Summary
Detta protokoll beskriver en minigene reporter analys för att övervaka effekten av 5's-skarvning webbplats mutationer på skarvning och utvecklar suppressor U1 snRNA för räddning av mutation-inducerad splitsning hämning. Reportern och suppressorn U1 snRNA konstruktioner uttrycks i HeLa celler, och splitsning analyseras av primer förlängning eller RT-PCR.
Abstract
Under genuttryck innebär det avgörande steget i pre-mRNA splitsning korrekt erkännande av skarv platser och effektiv montering av spliceosomal komplex att sammanfoga exons och ta bort introner före cytoplasmic export av mogna mRNA. Splitsningseffektivitet kan ändras genom förekomsten av mutationer på skarvplatser, påverkan av transverkande splitsningsfaktorer eller aktiviteten hos terapeutiska. Här beskriver vi protokollet för en cellulär analys som kan tillämpas för övervakning av skarvningseffektiviteten hos en viss exon. Analysen använder en anpassningsbar plasmidkodad 3-exon/2-intron minigene reporter, som kan uttryckas i däggdjursceller genom transienta transfection. Efter transfektion isoleras totalt cellulärt RNA, och effektiviteten av exon splitsning i reporter mRNA bestäms av antingen primer förlängning eller semi-kvantitativ omvänd transkriptas-polymeras kedjereaktion (RT-PCR). Vi beskriver hur effekten av sjukdomen associerade 5 ′ skarv-webbplats mutationer kan bestämmas genom att införa dem i reportern; och hur undertryckandet av dessa mutationer kan uppnås genom samtransfektion med U1 små nukleära RNA (snRNA) konstruera bärande kompensatoriska mutationer i dess 5′ region som basepairs med 5′-skarv platser vid exon-intron korsningar i pre-mRNAs. Således kan reportern användas för design av terapeutiska U1 partiklar för att förbättra erkännandet av mutant 5 ′ skarv-platser. Införande av cis-verkande regleringsplatser, såsom splitsning förstärkare eller ljuddämpare sekvenser, i reportern kan också användas för att undersöka U1 snRNP: s roll i reglering förmedlas av en specifik alternativ skarvningsfaktor. Slutligen kan reporter uttrycker celler inkuberas med små molekyler för att bestämma effekten av potentiella terapier på konstituerande pre-mRNA splitsning eller på exoner som bär mutant 5 ′ skarv platser. Sammantaget kan reporteranalysen tillämpas för att övervaka skarvningseffektivitet i en mängd olika förhållanden för att studera grundläggande splitsningsmekanismer och skarvningsrelaterade sjukdomar.
Introduction
Pre-mRNA-skarvning är ett viktigt bearbetningssteg som tar bort icke-kodande introner och exakt ligates kodexoner för att bilda mogna mRNA. Erkännande av konsensussekvenser vid exon-intron-korsningar, så kallade 5′skarvplats och 3′skarvplats, av komponenter i skarvningsmaskineriet initierar skarvningsprocessen. U1 små nukleära ribonucleoprotein (snRNP) känner igen 5′-skarvplatsen genom basparning av U1 snRNA till pre-mRNA1. Genetiskt ärvda mutationer som ändrar 5′-skarv plats sekvenser är associerade med många sjukdomar2,3. det förutspås att förlusten av basepairing av U1 snRNA med mutanta 5′-skarv platser orsakar avvikande splitsning, vilket kan äventyra översättningen av den drabbade transkriptionen. En potentiell terapeutisk strategi för att korrigera splitsning defekter innebär undertryckande av mutationer genom modifierade U1 snRNA bär kompensatoriska nukleotid förändringar i sin 5′-region som basepairs med 5′-skarv webbplats. Sådana modifierade U1 snRNAs, även kallad exon specifika U1 snRNAs, har visat sig vara effektiva för att vända splitsning defekter, vilket resulterar i ökat proteinuttryck från den räddade mRNA4,5,6,7,8.
Här beskriver vi U1 snRNP komplementeringsanalys, en reporter-baserad cellulär skarvning analys som tillåter bedömning av effekten av 5′ss mutationer på skarvning av en exon och kan också användas för utveckling av modifierade U1 snRNAs för att möjliggöra räddning av exon inkludering. Vi tillhandahåller också protokoll för övervakning av de skarvade reporter transkriptioner av primer förlängning och RT-PCR, och för att bestämma uttrycket av modifierade U1 snRNAs genom primer förlängning och RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser och buffertar
OBS: All sterilisering med vakuumfilter ska utföras med 0,2 μm polyetersulfon (PES) membran i ett biosäkerhetsskåp.
- Förbered RNase-fritt vatten genom att tillsätta 1,0 ml diethylpyrokarbonat (DEPC) till 1,0 L avjoniserat vatten, blanda i minst 1 timme vid rumstemperatur (RT), autoklav två gånger och svalna sedan till RT före användning.
