Summary
Denne protokollen beskriver en minigene reporteranalyse for å overvåke virkningen av 5'-spleisestedmutasjoner på skjøting og utvikler undertrykkeren U1 snRNA for redning av mutasjonsindusert skjøtehemming. Reporteren og undertrykkeren U1 snRNA-konstruksjoner uttrykkes i HeLa-celler, og skjøting analyseres av primerutvidelse eller RT-PCR.
Abstract
Under genuttrykk innebærer det viktige trinnet for pre-mRNA-skjøting nøyaktig anerkjennelse av skjøteplasser og effektiv montering av skjøteosomale komplekser for å bli med i eksoner og fjerne introner før cytoplasmatisk eksport av den modne mRNA. Skjøteeffektivitet kan endres ved tilstedeværelse av mutasjoner på skjøteplasser, påvirkning av transvirkende skjøtefaktorer eller aktiviteten til terapeutiske stoffer. Her beskriver vi protokollen for en cellulær analyse som kan brukes til å overvåke skjøteeffektiviteten til en gitt exon. Analysen bruker en tilpasningsdyktig plasmidkodet 3-exon/2-intron minigene reporter, som kan uttrykkes i pattedyrceller ved forbigående transfeksjon. Etter transfeksjon er total cellulær RNA isolert, og effektiviteten av exon skjøting i reporter mRNA bestemmes av enten primer forlengelse eller semi-kvantitativ omvendt transcriptase-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR). Vi beskriver hvordan virkningen av sykdom assosiert 5′ skjøte-området mutasjoner kan bestemmes ved å introdusere dem i reporteren; og hvordan undertrykkelsen av disse mutasjonene kan oppnås ved samtransfeksjon med U1 liten kjernefysisk RNA (snRNA) konstruere bærer kompensatoriske mutasjoner i sin 5′ region som basepairs med 5′-spleise steder på exon-intron veikryss i pre-mRNAs. Dermed kan reporteren brukes til utformingen av terapeutiske U1 partikler for å forbedre anerkjennelsen av mutant 5′ skjøte-nettsteder. Innsetting av cis-fungerende regulatoriske nettsteder, for eksempel spleiseforsterker eller lyddempersekvenser, i reporteren kan også brukes til å undersøke rollen til U1 snRNP i regulering formidlet av en bestemt alternativ skjøtefaktor. Til slutt, reporter uttrykker celler kan inkuberes med små molekyler for å bestemme effekten av potensielle terapeutiske på konstitutive pre-mRNA skjøting eller på exons bærer mutant 5′ skjøte steder. Totalt sett kan reporteranalysen brukes til å overvåke skjøteeffektivitet under en rekke forhold for å studere grunnleggende skjøtemekanismer og skjøterelaterte sykdommer.
Introduction
Pre-mRNA skjøting er et viktig behandlingstrinn som fjerner ikke-koding introner og nøyaktig ligates koding exons å danne modne mRNA. Anerkjennelse av konsensussekvenser ved ekson-intronkryss, referert til som 5′-skjøte sted og 3′-skjøte sted, av komponenter i skjøtemaskineriene initierer skjøteprosessen. U1 liten kjernefysisk ribonucleoprotein (snRNP) gjenkjenner 5′-spleise stedet ved base paring av U1 snRNA til pre-mRNA1. Genetisk arvelige mutasjoner som endrer 5′-spleise sted sekvenser er forbundet med mange sykdommer2,3. Det er spådd at tapet av basepairing av U1 snRNA med mutant 5′-spleise nettsteder forårsaker avvikende skjøting, noe som kan kompromittere oversettelsen av den berørte transkripsjonen. En potensiell terapeutisk tilnærming for å korrigere skjøtefeil innebærer undertrykkelse av mutasjoner ved modifisert U1 snRNA bærer kompenserende nukleotid endringer i sin 5′-region som basepairs med 5′-spleise stedet. Slike modifiserte U1 snRNAer, også referert til som exon spesifikke U1 snRNAs, har vist seg å være effektive i reversering skjøtefeil, noe som resulterer i økt proteinuttrykk fra den reddet mRNA4,5,6,7,8.
Her beskriver vi U1 snRNP komplementeringsanalyse, en reporterbasert cellulær skjøteanalyse som tillater vurdering av effekten av 5′-ss mutasjoner på skjøting av en exon og kan også brukes til utvikling av modifiserte U1 snRNAer for å muliggjøre redning av exon inkludering. Vi tilbyr også protokoller for overvåking av skjøtede reporterutskrifter ved primerutvidelse og RT-PCR, og for å bestemme uttrykket for modifiserte U1 snRNAer ved primerutvidelse og RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser og buffere
MERK: All sterilisering ved hjelp av vakuumfiltre skal utføres med 0,2 μm polyetersulfonmembran (PES) i et biosikkerhetsskap.
- Forbered RNase-fritt vann ved å tilsette 1,0 ml dietylpyrokarbonat (DEPC) til 1,0 L deionisert vann, bland i minst 1 time ved romtemperatur (RT), autoklaver to ganger, og avkjøl deretter til RT før bruk.
- Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ved å blande en pakke DMEM pulver (13,4 g), 3,7 g natriumbikarbonat, 100 ml foster bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin til ~ 800 ml sterilt deionisert vann. Den endelige konsentrasjonen av penicillin og streptomycin i DMEM skal være henholdsvis 50 U/ml og 50 μg/ml. Juster pH til 7,4 og utgjør deretter volumet til 1,0 L med sterilt deionisert vann. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered 10x fosfatbufret saltvann (10x PBS) ved å tilsette 25,6 g disodium hydrogen heptahydrat (Na2HPO4· 7H2O), 2 g kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4), 2 g kaliumklorid (KCl) og 80 g natriumklorid (NaCl) til 800 ml deionisert vann. Bland for å oppløse og utgjøre volumet til 1,0 L. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered 0,5 M etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA) ved å oppløse 186,1 g Na2•EDTA•2H2O i ~800 ml deionisert vann. Juster pH til 8,0 og utgjør deretter volumet til 1,0 L med sterilt deionisert vann. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered 1x trypsin-EDTA-oppløsning ved å blande 100 ml 10x trypsin (2,5%), 2 ml 0,5 M EDTA, og tilsett 1x PBS opptil 1,0 L. Steriliser ved filtrering og aliquot i 50 ml koniske rør. Oppbevars ved 4 °C i 1-2 uker eller fryser ved -20 °C ved langvarig bruk.
- Forbered 2x formamid DNA /RNA lastefarge ved å blande 14,4 ml formamid og 0,6 ml 0,5 M EDTA for et sluttvolum på 15 ml. Tilsett bromofenolblått og xylencyanikolpulver i en endelig konsentrasjon på 0,02% og oppbevar ved 4 °C.
MERK: Formamid er giftig og etsende. Les de materielle sikkerhetsdatabladene for ytterligere sikkerhetsanbefalinger. - Forbered 5x Tris/Borate/EDTA (5x TBE)-buffer ved å blande 54,0 g tris base, 27,5 g borsyre og 20 ml 0,5 M EDTA i ~800 ml deionisert vann. Bland for å oppløse og utgjøre volumet til 1,0 L med deionisert vann.
- Forbered urea-polyakrylamid gelelektroforese (urea-PAGE) oppløsning ved å blande 200 ml 5x TBE, 250 ml 40% 19: 1 bis / akrylamid og 450,5 g urea. Tilsett deretter deionisert vann opp til 1,0 L. Bland til ingrediensene er helt oppløst, steriliser deretter ved filtrering, og oppbevar ved 4 °C i en gul glassflaske.
MERK: Bis/akrylamid er giftig. Les de materielle sikkerhetsdatabladene for ytterligere sikkerhetsprosedyrer. - Forbered 10% ammoniumpersulfat (APS) ved å oppløse 1 g APS i 10 ml deionisert vann og oppbevar ved 4 °C.
2. Cotransfection av HeLa celler med reporter og U1 snRNA plasmider
MERK: Transfeksjonen av Hela-celler må utføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhetsskap. Den ytre overflaten av alle materialer må sprøytes med 70% etanol før den blir introdusert i det biologiske sikkerhetsskapet.
- Vedlikehold Hela-celler i DMEM i en inkubator på 37 °C med 5 % CO2 ved å passere hver 2-3 dag når cellene er ca. 80-90 % konfluensa.
- For passaging HeLa celler, aspirere brukt medium og deretter inkubere celler med 3 ml av 0,25% trypsin som inneholder 1 mM EDTA ved 37 °C i 3 min.
- Etter inkubasjon, tilsett 7 ml fersk DMEM. Overfør cellefjæringen til et 10 ml rør, sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter.
- Resuspend cellepellet i 10 ml fersk DMEM, og deretter plate cellene på en ny vev kultur parabolen på 20% samløp.
- For forbigående transfeksjoner teller du Hela-celler med en ren hemocytometersklie og forbereder en suspensjon med en tetthet på 2,5 x 105 celler / ml.
- Frø 1,0 ml 2,5 x 105 celler/ml Hela celle suspensjon i hver brønn av en 12-brønns plate og inkuberer over natten ved 37 °C.
- Neste dag aspirerer du det brukte mediet og tilsetter 0,8 ml fersk DMEM med serum.
- Forbered løsning I ved å legge til 0,2 μg Dup51 eller Dup51p reporter plasmid, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 eller pNS6U1-5a plasmid og 100 μL transfeksjonsmedium i et nytt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Forbered en hovedblanding av løsning II for alle prøver som skal transfekteres ved å tilsette 100 μL transfeksjonsmedium og 4,0 μL transfeksjonsreagens per prøve.
- Forbered transfeksjonsblandingen ved å tilsette 100 μL oppløsning II i hvert mikrosenterrør som inneholder løsning I.
- Virvel transfeksjonsblandingene i 15 s, sentrifuge i en bordplatemikrocentrifuge ved 3000 x g i 10 s ved RT, og inkuber deretter ved RT i 5 minutter.
