Summary
该协议描述了一种微型基因报告基因检测，用于监测5'-剪接位点突变对剪接的影响，并开发抑制因子U1 snRNA以挽救突变诱导的剪接抑制。报告基因和抑制子U1 snRNA构建体在HeLa细胞中表达，并通过引物延伸或RT-PCR分析剪接。
Abstract
在基因表达过程中，前mRNA剪接的关键步骤涉及精确识别剪接位点和高效组装剪接体复合物，以在成熟mRNA的细胞质输出之前加入外显子并去除内含子。剪接效率可以通过剪接位点突变的存在，反式剪接因子的影响或治疗活性来改变。在这里，我们描述了可用于监测任何给定外显子的剪接效率的细胞测定方案。该测定使用适应性强的质粒编码为3-外显子/2-内含子的微型基因报告基因，可通过瞬时转染在哺乳动物细胞中表达。转染后，分离总细胞RNA，并通过引物延伸或半定量逆转录酶 - 聚合酶链反应（RT-PCR）确定报告mRNA中外显子剪接的效率。我们描述了如何通过在报告中引入疾病相关的5′剪接位点突变来确定其影响;以及如何通过与U1小核RNA（snRNA）构建体共转染来实现这些突变的抑制，该构建体在其5'区域中携带代偿性突变，该区域与前mRNA中外显子 - 内含子连接处的5'-剪接位点基本配对。因此，报告基因可用于设计治疗性U1颗粒，以提高对突变体5′剪接位点的识别。将 顺式作用调节位点（例如剪接增强剂或消音器序列）插入报告程序中也可用于检查U1 snRNP在由特定替代剪接因子介导的调节中的作用。最后，将报告细胞与小分子孵育，以确定潜在疗法对组成前mRNA剪接或携带突变5′剪接位点的外显子的影响。总体而言，报告基因检测可用于监测各种条件下的剪接效率，以研究基本的剪接机制和剪接相关疾病。
Introduction
前mRNA剪接是一个重要的处理步骤，它去除非编码内含子并精确地标记编码外显子以形成成熟的mRNA。通过剪接机械的组件识别外显子-内含子交界处的共识序列，称为5'-拼接位点和3'-拼接位点，启动拼接过程。U1小核核糖核蛋白（snRNP）通过将U1 snRNA与前mRNA1的碱基配对来识别5'-剪接位点。改变5'-剪接位点序列的遗传突变与许多疾病有关2，3。据预测，U1 snRNA与突变5'-剪接位点的碱基配对的损失会导致异常剪接，这可能会损害受影响转录本的翻译。纠正剪接缺陷的潜在治疗方法包括通过修饰的U1 snRNA在其5'-区域携带代偿核苷酸变化来抑制突变，该区域与5'-剪接位点基本配对。这种修饰的U1 snRNA，也称为外显子特异性U1 snRNA，已被发现可有效逆转剪接缺陷，导致获救的mRNA4，5，6，7，8的蛋白质表达增加。
在这里，我们描述了U1 snRNP补集测定，这是一种基于报告的细胞剪接测定，可以评估5'-ss突变对外显子剪接的影响，也可用于开发修饰的U1 snRNA，以挽救外显子包涵体。我们还提供通过引物延伸和RT-PCR监测剪接报告转录本的方案，以及通过引物延伸和RT-qPCR确定修饰的U1 snRNA的表达的方案。
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Protocol
1. 试剂和缓冲液
注意：所有使用真空过滤器的灭菌都应在生物安全柜中使用0.2μm聚醚砜（PES）膜进行。
- 将1.0 mL焦碳酸二乙酯（DEPC）加入1.0升去离子水中，在室温（RT）下混合至少1小时，高压灭菌两次，然后在使用前冷却至室温，以制备不含RNase的水。
- 通过将一包DMEM粉末（13.4克），3.7克碳酸氢钠，100毫升胎牛血清（FBS），青霉素和链霉素与约800毫升无菌去离子水混合，制备Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）。DMEM中青霉素和链霉素的最终浓度应分别为50 U / mL和50μg/ mL。将pH值调节至7.4，然后用无菌去离子水将体积补足至1.0L。过滤灭菌并储存在4°C。
