Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante l'espressione genica, la fase vitale dello splicing pre-mRNA comporta un riconoscimento accurato dei siti di giunzione e un assemblaggio efficiente di complessi spliceosomiali per unire gli esoni e rimuovere gli introni prima dell'esportazione citoplasmatica dell'mRNA maturo. L'efficienza dello splicing può essere alterata dalla presenza di mutazioni nei siti di giunzione, dall'influenza di fattori di splicing trans-agenti o dall'attività terapeutica. Qui, descriviamo il protocollo per un test cellulare che può essere applicato per monitorare l'efficienza di giunzione di un dato esone. Il test utilizza un reporter minigene plasmidico codificato plasmidico 3-esone/2-introne adattabile, che può essere espresso in cellule di mammifero mediante trasfezione transitoria. Dopo la trasfezione, l'RNA cellulare totale viene isolato e l'efficienza dello splicing dell'esone nell'mRNA reporter è determinata dall'estensione del primer o dalla reazione a catena semi-quantitativa della trascrittasi-polimerasi inversa (RT-PCR). Descriviamo come l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′ associate alla malattia può essere determinato introducendole nel reporter; e come la soppressione di queste mutazioni può essere ottenuta mediante co-trasfezione con il piccolo costrutto di RNA nucleare U1 (snRNA) che porta mutazioni compensatorie nella sua regione 5′ che le parti base con i siti di giunzione 5′-giunzione alle giunzioni esone-introne nei pre-mRNA. Pertanto, il reporter può essere utilizzato per la progettazione di particelle U1 terapeutiche per migliorare il riconoscimento dei siti di giunzione 5′ mutanti. L'inserimento di siti regolatori ad azione cis, come il potenziatore di splicing o le sequenze di silenziatori, nel reporter può anche essere utilizzato per esaminare il ruolo dell'U1 snRNP nella regolazione mediata da uno specifico fattore di splicing alternativo. Infine, le cellule che esprimono reporter possono essere incubate con piccole molecole per determinare l'effetto di potenziali terapie sullo splicing costitutivo pre-mRNA o su esoni portatori di siti di giunzione 5′ mutanti. Nel complesso, il test reporter può essere applicato per monitorare l'efficienza dello splicing in una varietà di condizioni per studiare i meccanismi fondamentali di splicing e le malattie associate allo splicing.
Introduzione
Lo splicing pre-mRNA è una fase di elaborazione essenziale che rimuove gli introni non codificanti e lega precisamente gli esoni codificanti per formare mRNA maturo. Il riconoscimento delle sequenze di consenso alle giunzioni esone-introne, denominate sito di giunzione 5′ e sito di giunzione 3′, da parte dei componenti del macchinario di giunzione avvia il processo di giunzione. La piccola ribonucleoproteina nucleare U1 (snRNP) riconosce il sito di giunzione 5′ mediante accoppiamento di basi dello snRNA U1 al pre-mRNA1. Le mutazioni geneticamente ereditate che alterano le sequenze del sito di g....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Reagenti e tamponi
NOTA: tutta la sterilizzazione con filtri a vuoto deve essere eseguita con membrana di polietersolfone (PES) da 0,2 μm in un armadio di biosicurezza.
- Preparare acqua priva di RNasi aggiungendo 1,0 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) a 1,0 L di acqua deionizzata, mescolare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (RT), autoclave due volte e quindi raffreddare a RT prima dell'uso.