- Förbered Dulbeccos modifierade eaglemedium (DMEM) genom att blanda ett paket DMEM-pulver (13,4 g), 3,7 g natriumbikarbonat, 100 ml fetalt bovinserum (FBS), penicillin och streptomycin till ~800 ml sterilt avjoniserat vatten. Den slutliga koncentrationen av penicillin och streptomycin i DMEM bör vara 50 U/ml respektive 50 μg/ml. Justera pH-värdet till 7,4 och gör sedan upp volymen till 1,0 L med sterilt avjoniserat vatten. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
- Förbered 10x fosfatbuffrad koksaltlösning (10x PBS) genom att tillsätta 25,6 g disodium väte heptahydrat (Na2HPO4· 7H2O), 2 g kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4), 2 g kaliumklorid (KCl) och 80 g natriumklorid (NaCl) till 800 ml avjoniserat vatten. Blanda för att lösa upp och gör upp volymen till 1,0 L. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
- Förbered 0,5 M etylendiamintra ättiksyra (EDTA) genom att lösa upp 186,1 g Na2•EDTA•2H2O till ~800 ml avjoniserat vatten. Justera pH till 8,0 och gör sedan upp volymen till 1,0 L med sterilt avjoniserat vatten. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
- Förbered 1x trypsin-EDTA-lösning genom att blanda 100 ml 10x trypsin (2,5%), 2 ml 0,5 M EDTA och tillsätt 1x PBS upp till 1,0 L. Sterilisera genom filtrering och alikvot i 50 ml koniska rör. Förvara vid 4 °C i 1-2 veckor eller frys vid -20 °C för långvarig användning.
- Förbered 2x formamid DNA/RNA-laddningsfärg genom att blanda 14,4 ml formamid och 0,6 ml 0,5 M EDTA för en slutlig volym på 15 ml. Tillsätt bromfenolblått och xylencyanolpulver till en slutlig koncentration av 0,02% och förvara vid 4 °C.
OBS: Formamid är giftigt och frätande. Läs materialsäkerhetsdatabladen för ytterligare säkerhetsrekommendationer. - Förbered 5x Tris/Borate/EDTA (5x TBE) buffert genom att blanda 54,0 g trisbas, 27,5 g borsyra och 20 ml 0,5 M EDTA i ~800 ml avjoniserat vatten. Blanda för att lösa upp och gör upp volymen till 1,0 L med avjoniserat vatten.
- Förbered urea-polyakrylamide gel elektrofores (urea-PAGE) lösning genom att blanda 200 ml 5x TBE, 250 ml 40% 19:1 bis/akrylamid och 450,5 g urea. Tillsätt sedan avjoniserat vatten upp till 1,0 L. Blanda tills ingredienserna är helt upplösta, sterilisera sedan genom filtrering och förvara vid 4 °C i en bärnstensfärgad glasflaska.
OBS: Bis/akrylamid är giftigt. Läs materialsäkerhetsdatabladen för ytterligare säkerhetsrutiner. - Förbered 10% ammoniumpersulfat (APS) genom att lösa upp 1 g APS i 10 ml avjoniserat vatten och förvara vid 4 °C.
2. Samsändning av HeLa-celler med reportern och U1 snRNA-plasmiderna
OBS: Transfekteringen av Hela-celler måste utföras under sterila förhållanden i ett biologiskt säkerhetsskåp. Den yttre ytan av alla material måste sprutas med 70% etanol innan den förs in i det biologiska säkerhetsskåpet.
- Håll Hela-celler i DMEM i en 37 °C inkubator med 5% CO2 genom att passa var 2-3 dagar när cellerna är ca 80-90% sammanflöde.
- För att passa hela-celler, aspirera det förbrukade mediet och inkubera sedan celler med 3 ml 0,25% trypsin innehållande 1 mM EDTA vid 37 °C i 3 min.
- Tillsätt 7 ml färsk DMEM efter inkubation. Överför cellfjädringen till ett 10 mL-rör, centrifugera vid 1 000 x g i 5 min.
- Resuspend cellpelleten i 10 ml färsk DMEM, och plätera sedan cellerna på en ny vävnadskultur skål vid 20% sammanflöde.
- För transienta transfekteringar, räkna Hela celler med en ren hemocytometer glida och förbereda en suspension med en densitet av 2,5 x 105 celler/ml.
- Frö 1,0 ml 2,5 x 105 celler/ml Hela cell suspension i varje brunn på en 12-brunnsplatta och inkubera över natten vid 37 °C.
- Nästa dag, aspirera det förbrukade mediet och tillsätt 0,8 ml färsk DMEM med serum.
- Förbered lösning I genom att tillsätta 0,2 μg Dup51 eller Dup51p reporterplasmid, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 eller pNS6U1-5a plasmid och 100 μL transfektmedel i ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Förbered en huvudblandning av Lösning II för att alla prover ska transfekteras genom att tillsätta 100 μL transfekteringsmedium och 4,0 μL transfekteringsreagens per prov.