- 通过加入25.6克七水合氢二钠（Na2HPO4·）制备10x磷酸盐缓冲盐水（10x PBS）7H2O），2克磷酸二氢钾（KH2PO4），2克氯化钾（KCl）和80克氯化钠（NaCl）至800毫升去离子水。混合溶解，使体积达到1.0 L.通过过滤灭菌并储存在4°C。
- 将186.1gNa2•EDTA•2H2 O溶解至~800mL去离子水中，制备0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）。将pH值调节至8.0，然后用无菌去离子水将体积补到1.0L。过滤灭菌并储存在4°C。
- 通过混合100 mL的10x胰蛋白酶（2.5%），2 mL的0.5 M EDTA来制备1x胰蛋白酶-EDTA溶液，并加入1x PBS至1.0 L。在4°C下储存1-2周，或在-20°C下冷冻以长期使用。
- 通过混合14.4 mL甲酰胺和0.6 mL 0.5 M EDTA制备2x甲酰胺DNA / RNA上样染料，最终体积为15 mL。加入溴酚蓝和二甲苯氰醇粉末至终浓度为0.02%，储存于4°C。
注：甲酰胺具有毒性和腐蚀性。阅读材料安全数据表，了解其他安全建议。 - 通过将54.0克三磷酸盐，27.5克硼酸和20毫升0.5米EDTA混合到〜800毫升去离子水中，制备5x Tris /硼酸盐/ EDTA（5x TBE）缓冲液。混合溶解，用去离子水将体积补到1.0L。
- 通过混合200 mL的5x TBE，250 mL的40%19：1双/丙烯酰胺和450.5g尿素来制备尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（尿素-PAGE）溶液。然后加入高达1.0 L的去离子水，混合直到成分完全溶解，然后通过过滤灭菌，并在4°C下储存在琥珀色玻璃瓶中。
注：双/丙烯酰胺有毒。阅读材料安全数据表，了解其他安全程序。 - 通过将1gAPS溶解在10mL去离子水中并储存在4°C下，制备10%过硫酸铵（APS）。
2. HeLa细胞与报告细胞和U1 snRNA质粒共转染
注意：Hela细胞的转染必须在生物安全柜中的无菌条件下进行。所有材料的外表面必须喷洒70%乙醇，然后才能引入生物安全柜。
- 在37°C培养箱中，当细胞汇合约80-90%时，每2-3天传代一次，将Hela细胞维持在DMEM中，其中含有5%CO 2。
- 对于HeLa细胞的传代，吸出用过的培养基，然后在37°C下用3mL含有1mM EDTA的0.25%胰蛋白酶孵育细胞3分钟。
- 孵育后，加入 7 mL 新鲜 DMEM。将细胞悬浮液转移到10mL管中，以1，000× g 离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于10mL新鲜DMEM中，然后将细胞以20%汇合度接种在新的组织培养皿上。
- 对于瞬时转染，用干净的血细胞计数器载玻片计数Hela细胞，并制备密度为2.5×105 个细胞/ mL的悬浮液。
- 将1.0mL的2.5×105 个细胞/ mL Hela细胞悬浮液接种到12孔板的每个孔中，并在37°C下孵育过夜。
- 第二天，吸出用过的培养基，加入0.8毫升新鲜DMEM和血清。
- 通过将0.2μgDup51或Dup51p报告质粒，1.8μgpcDNA，pNS6U1或pNS6U1-5a质粒和100μL转染培养基加入新的1.5mL微量离心管中来制备溶液I。
- 通过为每个样品添加100μL转染培养基和4.0μL转染试剂，为所有要转染的样品制备溶液II的预混液。
- 通过将100μL溶液II加入含有溶液I的每个微量离心管中来制备转染混合物。
- 涡旋转染混合物15 s，在台式微量离心机中以3，000× g 在室温下离心10秒，然后在室温下孵育5分钟。
- 将所有200μL转染混合物加入12孔HeLa细胞板的一个孔中，以达到每孔1.0mL的最终体积，并将板在37°C下孵育48小时。