- Preparare Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mescolando un pacchetto di polvere DMEM (13,4 g), 3,7 g di bicarbonato di sodio, 100 ml di siero bovino fetale (FBS), penicillina e streptomicina a ~ 800 ml di acqua deionizzata ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il reporter di splicing Dup51, un minigene di tre esoni-due introni, è stato derivato dal gene umano β-globina ed è stato descritto in precedenza (Figura 1A) 11,12 . Abbiamo creato un reporter mutante, Dup51p, introducendo mutazioni del sito di giunzione associate alla sindrome di Usher che si verificano nell'esone 3 del gene protocadherina 15 (PCDH15)13. La sequenza del sito di giunzione 5'-giunzione.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il test può essere adattato per l'analisi di splicing in linee cellulari diverse da HeLa, tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare i fattori che influenzano l'efficienza della trasfezione, come la confluenza cellulare e la quantità di DNA. Il rapporto tra il costruttore reporter e U1 è un altro parametro critico che potrebbe dover essere determinato in base ai livelli di espressione osservati in altri tipi di cellule. La qualità dell'RNA estratto è fondamentale per l'analisi dello splicing; pertanto, l'uso di acq.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi a S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall'American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) e a S.S. e W.M. dal Valley Research Partnership Program (P1-4009 e VRP77). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua deionizzata di grado reagente | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Pirocarbonato di dietil (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Pacchetto di polvere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | |
| Bicarbonato di sodio | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Siero fetale bovino (FBS), Fonte australiana, inattivato a caldo | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| soluzione standard 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| , certificato ACS Plus, dal 36,5 al 38,0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Filtri monouso per bottiglie in PES | ThermoFisher Scientific FB12566510 | ||
| EDTA Sale disodico diidrato | Amresco | 0105-2,5 kg | |
| 2,5% tripsina (10x), senza rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Bioreagente | BP358-212 | |
| Cloruro di potassio | Fisher Bioreagente | BP366-1 | |
| Disodico Idrogeno Fosfato Eptaidrato | Fisher Bioreagente | BP332-1 | |
| Potassio Diidrogeno Fosfato Fisher | Bioreagente | Fisher BP362-1 | |
| Terreno di trasfezione - Opti-MEM& trade; I Siero a ridotto contenuto di terreno, senza rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Reagente di trasfezione - Lipofectamina™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagente | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| cloroformio (circa 0,75% etanolo come conservante/biologia molecolare) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| etanolo, assoluto (200 proof), grado di biologia molecolare, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| isopropanolo, grado di biologia molecolare, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glicogeno (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Piombo, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polinucleotide chinasi | New England Biolabs | M0201L | |
| Esclusione dimensionale - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Mini colonne di esclusione dimensionale | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Marcatore a basso peso molecolare, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Reagenti inattivanti Rnasi - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM cad.) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Inibitore della ribonucleasi ricombinante | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Trascrittasi inversa - M-MLV Trascrittasi inversa | ThermoFisher Scientific | 28025013 | utilizzato per l'estensione del primer |
| Taq DNA polimerasi | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Esameri casuali (50 µ M) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Miscela per PCR in tempo reale - SYBR™ Seleziona Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Trascrittasi inversa | ThermoFisher Scientific | 18080093 | utilizzato per la preparazione del cDNA |
| Ditiotreitolo (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Filament Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥ 99,5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Revisione delle schede di sicurezza dei materiali |
| Bromofenolo Sale sodico blu | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xilene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (cristalli bianchi o polvere cristallina/Biologia molecolare) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Acido borico (cristallino/ Elettroforesi) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrilammide: Bis-acrilammide 19:1 (soluzione al 40%/elettroforesi) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Revisione Schede di sicurezza dei materiali |
| Urea (cristalli da incolori a bianchi o polvere cristallina/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Perossidisolfato di ammonio (APS) ≥ 98%, Pro-Pure, grado proteomico | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) ≥ 99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Recensione Schede di sicurezza dei materiali |
| Sistemi di gel per lastre regolabili, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Set di piastre in vetro, 16,5 x 14,5 cm | VWR | NGP-125NR | |
| Verticale Gel Wrap™ Set di piastre in vetro, 16,5 x 22,0 cm | VWR | NGP-200NR | |
| Verticale Gel Wrap™ Set di lastre di vetro, 16,5 x 38,7 cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Schermi al fosforo di stoccaggio | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ Imager biomolecolare FLA 7000 | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Contatore a scintillazione liquida | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Sistemi di PCR in tempo reale | ThermoFisher Scientific |
Riferimenti
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