- Förbered transfektblandningen genom att tillsätta 100 μL lösning II i varje mikrocentrifugerör som innehåller lösning I.
- Vortex transfektblandningarna i 15 s, centrifugera i en bordsmikrocentrifuge vid 3 000 x g i 10 s vid RT och inkubera sedan vid RT i 5 min.
- Tillsätt alla 200 μL av transfektblandningen i en brunn på HeLa-cellplattan med 12 brunn för att uppnå en slutlig volym på 1,0 ml per brunn och inkubera plattan vid 37 °C i 48 timmar.
- Efter inkubation, extrahera RNA från de transfected HeLa celler med kommersiellt tillgängliga guanidin tiocyanat och fenol lösning.
OBS: Detta reagens innehåller fenol och detta steg ska utföras i en rökhuv. Användning av DEPC-behandlat vatten rekommenderas för resuspension av extraherat RNA.- Aspirera det förbrukade mediet och tillsätt 500 μL av reagenset i varje brunn. Inkubera på RT i 5 min.
- Homogenisera genom pipettering upp och ner. Överför sedan lösningen till ett nytt 1,5 mL microcentrifuge-rör.
- Tillsätt 100 μL kloroform och virvel i 15 s.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 15 min på RT.
- Överför 200 μL av RNA som innehåller, topp vattenskikt till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Tillsätt 2 μg glykogen och 200 μL isopropanol till varje RNA-prov. Blanda genom att invertera rören.
- Samla upp RNA-fällningen genom centrifugering vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort och kassera supernatanten utan att störa RNA-pelleten.
- Tvätta pelleten två gånger genom att tillsätta 1,0 ml 70 % etanol, invertera rören och centrifugera enligt beskrivningen i steg 2.13.7.
- Lufttorka pelleten i ~10-20 min vid RT och återanvänd RNA i 10-20 μL RNase-fritt vatten.
- Bestäm RNA-koncentrationen genom att mäta absorbans vid 260 nm enligt Desjardins och Conklin9.
- Fortsätt med primerförlängning eller lagra RNA-prover i -20 °C. Isolerat RNA kan förvaras vid -20 °C i 6-12 månader.
3. 32P-märkning av oligonukleotider
OBS: Åtgärder som inbegriper användning av 32P-ATP och 32P-märkta oligonukleotider måste utföras bakom en akrylsköld av utbildade individer med godkännande från auktoriserade institutionella enheter. Protokollet som beskrivs nedan kan användas för märkning av oligonukleotider, Dup3r och U17-26-R samt markörer för urea-PAGE. Användning av DEPC-behandlat vatten rekommenderas för återpension av oligonukleotider och storlekspärlor.
- Tillsätt oligonukleotid, T4 polynukleotidkinas (T4 PNK), T4 PNK-buffert och 32P-ATP enligt tabell 1 till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör. Tillsätt 32P-ATP sist till blandningen; Detta är viktigt.
OBS: För tillsats av radioaktiva lösningar rekommenderas användning av filterspetsar. - Inkubera i ett vattenbad vid 37 °C i 30 min.
- Medan märkningsreaktionerna inkuberar, återanvänd storleksuteslutning pärlor med en 25 kDa molekylvikt avskuren genom att försiktigt virvla i ~ 10 s.
OBS: Storlekspärlor bör beredas enligt tillverkarens instruktioner och lagras som en 50% suspension i 25% etanol vid 4 °C. - Förbered kolonner genom att överföra 600 μL av de återanvända pärlorna till en engångsminikolonn placerad i ett 1,5 ml uppsamlingsrör och återföra pärlbeståndet till 4 °C.
- Centrifugera vid 2 000 x g i 1 min vid RT och kasta bort flödet.
- Tvätta pärlorna genom att tillsätta 300 μL RNase-fritt vatten till kolonnen.
- Upprepa steg 3.5. och 3.6. två gånger och överför minikolonnen till ett nytt 1,5 ml centrifugrör.
- Tillsätt kinasreaktionsblandningen till ghädkolonnen och centrifugera vid 5000 x g i 1 min vid RT.
- Samla och spara flödet genom, som har den 32P-märkta oligonukleotid, och kassera alla tips och rör i en akrylavfallslåda.
- Tillsätt 20 μL RNase-fritt vatten för att späda ut 32P-märkt oligonukleotid till en slutlig koncentration av 2,5 μM.
OBS: Späd ut de märkta markörerna efter behov för lastning på urea-PAGE geler. - Förvara den märkta oligonukleotiden i en akrylmikrorörslåda vid -20 °C eller fortsätt med primerförlängningsanalys.