- 孵育后，用市售的硫氰酸胍和苯酚溶液从转染的HeLa细胞中提取RNA。
注意：该试剂含有苯酚，此步骤应在通风橱中执行。建议使用DEPC处理的水重悬提取的RNA。- 吸出用过的培养基，并将500μL试剂加入每个孔中。室温孵育5分钟。
- 通过上下移液进行均质化。然后将溶液转移到新的1.5mL微量离心管中。
- 加入100μL氯仿和涡旋15秒。
- 在室温下以12，000× g 离心15分钟。
- 将200μL含有RNA的顶部水层转移到新的1.5mL微量离心管中。
- 向每个RNA样品中加入2μg糖原和200μL异丙醇。通过倒置管子混合。
- 通过在4°C下以12，000× g 离心10分钟收集RNA沉淀。
- 除去并丢弃上清液而不干扰RNA沉淀。
- 通过加入1.0mL的70%乙醇，倒置管并按照步骤2.13.7中所述离心，洗涤沉淀两次。
- 在室温下风干沉淀约10-20分钟，并将RNA重悬于10-20μL无RNase水中。
- 通过测量260nm处的吸光度来确定RNA浓度，如Desjardins和Conklin9所述。
- 继续进行引物延伸或将RNA样品储存在-20°C中。 分离的RNA可以在-20°C下储存6-12个月。
3. 寡核苷酸的 32P标记
注：涉及使用 32P-ATP和 32P标记的寡核苷酸的步骤必须由经过认证机构实体批准的训练有素的个人在丙烯酸盾牌后面进行。下面描述的方案可用于标记寡核苷酸，Dup3r和U17-26-R以及尿素-PAGE的标记物。建议使用DEPC处理过的水重悬寡核苷酸和尺寸排阻性珠。
- 在1.5mL微量离心管中，加入寡核苷酸，T4多核苷酸激酶（T4 PNK），T4 PNK缓冲液和32P-ATP，如表1所述。最后加入32P-ATP到混合物中;这很重要。
注意：对于添加放射性溶液，建议使用过滤尖端。 - 在37°C的水浴中孵育30分钟。
- 在标记反应孵育时，通过轻轻涡旋约10 s，重悬分子量为25 kDa的尺寸排阻珠。
注意：尺寸排除珠应根据制造商的说明制备，并在4°C的25%乙醇中作为50%悬浮液储存。 - 通过将600μL重悬的磁珠转移到放置在1.5mL收集管中的一次性迷你柱中并将磁珠储备返回4°C来制备色谱柱。
- 在室温下以2，000× g 离心1分钟，并丢弃流经的流量。
- 通过向色谱柱中加入300μL无RNase水来洗涤珠子。
- 重复步骤 3.5。和 3.6.两次，然后将微型色谱柱转移到新的1.5 mL离心管中。
- 将激酶反应混合物加入尺寸排阻珠柱中，并在室温下以5000× g 离心1分钟。
- 收集并保存流经，其中有 32P标记的寡核苷酸，并将所有尖端和管子丢弃到丙烯酸废物箱中。
- 加入20μL无RNase水，将 32P标记的寡核苷酸稀释至2.5μM的终浓度。
注意：根据需要稀释标记的标记物，以便加载到尿素-PAGE凝胶上。 - 将标记的寡核苷酸储存在-20°C的丙烯酸微管盒中，或继续进行引物延伸分析。
4. 通过引物延伸分析拼接的报告者成绩单
注意：建议在使用前使用RNase灭活试剂清洁表面和设备。
- 将从Hela细胞中提取的2.0μgRNA加入单独的200μL微量离心管中，并加入不含RNase的水以构成6.55μL的体积。
- 如表2所示，用稀释的32P-Dup3r和dNTPs制备预混液I，并将0.9μL混合物加入到每个含有RNA样品的PCR管中。
- 孵育管，首先在65°C下孵育5分钟，然后在冰上孵育1分钟。
- 用5x第一链缓冲液，二硫舒菌醇（DTT），RNase抑制剂和逆转录酶制备预混液II，如 表2所示。
- 向含有RNA的每个管中加入2.55μL混合物和预混液1;反应的总体积应为10μL.将试管在室温下保持10分钟。
- 将管转移到干浴或热循环仪中并孵育，首先在50°C下孵育60分钟，然后在70°C下孵育15分钟。
- 孵育后，向每个样品中加入10μL2x甲酰胺RNA上样染料，并储存在-20°C的丙烯酸盒中，或使用14cm长的凝胶继续通过尿素-PAGE分离片段，并可视化凝胶图像，如下所述步骤8中所述。
