M1095350001 | pH probe can also be used |
| PLPP gel | nanoscaleLABS | PLPP-GEL-300UL | https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/ |
| PRIMO | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/ | |
| pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) | BEI Resources | NR-36460 | https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx |
| Quantifoil grids | EMS (Quantifoil) | Q2100AR1 | 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available |
| RPMI | Fisher (Lonza) | BW12-702F | |
| RSV A2-mK+ | see entry for pSynkRSV-19F | - | Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F |
| Schneider's Media | ThermoFisher (Gibco) | 21720-024 | |
| SerialEM | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | |
| Straight tweezers | EMS (Dumont) | 72812-D | |
| Streptomycin | Fisher (Fisher BioReagents) | BP910-50 | |
| Sucrose | Avantor | 4097-04 | |
| Tetracycline | Sigma | T8032-10MG | |
| Titan Krios electron microscope | ThermoFisher | 300kV, with direct electron detector camera and energy filter | |
| Trypsin | ThermoFisher (Gibco) | 15090046 | |
| Tube Revolver/Rotator | Fisher (Thermo Scientific) | 11676341 | |
| UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain | Bloomington Drosophila Stock Center | 5146 | http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html |
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