4. Analys av de skarvade reporterutskrifterna genom primerförlängning
OBS: Det rekommenderas att rengöra ytor och utrustning med ett RNase-inaktiverande reagens före användning.
- Tillsätt 2,0 μg RNA som extraherats från Hela-cellerna i separata 200 μL mikrocentrifugerör och tillsätt RNase-fritt vatten för att utgöra volymen till 6,55 μL.
- Förbered Master Mix I med de utspädda 32P-Dup3r och dNTPs som visas i tabell 2 och tillsätt 0,9 μL av blandningen till varje PCR-rör som innehåller RNA-prover.
- Inkubera rören, först vid 65 °C i 5 min och sedan på is i 1 min.
- Förbered Master Mix II med 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase inhibitor och omvänd transkriptas enligt tabell 2.
- Tillsätt 2,55 μL av blandningen till varje rör som innehåller RNA och Master Mix 1; Den totala reaktionsvolymen ska vara 10 μL. Håll rören vid RT i 10 minuter.
- Överför rören till ett torrt bad eller en termisk cykelcyklist och inkubera, först vid 50 °C i 60 min och sedan vid 70 °C i 15 min.
- Efter inkubation tillsätt 10 μL 2x formamid RNA-laddningsfärg till varje prov och förvara i en akryllåda vid -20 °C eller fortsätt med separationen av fragment genom urea-PAGE med en 14 cm lång gel och visualisering av gelbilden enligt beskrivningen nedan i steg 8.
- Utför densitometrisk skanning av gelbilden med en bildanalysprogramvara och använd bandintensiteterna för inkluderade och överhoppade produkter för att beräkna procentandelen exon 2-inkludering enligt nedan.
5. Analys av de skarvade reporterutskrifterna av fluorescerande RT-PCR
OBS: I DEN RT-PCR-analys som beskrivs nedan används slumpmässiga hexamerer för cDNA-syntes och en kombination av omärkta Dup8f- och Cy5-märkta Dup3r-oligonukleotider för PCR-förstärkning av de skarvade produkterna.
- För cDNA-syntes, tillsätt 2,0 μg RNA som extraherats från de transfekterade Hela-cellerna i separata 200 μL mikrocentrifugerör och tillsätt RNase-fritt vatten för att utgöra volymen till 11,0 μL.
- Förbered Master Mix I, som innehåller slumpmässiga hexamerer och dNTP enligt tabell 3 och tillsätt 2,0 μL av blandningen till varje prov. Inkubera, först vid 65 °C i 5 min sedan på is i 1 min.
- Förbered Master Mix II, innehållande First Strand Buffer, RNase inhibitor, DTT, och omvänd transkriptas enligt tabell 3 och tillsätt 7,0 μL av blandningen till varje rör som innehåller RNA och Master Mix I.
- Håll rören på RT i 10 min och inkubera sedan vid 50 °C i 60 min och 70 °C i 15 min.
OBS: Slutförda cDNA-reaktioner kan lagras vid -20 °C. - För PCR överför du 1,0 μL (100 ng/μL) av varje cDNA-prov till nya PCR-rör.
- Förbered en huvudblandning bestående av Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq-buffert, Taq-polymeras och vatten enligt beskrivningen i tabell 4 och tillsätt 11,5 μL av blandningen till varje rör som innehåller cDNA.
- Utför PCR med en termisk cyklist med ett första denatureringssteg vid 94 °C i 3 minuter; följt av 20 cykler av denaturering (94 °C för 30 s), glödgning (65 °C för 30 s) och förlängning (72 °C för 15 s) och ett avslutningssteg vid 72 °C i 5 min.
- Tillsätt 12,5 μL 2x formamid-DNA-belastningsfärg till varje rör och värm vid 95 °C i 5 minuter.
- Förvara PCR-reaktionen vid -20 °C eller fortsätt med urea-PAGE enligt beskrivningen nedan i steg 8.1-8.4.
- Efter elektrofores, ta bort glasplattorna från elektroforesapparaten och skanna med hjälp av en fluorescensbildare för att visualisera gelén.
- Utför densitometrisk skanning av gelbilden och använd bandintensiteten hos de inkluderade och de överhoppade produkterna för att beräkna procentandelen exon 2-inklusion enligt beskrivningen i steg 4.8.
6. Analys av variant U1 snRNA uttryck genom primer förlängning
- Tillsätt 2,0 μg RNA som extraherats från Hela-cellerna i separata 200 μL mikrocentrifugerör och tillsätt RNase-fritt vatten för att utgöra volymen till 4,325 μL och tillsätt sedan dATP, som visas i tabell 5.
- Tillsätt 10 000 CPM av 32P-U17-26-R oligonukleotid till varje rör.