- 使用图像分析软件对凝胶图像进行密度分析，并使用包含和跳过产品的条带强度来计算外显子2包含的百分比，如下所示。
5. 荧光RT-PCR分析剪接的报告书转录本
注：下文所述的RT-PCR分析使用随机六聚体进行cDNA合成，并使用未标记的Dup8f和Cy5标记的Dup3r寡核苷酸的组合来对剪接产物进行PCR扩增。
- 对于cDNA合成，将从转染的Hela细胞中提取的2.0μgRNA加入单独的200μL微量离心管中，并加入不含RNase的水以构成体积至11.0μL。
- 制备含有随机六聚体和dNTP的预混液I，如 表3 所示，并向每个样品中加入2.0μL混合物。孵育，首先在65°C下孵育5分钟，然后在冰上孵育1分钟。
- 制备含有第一链缓冲液，RNase抑制剂，DTT和逆转录酶的预混液II，如 表3 所示，并向含有RNA和预混液I的每个管中加入7.0μL混合物。
- 将试管在室温下保持10分钟，然后在50°C下孵育60分钟，在70°C下孵育15分钟。
注意：完成的cDNA反应可以储存在-20°C。 - 对于PCR，将每个cDNA样品的1.0μL（100ng / μL）转移到新的PCR管中。
- 如 表4 所述，制备由Dup8f，Cy5-Dup3r，dNTPs，Taq缓冲液，Taq聚合酶和水组成的预混液，并向含有cDNA的每个管中加入11.5μL混合物。
- 使用热循环仪在94°C下进行初始变性步骤进行PCR3分钟;随后进行20个变性循环（94°C持续30秒），退火（65°C持续30秒）和延伸（72°C持续15秒），并在72°C下进行终止步骤5分钟。
- 向每个管中加入12.5μL2x甲酰胺DNA上样染料，并在95°C下加热5分钟。
- 将PCR反应储存在-20°C或按照以下步骤8.1-8.4中所述继续进行尿素-PAGE。
- 电泳后，从电泳装置中取出玻璃板，并使用荧光成像仪扫描以可视化凝胶。
- 执行凝胶图像的密度测量扫描，并使用所含和跳过产品的条带强度来计算外显子2包合物的百分比，如步骤4.8所述。
6. 通过引物延伸分析变异U1 snRNA表达
- 将从Hela细胞中提取的2.0μgRNA加入单独的200μL微量离心管中，并加入不含RNase的水以构成体积至4.325μL，然后加入dATP，如表5所示。
- 向每个管中加入10，000 CPM的32P-U17-26-R寡核苷酸。
注意：要制备32P-U17-26-R的10，000 cpm / μL溶液（从步骤3开始），稀释标记的寡核苷酸（1：20稀释），使用闪烁计数器确定1.0μL中的cpm，然后用去离子水进一步稀释以在新的1.5mL微量离心管中制备10，000 cpm / μL的溶液。 - 在65°C下孵育5分钟，然后在冰上孵育1分钟。
- 如 表 5所示，用5x第一链缓冲液，RNase抑制剂，DTT和逆转录酶制备预混液，并向每个样品中加入1.8μL混合物。
- 孵育，首先在室温下孵育10分钟，然后在42°C下孵育10分钟。
- 孵育后，将10μL2x甲酰胺RNA上样染料加入每个样品中，并储存在-20°C的丙烯酸盒中，或使用38厘米长的凝胶通过尿素-PAGE继续分离片段（参见步骤8）。
7. RT-qPCR分析变异U1 snRNA表达
- 将上述步骤5.1 - 5.4中制备的cDNA储备液稀释至0.2ng / μL的浓度。
- 将5.0μL稀释的cDNA一式三份移入96孔qPCR板的单个孔中。添加去离子水代替cDNA进行无模板控制（NTC）。
- 制备两个单独的引物混合物，由U1和U2 snRNA的正向和反向引物以及水组成，如 表6所示。
注：U1和U2 snRNA特异性引物的序列见 表7。 - 将5.0μL的U1和U2 snRNA引物混合物加入样品和NTC孔中。
- 向每个孔中加入10.0μL实时PCR混合物。
- 用光学膜密封板，然后在室温下以1，000× g 离心2分钟，以收集反应到孔的底部。
- 在95°C下进行初始变性步骤10分钟进行qPCR，然后进行40次循环的2步方案，包括变性（95°C持续15秒）和退火/延伸（62°C持续60秒），同时收集目标扩增子的阈值定量循环（Cq）值。
- 通过检查U1和U2 snRNA反应的解离曲线中的单个峰来完成qPCR反应。
- 根据Cq值，计算与pcDNA对照相比，U1和U2 snRNA的δCq（ΔCq）。
- 使用所有样品的ΔΔCq值确定变体U1 snRNA表达与U1的相对量（RQ）相比， 如下所示。
8. 尿素-PAGE凝胶的设置和运行
注：玻璃板和凝胶运行装置的组装应按照制造商的说明进行。10%尿素-PAGE凝胶的浇注可以根据Summer等人先前描述的方案进行。涉及标记物和样品的制备以及凝胶的运行和可视化的步骤如下所述。或者，为了防止凝胶粘附在玻璃板上，内表面可以通过在表面上添加1mL溶液并用组织均匀地铺展在整个表面上来涂覆有机硅溶液。干燥后，应用去离子水清洗板并再次干燥。
注意：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，必须使用材料安全数据表中推荐的保护措施进行处理。
- 通过在95°C下加热5分钟，然后在台式微量离心机中以3，000× g 在室温下离心5秒来制备引物延伸样品和标记物。
- 在加载标记物和样品之前，用1x TBE缓冲液冲洗孔以除去沉降的尿素。
- 上样10μL/样品/孔，并在300-500V下运行凝胶2-3小时或直到二甲苯氰醇到达底部。
注意：可以加载约 1，000 cpm 的 32P 标记标记。 - 电泳后，从电泳装置中取出玻璃板。
- 小心地将两块板分开，使凝胶平放在任一玻璃表面上，然后将凝胶转移到滤纸上并用保鲜膜覆盖。
- 使用凝胶干燥器在80°C下将滤纸上的凝胶真空干燥30分钟。
- 将干燥的凝胶置于荧光粉成像盒中，并在室温下保存过夜。
注：使用前应使用灯箱擦除荧光屏。 - 要可视化凝胶图像，请取下屏幕并使用荧光粉成像仪进行扫描。
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Representative Results
剪接报告人Dup51是一种三外显子二内含子微型基因，来源于人类β珠蛋白基因，之前已有描述（图1A）11，12 。我们通过引入Usher综合征相关的5'剪接位点突变创建了一个突变报告者Dup51p，这些突变发生在原钙粘蛋白15（PCDH15）基因13的外显子3中。外显子2-内含子2结处的5'-接头位点序列从CAG/GUUGGUAUC改为AUG/GUGUGUAUC（/是外显子-内含子边界）（图1B）14。这些序列变化改变了5'-剪接位点与内源性U1 snRNA配对的预测模式，并且还导致成熟转录本中外显子2的跳过（图2）。这些突变的作用可以通过U1 snRNA的5'-区域的代偿变化来抑制。在U1 snRNA（U1-5a）的第 5个位置用腺嘌呤替换尿嘧啶逆转了Dup51p中5'-剪接位点突变的影响（图1B）。
Dup51和Dup51p转录本的剪接可以通过使用 32P-Dup3r的引物延伸或使用Dup8f和Dup3r寡核苷酸的半定量RT-PCR来监测（图1）; 表7中提供了序列。当在HeLa细胞中表达时，Dup51 minigene表达成熟的全长转录本，其中外显子2被有效地剪接（图2A，B，通道1）。Dup51p中的5'剪接位点突变将外显子2的包涵体从~95%降低到~30%，导致形成较短的转录本（泳道5）。Dup51p与U1-5a snRNA共表达可挽救外显子2剪接并恢复全长转录本的形成（泳道8）。与野生型U1（U1-WT）或U1-5g变体的共表达对Dup51p拼接（通道6和7）没有类似的效果。U1-WT、U1-5g 或 U1-5a 共表达也不会改变 Dup51 报告器（通道 2-4）的拼接模式。总体而言，这些结果表明，Dup51p转录本中外显子2剪接的挽救是由于U1-5a snRNA中的U>A突变。