OBS: För att förbereda en 10 000 cpm/μL-lösning på 32P-U17-26-R (från steg 3), späda ut den märkta oligonukleotid (1:20 utspädning), bestäm cpm i 1,0 μL med hjälp av en scintillationsräknare och späd ytterligare med avjoniserat vatten för att förbereda en lösning på 10 000 cpm/μL i ett nytt 1,00 cpm/μL. - Inkubera vid 65 °C i 5 minuter och sedan på is i 1 min.
- Förbered en huvudblandning med 5x First Strand Buffer, RNase inhibitor, DTT och omvänd transkriptas enligt tabell 5 och tillsätt 1,8 μL av blandningen till varje prov.
- Inkubera, först vid RT i 10 min och sedan vid 42 °C i 10 min.
- Efter inkubation tillsätt 10 μL 2x formamid RNA-lastfärg i varje prov och förvara i en akryllåda vid -20 °C eller fortsätt med separation av fragment med urea-PAGE med en 38 cm lång gel (se steg 8).
7. Analys av variant U1 snRNA uttryck av RT-qPCR
- Späd ut cDNA-beståndet som beretts enligt beskrivningen ovan i steg 5.1 - 5.4 till en koncentration av 0,2 ng/μL.
- Pipetter 5,0 μL utspädd cDNA i enskilda brunnar på en 96-well qPCR-platta i tre exemplar. Tillsätt avjoniserat vatten i stället för cDNA för ingen mallkontroll (NTC).
- Förbered två separata primerblandningar bestående av fram- och bakåtprimrar för U1- och U2-snRNAs och vatten som visas i tabell 6.
OBS: Sekvenser för U1- och U2 snRNA-specifika primers finns i tabell 7. - Tillsätt 5,0 μL av U1- och U2 snRNA-primerblandningen till provet och NTC-brunnarna.
- Tillsätt 10,0 μL PCR-blandning i realtid till varje brunn.
- Försegla plattorna med en optisk film och centrifugera sedan vid 1 000 x g i 2 min vid RT för att samla reaktionerna på brunnarnas botten.
- Utför qPCR med ett första denatureringssteg vid 95 °C i 10 minuter, följt av 40 cykler av ett 2-stegsprotokoll bestående av denaturering (95 °C för 15 s) och glödgning/förlängning (62 °C för 60 s) samtidigt som tröskelvärdena för kvantifieringscykel (Cq) för målamlikoner samlas in.
- Avsluta qPCR-reaktionen genom att kontrollera om det finns en enda topp i dissociationskurvan för U1- och U2-snRNA-reaktioner.
- Beräkna delta Cq (ΔCq) för U1- och U2-snRNAs jämfört med pcDNA-kontrollen från Cq-värdena (ΔCq).
- Bestäm varianten U1 snRNA-uttryck som relativ kvantitet (RQ) av U1 jämfört med U2 med hjälp av ΔΔCq-värdet enligt nedan för alla prover.
8. Installation och drift av Urea-PAGE geler
OBS: Montering av glasplattor och gelens löpapparat ska utföras enligt tillverkarens instruktioner. Gjutningen av 10% urea-PAGE gel kan utföras enligt ett tidigare beskrivet protokoll av Summer et al.10. Steg som involverar beredning av markörer och prover samt av löpning och visualisering av geler beskrivs nedan. Alternativt, för att förhindra att gelén fastnar på glasplattor, kan den inre ytan beläggas med silikonlösning genom att tillsätta 1 ml av lösningen på ytan och jämnt sprida sig över hela ytan med vävnad. När plattorna är torra ska de tvättas med avjoniserat vatten och torkas igen.
VARNING: Unpolymerized akrylamid är neurotoxisk och måste hanteras med skydd som rekommenderas i materialets säkerhetsdatablad.
- Förbered primerförlängningsproverna och markörerna genom uppvärmning vid 95 °C i 5 minuter och centrifugera sedan i en bordsmikrocentrifuge vid 3 000 x g för 5 s vid RT.
- Innan du laddar markörer och prover, spola ut brunnarna med 1x TBE-buffert för att ta bort den sedimenterade urea.
- Ladda 10 μL/prov/brunn och kör gelén vid 300-500V i 2-3 timmar eller tills xylencyanol når botten.
OBS: Cirka 1 000 cpm av den 32P-märkta markören kan laddas. - Efter elektrofores, ta bort glasplattorna från elektroforesapparaten.
- Separera försiktigt de två plattorna så att gelén ligger platt på någon av glasytorna och överför gelén till ett filterpapper och täck den med plastfolie.
- Dammsug gelén på filterpapperet vid 80 °C i 30 minuter med en geltork.
- Placera den torkade gelen i en fosforavbildningskassett och förvara den på RT över natten.