为了监测转染的U1 snRNA的表达，可以应用引物延伸或RT-qPCR。通过引物延伸检测U1-5a变体转录本使用U17-26 寡核苷酸，其20个核苷酸长，碱基对靠近U1 snRNA第5位 的腺嘌呤（图3A）。在仅存在dATP的情况下，U17-26 允许掺入2-3个核苷酸用于内源性野生型U1 snRNA，产生22或23个核苷酸长产物（图3B，泳道1，2，5和6）。对于U1-5a和U1-5g变体，在添加产生21个核苷酸长产物（泳道3，4，7和8）的单个腺苷酸后，延伸终止。通过RT-qPCR进行分析可以估计变异U1在内源性野生型snRNA上的表达增加倍数。在这里，设计了U1特异性引物对，以便与引入到变体snRNA中的突变不存在重叠（图3A）。在归一化为U2 snRNA表达后，发现转染的U1-WT以及U1-5g和U1-5a变体在内源性snRNA上表达3-5倍（图3C）。据估计，内源性U1在HeLa细胞中每细胞存在106 个拷贝15。因此，外源性变异snRNA在内源性U1上表达约3-5倍。U1-5a snRNA将外显子2包涵体挽救至~95%的能力表明，外源性变异snRNA的水平足以剪接新生的报告转录本。
| 成分 | 一次反应的量 |
| PNK 缓冲器 （10x） | 2.0 μL |
| T4 多核苷酸激酶 （T4 PNK） （10，000 U/mL） | 1.0 μL |
| 寡核苷酸* （10 μM） | 10.0 μL |
| 31P-ATP （10 mM） | 1.0 μL |
| H2O（经过脱氧乙烯处理） | 6.0 μL |
| *对于标记标记物，使用0.5μL的pBR322 DNA-MspI酶切或低分子量标记。 | |
表1：寡核苷酸的32P标记。 使用32P-ATP制备5'-32P标记引物的反应。
| 成分 - 预混料 I | 一次反应的量 |
| RNA 和 H2O（DEPC 处理） | 6.55 μL |
| 31P-Dup3r （2.5 μM） | 0.4 μL |
| 双翅目 （10 mM） | 0.5 μL |
| 配料 – 预混料 II | 一次反应的量 |
| 一股缓冲液 （5x） | 2.00 μL |
| RNase 抑制剂 （40 U/μL） | 0.25 μL |
| 数字万里断层 （0.1 米） | 0.05 μL |
| 逆转录酶（室温）（200U/μL） | 0.25 μL |
表2：32P-Dup3r引物延伸。 用于通过引物延伸分析剪接的报告记录体成绩单的反应。
| 成分 - 预混料 I | 一次反应的量 |
| RNA 和 ddH2O（DEPC 处理） | 11.0 μL |
| 随机六聚体（50纳克/μL） | 1.0 μL |
| 双翅目 （10 mM） | 1.0 μL |
| 配料 – 预混料 II | 一次反应的量 |
| 一股缓冲液 （5x） | 4.0 μL |
| RNase 抑制剂 （40 U/μL） | 1.0 μL |
| 数字万里断层 （0.1 米） | 1.0 μL |
| 逆转录酶（室温）（200U/μL） | 1.0 μL |
表3：cDNA合成。 从总RNA合成cDNA的反应。
| 成分 | 一次反应的量 |
| cDNA 模板 （100 ng/μL） | 1.00 μL |
| 正向底漆 （Dup8f） （10 μM） | 0.25 μL |
| Cy5 反向底漆 （Cy5-Dup3r） （10 μM） | 0.25 μL |
| dNTP （10 μM） | 0.25 μL |
| 塔克缓冲器 （10x） | 1.25 μL |
| Taq DNA 聚合酶 （5000 U/mL） | 0.25 μL |
| H2O（经过脱氧乙烯处理） | 9.25 μL |
表4：荧光RT-PCR。 使用Cy5标记的引物通过RT-PCR分析剪接的报告记录转录本的反应。
| 成分 | 一次反应的量 |
| RNA 和 H2O（DEPC 处理） | 4.325 μL |
| dATP （10 mM） | 0.375 μL |
| 31P-U17-26-R 寡核苷酸* | 1.000 μL |
| 配料 – 预混料 | 一次反应的量 |
| 一股缓冲液 （5x） | 1.5 μL |
| RNase 抑制剂 （40 U/μL） | 0.1 μL |
| 数字万里断层 （0.1 米） | 0.1 μL |
| 逆转录酶（室温）（200U/μL） | 0.1 μL |
| *应将32P-U17-26-R寡核苷酸的10，000 CPM加入到稀释的RNA中（步骤6.2）。 | |
表5：32P-U1-snRNA引物延伸。 通过引物延伸分析变体U1 snRNA表达的反应。
| 成分 | 一次反应的量 |
| 实时荧光定量 PCR 混合 | 10.0 μL |
| cDNA （0.2 纳克/μL） | 5.0 μL |
| 正向底漆 （10 μM） | 0.2 μL |
| 反向底漆 （10 μM） | 0.2 μL |
| H2O（经过脱氧乙烯处理） | 4.6 μL |
表6：定量RT-qPCR。 通过RT-qPCR定量分析变异U1 snRNA表达的反应。
| 寡核苷酸名称 | 序列（5' 至 3'） | 技术 |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | 荧光室热分析 |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGGAGATCCC | 荧光室热分析 |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | 引物延伸 |
| U17-26R | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | 引物延伸 |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80R | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84R | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
表7：寡核苷酸引物的序列。 引物名称、序列和引物使用技术的列表。
图1：Dup51和Dup51p微型报告程序（A）三个外显子/双内含子微型报告程序Dup51和Dup51p的示意图。分别指出了Dup8f和Dup3r在外显子1和3中的位置。（B）预测野生型U1 snRNA和U1-5a变体与Dup51和Dup51p报告者转录本的5'-剪接位点序列的碱基配对。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：剪接报告员成绩单分析。 将HeLa细胞与Dup51或Dup51p微型质粒和pcDNA对照或pNS6U1质粒共同转染，用于U1-WT，U1-5g或U1-5a snRNA。（A）使用 32P标记的Dup3r引物进行引物延伸分析，证明Dup51和Dup51p微型转录本的拼接。mRNA产物指示在凝胶图像的左侧。全长产物（± s.d.，n = 3）的百分比是根据两种mRNA亚型的条带强度计算的，如下图所示。（B）使用Dup8f和Cy5-Dup3r引物在cDNA上进行RT-PCR分析，这些引物由从HeLa细胞中提取的总RNA制备，显示Dup51或Dup51p微型转录本的剪接。mRNA产物指示在凝胶图像的左侧。全长产物（± s.d.，n = 3）的百分比是根据两种mRNA亚型的条带强度计算的，如下图所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：变体U1-5a snRNA的分析。 