OBS: Fosforskärmen ska raderas med hjälp av en ljuslåda före användning. - För att visualisera gelbilden, ta bort skärmen och skanna med en fosforbildare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skarva reportern Dup51, en tre exon-två intron minigene, härleddes från den mänskliga β-globin genen och har beskrivits tidigare (figur 1A)11,12 . Vi skapade en mutant reporter, Dup51p, genom att införa Usher syndrom associerade 5's-skarv webbplats mutationer som förekommer i exon 3 av protocadherin 15 (PCDH15) genen13. 5's-skarv plats sekvensen vid exon 2-intron 2 korsningen ändrades från CAG/GUUGGUAUC till AUG/GUGUGUAUC (/ är exon-intron gränsen) (figur 1B)14. Dessa sekvensförändringar ändrar det förväntade mönstret för 5's-skarv plats basepairing med den endogena U1 snRNA och resulterar också i hoppning av exon 2 i den mogna transkriptionen (figur 2). Effekten av dessa mutationer kan undertryckas av en kompensatorisk förändring i 5'-regionen av U1 snRNA. Substitution av uracil med adenin vid den 5: e positionen av U1 snRNA (U1-5a) omvänd effekten av 5's-skarv plats mutationer i Dup51p (figur 1B).
Skarvningen av dup51- och Dup51p-transkripten kan övervakas genom primerförlängning med hjälp av 32P-Dup3r eller med semikvantiakvativ RT-PCR med dup8f och dup3r oligonukleotider (figur 1). sekvenser anges i tabell 7. När dup51-minigenen uttrycks i HeLa-celler uttrycker den mogna fullängdsavskriften där exon 2 skarvars in effektivt (figur 2A, B, körfält 1). Mutationerna på 5-skarvstället i Dup51p minskar exon 2-inkluderingen från ~ 95% till ~ 30%, vilket leder till bildandet av den kortare transkriptionen (lane 5). Coexpression av Dup51p med U1-5a snRNA räddar exon 2 splitsning och återställer bildandet av fullängds transkription (lane 8). Coexpression med wildtype U1 (U1-WT) eller U1-5g variant har inte en liknande effekt på Dup51p splitsning (körfält 6 och 7). U1-WT, U1-5g eller U1-5a coexpression ändrar inte heller skarvningsmönstret för Dup51-reportern (körfält 2-4). Sammantaget tyder dessa resultat på att räddningen av exon 2 skarvning i Dup51p transkriptioner beror specifikt på U>A mutationen i U1-5a snRNA.
För att övervaka uttrycket av transfected U1 snRNAs kan primer extension eller RT-qPCR tillämpas. Detektion av U1-5a variant transkriptioner med primer förlängning använder U17-26 oligonukleotid, som är 20 nukleotider lång och basepairs nära adenin vid den 5: e positionen av U1 snRNA (figur 3A). I närvaro av dATP ensam tillåter U17-26 införlivande av 2-3 nukleotider för den endogena wildtypen U1 snRNA som ger 22 eller 23 nukleotider lång produkt (figur 3B, körfält 1, 2, 5 och 6). För U1-5a- och U1-5g-varianterna upphör förlängningen efter tillsats av en enda adenosin som producerar en 21 nukleotider lång produkt (körfält 3, 4, 7 och 8). Analys av RT-qPCR gör det möjligt att uppskatta vikning ökning i uttryck av varianten U1 över den endogena wildtype snRNA. Här är U1-specifika primerpar utformade så att det inte finns någon överlappning med de mutationer som införs i varianten snRNAs (figur 3A). Efter normalisering till U2 snRNA uttryck, transfected U1-WT och U1-5g och U1-5a varianter konstaterades att uttryckas vid 3-5 veck över den endogena snRNA (figur 3C). Endogen U1 beräknas finnas vid 106 kopior per cell i HeLa-celler15. Således uttrycks den exogena varianten snRNAs vid ~ 3-5 gånger över den endogena U1. Förmågan hos U1-5a snRNA att rädda exon 2 inkludering till ~ 95% visar att nivåerna av exogena variant snRNAs är tillräckliga för skarvning av de gryende reporter transkript.
| Ingredienser | Belopp för en reaktion |
| PNK-buffert (10x) | 2.0 μL |
| T4 Polynukleotidkinas (T4 PNK) (10 000 U/mL) | 1.0 μL |
| Oligonukleotid* (10 μM) | 10.0 μL |
| 32 P-ATP (10 mM) | 1.0 μL |
| H2O (DEPC behandlas) | 6.0 μL |
| *För märkningsmarkörer används 0,5 μL av pBR322 DNA-MspI Digest eller Låg molekylviktsmarkören. | |
Tabell 1: 32P-märkning av oligonukleotider. Reaktion för beredning av en 5′-32P-märkt primer med 32P-ATP.
| Ingredienser - Master Mix I | Belopp för en reaktion |
| RNA och H2O (DEPC behandlas) | 6.55 μL |
| 32 P-Dup3r (2,5 μM) | 0,4 μL |
| dNTP (10 mM) | 0,5 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Belopp för en reaktion |
| Första-strängbuffert (5x) | 2.00 μL |
| RNashämmare (40 U/μL) | 0.25 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,05 μL |
| Omvänd transkriptas (RT) (200U/μL) | 0.25 μL |
Tabell 2: 32P-Dup3r primer förlängning. Reaktion för analys av skarvade reporter transkriptioner av primer förlängning.
| Ingredienser - Master Mix I | Belopp för en reaktion |
| RNA och ddH2O (DEPC behandlas) | 11.0 μL |
| Slumpmässig hexamer (50 ng/μL) | 1.0 μL |
| dNTP (10 mM) | 1.0 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Belopp för en reaktion |
| Första-strängbuffert (5x) | 4.0 μL |
| RNashämmare (40 U/μL) | 1.0 μL |
| DTT (0,1 M) | 1.0 μL |
| Omvänd transkriptas (RT) (200U/μL) | 1.0 μL |
Tabell 3: cDNA-syntes. Reaktion för syntesen av cDNA från totalt RNA.
| Ingredienser | Belopp för en reaktion |
| cDNA-mall (100 ng/μL) | 1.00 μL |
| Framåt Primer (Dup8f) (10 μM) | 0.25 μL |
| Cy5 Omvänd primer (Cy5-Dup3r) (10 μM) | 0.25 μL |
| dNTP (10 μM) | 0.25 μL |
| Taq-buffert (10x) | 1.25 μL |
| Taq DNA-polymeras (5000 U/ml) | 0.25 μL |
| H2O (DEPC behandlas) | 9.25 μL |
Tabell 4: Fluorescerande RT-PCR. Reaktion för analysen av de skarvade reporter transkriptionerna av RT-PCR med Cy5-märkt primer.
| Ingredienser | Belopp för en reaktion |
| RNA och H2O (DEPC behandlas) | 4.325 μL |
| dATP (10 mM) | 0.375 μL |
| 32 P-U17-26-R oligo nukleotid* | 1.000 μL |
| Ingredienser – Master Mix | Belopp för en reaktion |
| Första-strängbuffert (5x) | 1,5 μL |
| RNashämmare (40 U/μL) | 0,1 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,1 μL |
| Omvänd transkriptas (RT) (200U/μL) | 0,1 μL |
| *10 000 CPM av 32P-U17-26-R oligonukleotid ska tillsättas till det utspädda RNA (steg 6.2.). | |
Tabell 5: 32P-U1-snRNA primer förlängning. Reaktion för analys av variant U1 snRNA uttryck genom primer förlängning.
| Ingredienser | Belopp för en reaktion |
| PCR-blandning i realtid | 10.0 μL |
| cDNA (0,2 ng/μL) | 5.0 μL |
| Framåt Primer (10 μM) | 0,2 μL |
| Omvänd primer (10 μM) | 0,2 μL |
| H2O (DEPC behandlas) | 4.6 μL |
Tabell 6: Kvantitativ RT-qPCR. Reaktioner för kvantitativ analys av variant U1 snRNA uttryck av RT-qPCR.
| Oligo namn | Sekvens (5′ till 3′) | Teknik |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | Fluorescerande RT-PCR |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Fluorescerande RT-PCR |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Primer förlängning |
| U17-26R | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Primer förlängning |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80R | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84R | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
Tabell 7: Sekvens av oligonukleotider. Lista över primernamn, sekvenser och tekniken som primers användes för.
Figur 1: Dup51 och Dup51p Minigene Reportrar. (A) Schematisk representation av de tre-exon/två-intron minigene reportrar, Dup51 och Dup51p. Platser för Dup8f och Dup3r i exons 1 respektive 3 anges. (B) Förväntad basepairing av wildtype U1 snRNA och U1-5a varianten med 5's-skarva webbplatssekvenser av Dup51 och Dup51p reporter transkriptioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Analys av skarvade reporterutskrifter. HeLa celler var cotransfected med Dup51 eller Dup51p minigene plasmider och pcDNA kontroll eller pNS6U1 plasmider för U1-WT, U1-5g eller U1-5a snRNAs. (A) Primer förlängningsanalys med 32P-märkt Dup3r primer som visar skarvningen av Dup51 och Dup51p minigene transkriptioner. MRNA-produkterna anges till vänster om gelbilden. Procentandelen av produkten i full längd (± s.d., n = 3) beräknades utifrån bandintensiteter hos de två mRNA-isoformerna och representeras i diagrammen nedan. (B) RT-PCR-analys med Dup8f- och Cy5-Dup3r-primers på cDNA framställda från totalt RNA som extraherats från HeLa-celler som visar skarvning av dup51- eller Dup51p-minigene-transkriptionerna. MRNA-produkterna anges till vänster om gelbilden. Procentandelen av produkten i full längd (± s.d., n = 3) beräknades utifrån bandintensiteter hos de två mRNA-isoformerna och representeras i diagrammen nedan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Analys av varianten U1-5a snRNA. HeLa celler var cotransfected med Dup51 eller Dup51p minigene plasmider och pcDNA kontroll eller pNS6U1 plasmider för U1-WT, U1-5g eller U1-5a snRNAs. (A) En tvådimensionell representation av U1 snRNA-sekvensen. Positionen för U17-26R primer, som används för primer förlängning analys av U1 snRNA, indikeras av den röda linjen. Positionen för U1/17-39F och U1/58-80R primers, som används för RT-qPCR av U1 