将HeLa细胞与Dup51或Dup51p微型质粒和pcDNA对照或pNS6U1质粒共同转染，用于U1-WT，U1-5g或U1-5a snRNA。（A）U1 snRNA序列的二维表示。用于U1 snRNA引物延伸分析的U17-26R引物的位置由红线表示。用于U1 snRNA的RT-qPCR的U1/17-39F和U1/58-80R引物的位置由蓝线表示。（B）用 32P标记的U17-26 进行引物延伸分析，以检测野生型U1 snRNA的表达，以及U1-5g和U1-5a变体的表达。指示由U1-WT形成的产物的位置和变体snRNA。（C）对Hela细胞中U1 snRNA表达水平的RT-qPCR分析。计算U1-snRNA表达的折叠变化相对于pcDNA阴性对照并归一化为U2-snRNA，绘制U1中的折叠变化（±s.d.; n = 3）。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该测定可以适用于HeLa以外的细胞系中的剪接分析，但是，可能需要优化影响转染效率的因素，例如细胞汇合度和DNA数量。报告者与U1构建比是另一个关键参数，可能需要根据在其他细胞类型中观察到的表达水平来确定。提取的RNA的质量对于剪接分析至关重要;因此，强烈建议使用不含RNase的水并用RNase灭活剂对表面进行去污。
通过引物延伸或荧光RT-PCR对报告转录本的分析产生类似的结果，因此可以使用这两种技术来监测成熟转录本中外显子2的内含变化。荧光PCR反应必须在扩增的指数阶段停止并定量，这取决于初始RNA浓度。因此，对于具有与此处描述的转染条件不同的测定，可能必须确定扩增循环的次数。由于非放射性性质，易用性是RT-PCR测定的一个优点。虽然使用放射性标记引物的引物延伸需要额外的安全预防措施，但它可以检测来自低量RNA的信号。引物延伸和RT-PCR的低通量是该测定的局限性。
U1 snRNP补体测定已被用于多种目的。除了逆转5'-剪接位点突变的影响外，携带5'区变化的U1 snRNA已被应用于基因沉默和剪接机制的研究。Fortes等人表明，将U1 snRNA靶向内源性转录本的末端外显子可以有效抑制基因表达16。Roca等人使用U1互补来研究5'-剪接位点识别的非规范机制，并表明U1 snRNA可以与备用寄存器中的5'-剪接位点基本配对，其中碱基配对被一个核苷酸移位，并且在"凸起寄存器"中，其中凸起的核苷酸存在于前mRNA或snRNA17中，18.该报告系统可用于研究U1 snRNP在小分子剪接调节蛋白和剪接调节蛋白中的作用。通过将Dup51p的外显子2替换为目标外显子，该测定可用于检查已知可增强或抑制特定外显子剪接的小分子的作用机制，例如在剪接开关化合物的情况下19。通过将替代剪接因子的调节序列纳入外显子或内含子，应该可以检查U1在剪接调节中的依赖性。Hamid等人应用了这一概念来证明U1 snRNA的茎环4参与聚嘧啶束结合蛋白120的剪接调节。我们用这种测定来研究U1 snRNA的茎环3和4的功能。通过在Dup51p剪接报告程序中激活突变5'剪接位点的抑制子U1-5a snRNA的茎环中结合突变，我们已经确定了它们在剪接体组装的早期步骤中与U2 snRNP特异性蛋白SF3A1形成交叉内含子接触的关键作用14，21。因此，三外显子双内含子Dup51报告基因可作为监测剪接效率的自适应工具，用于研究剪接体组装和剪接相关疾病的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R21CA170786和R01GM127464）和美国癌症协会（机构研究资助74-001-34-IRG）以及山谷研究合作计划（P1-4009和VRP77）向S.S.和W.M的资金支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
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