snRNA, indikeras av de blå linjerna. (B) Primer förlängningsanalys med 32P-märkt U17-26 för att upptäcka uttrycket av wildtype U1 snRNA och U1-5g och U1-5a varianter. Positioner för de produkter som bildas av U1-WT och varianterna snRNAs anges. C) RT-qPCR-analys av nivåerna av U1 snRNA-uttryck i hela celler. Foldförändringen i U1-snRNA-uttryck beräknades i förhållande till pcDNA negativ kontroll och normaliseras till U2-snRNA, vikförändring (± s.d.; n = 3) i U1 är graferad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen kan anpassas för skarvningsanalys i andra cellinjer än HeLa, men faktorer som påverkar transfekteringseffektiviteten, såsom cellkonfluens och mängden DNA kan behöva optimeras. Konstruktionsförhållandet reporter till U1 är en annan kritisk parameter som kan behöva bestämmas beroende på de uttrycksnivåer som observerats i andra celltyper. Kvaliteten på extraherat RNA är avgörande för skarvningsanalys; Därför rekommenderas starkt användning av RNase-fritt vatten och dekontaminering av ytor med RNase-inaktiveringsmedel.
Analys av reporter transkript av antingen primer förlängning eller fluorescerande RT-PCR ger liknande resultat, därför kan antingen tekniken användas för att övervaka förändringar i införandet av exon 2 i den mogna transkriptionen. Den fluorescerande PCR-reaktionen måste stoppas och kvantifieras i den exponentiella fasen av förstärkning, som är beroende av den ursprungliga RNA-koncentrationen. Således kan antalet förstärkningscykler behöva bestämmas för analyser med olika transfektioner än de som beskrivs här. Användarvänligheten på grund av den icke-radioaktiva naturen är en fördel med RT-PCR-analysen. Även om primerförlängning med radioaktivt märkt primer kräver extra säkerhetsåtgärder, kan den upptäcka signaler från en låg mängd RNA. Det låga genomströmningen av primerförlängning och RT-PCR är en begränsning av denna analys.
U1 snRNP komplementeringsanalys har använts för flera ändamål. Förutom att vända effekterna av 5's-skarv webbplats mutationer, U1 snRNAs bär förändringar i 5'-regionen har tillämpats för gen ljuddäsning och för att studera splitsning mekanismer. Fortes et al. visade att inriktning på U1 snRNAs till terminal exons av endogena transkriptioner effektivt kan hämma genuttryck16. använde U1-komplementeringen för att studera de icke-kanoniska mekanismerna för 5:s skarvplatsigenkänning och visade att U1 snRNA kan basepair till 5'splice platser i ett alternativt register där basepairing skiftas av en nukleotid och även i "utbuktningsregister" där utbuktade nukleotider finns i antingen pre-mRNA eller snRNA17, 18. Detta reportersystem kan potentiellt användas för att studera U1 snRNP: s roll i skarvning av modulering av små molekyler och skarvning av reglerande proteiner. Genom att ersätta exon 2 av Dup51p med en målexon kan analysen tillämpas för att undersöka verkningsmekanismen hos små molekyler som är kända för att förbättra eller undertrycka skarvning av specifika exoner, som vid skarvbytesföreningar19. Genom att införliva reglerande sekvenser för alternativa splitsningsfaktorer i exons eller introner bör det vara möjligt att undersöka U1-beroendet av skarvningsreglering. Detta koncept tillämpades av Hamid et al. för att visa att stamslingan 4 av U1 snRNA var inblandad i skarvningsregleringen av polypyrimidinbindningsproteinet 120. Vi har använt denna analys för att studera funktionerna hos stamslingorna 3 och 4 i U1 snRNA. Genom att införliva mutationer i stam-loopen av suppressorn U1-5a snRNA som aktiverar en mutant 5's-skarv plats i Dup51p splitsning reporter, har vi identifierat deras kritiska roller i bildandet av cross intron kontakter med U2 snRNP specifika protein SF3A1 i de tidiga stegen av splitseosome montering14,21. Således fungerar tre-exon två-intron Dup51 reporter som ett adaptivt verktyg för övervakning splitsning effektivitet i studier om mekanismer bakom spliteosome montering och splitsning-associerade sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel till S.S. från National Institutes of Health (R21CA170786 och R01GM127464) och American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) och till S.S. och W.M. från Valley Research Partnership Program (P1-4009 och VRP77). Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