- Tilsett alle 200 μL av transfeksjonsblandingen i en brønn av den 12-brønns HeLa-celleplaten for å oppnå et sluttvolum på 1,0 ml per brønn og inkuber platen ved 37 °C i 48 timer.
- Etter inkubasjon, trekk ut RNA fra de transfekterte HeLa-cellene med kommersielt tilgjengelig guanidintiocyanat og fenoloppløsning.
MERK: Dette reagenset inneholder fenol, og dette trinnet skal utføres i en avtrekkshette. Bruk av DEPC-behandlet vann anbefales for resuspensering av ekstrahert RNA.- Aspirer det brukte mediet og tilsett 500 μL reagens i hver brønn. Inkuber på RT i 5 min.
- Homogeniser ved å pipettere opp og ned. Overfør deretter løsningen til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 100 μL kloroform og virvel i 15 s.
- Sentrifuge på 12.000 x g i 15 min på RT.
- Overfør 200 μL av RNA som inneholder, topp vandig lag til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 2 μg glykogen og 200 μL isopropanol i hver RNA-prøve. Bland ved å invertere rørene.
- Samle RNA-utfellingen ved sentrifugering ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern og kast supernatanten uten å forstyrre RNA-pelletsen.
- Vask pellet to ganger ved å tilsette 1,0 ml 70% etanol, invertere rørene og sentrifugere som beskrevet i trinn 2.13.7.
- Lufttørk pelletsen i ~ 10-20 min ved RT og resuspend RNA i 10-20 μL RNase-fritt vann.
- Bestem RNA-konsentrasjonen ved å måle absorbans ved 260 nm som beskrevet av Desjardins og Conklin9.
- Fortsett med primerforlengelse eller oppbevar RNA-prøver i -20 °C. Isolert RNA kan lagres ved -20 °C i 6-12 måneder.
3. 32P-merking av oligonukleotider
MERK: Trinn som involverer bruk av 32P-ATP og 32P-merkede oligonukleotider må utføres bak et akrylskjold av opplærte personer med godkjenning fra autoriserte institusjonelle enheter. Protokollen beskrevet nedenfor kan brukes til merking av oligonukleotider, Dup3r og U17-26-R, og markører for urea-PAGE. Bruk av DEPC-behandlet vann anbefales for resuspensjon av oligonukleotider og størrelseseksklusjonsperler.
- Til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsett oligonukleotid, T4 polynukleotid kinase (T4 PNK), T4 PNK buffer og 32P-ATP som beskrevet i tabell 1. Tilsett 32P-ATP sist til blandingen; dette er viktig.
MERK: For tilsetning av radioaktive løsninger anbefales bruk av filtertips. - Inkuber i et vannbad ved 37 °C i 30 minutter.
- Mens merking reaksjonene inkuberer, resuspend størrelsen utelukkelse perler med en 25 kDa molekylvekt avskåret ved forsiktig virvel for ~ 10 s.
MERK: Størrelsesekskluderingsperlene skal tilberedes i henhold til produsentens instruksjoner og lagres som en 50% suspensjon i 25% etanol ved 4 °C. - Forbered kolonner ved å overføre 600 μL av de resuspenderte perlene til en engangs minikolonne plassert i et 1,5 ml oppsamlingsrør og returner perlelageret til 4 °C.
- Sentrifuge ved 2000 x g i 1 min ved RT og kast gjennomstrømningen.
- Vask perlene ved å tilsette 300 μL RNase-fritt vann til kolonnen.
- Gjenta trinn 3.5. og 3.6. to ganger og overfør minikolonnen til et nytt sentrifugerør på 1,5 ml.
- Tilsett kinasereaksjonsblandingen i størrelsesekskluderingsperlekolonnen og sentrifugen ved 5000 x g i 1 min ved RT.
- Samle og lagre gjennomstrømningen, som har det 32P-merkede oligonukleotidet, og kast alle spisser og rør i en akrylavfallsboks.
- Tilsett 20 μL RNase-fritt vann for å fortynne 32P-merket oligonukleotid til en endelig konsentrasjon på 2,5 μM.
MERK: Fortynn de merkede markørene etter behov for lasting på urea-PAGE geler. - Oppbevar det merkede oligonukleotidet i en akrylmikrorørboks ved -20 °C, eller fortsett med primerforlengelsesanalyse.
4. Analyse av skjøtede reporterutskrifter ved primerforlengelse
MERK: Det anbefales å rengjøre overflater og utstyr med en RNase som aktiverer reagens før bruk.
- Tilsett 2,0 μg RNA ekstrahert fra Hela-cellene i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsett RNase-fritt vann for å utgjøre volumet til 6,55 μL.
- Forbered Master Mix I med de fortynnede 32P-Dup3r- og dNTP-ene som vist i tabell 2, og tilsett 0,9 μL av blandingen til hvert PCR-rør som inneholder RNA-prøver.
- Inkuber rørene, først ved 65 °C i 5 minutter og deretter på is i 1 min.
- Forbered Master Mix II med 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase-hemmer og omvendt transkripsjon som vist i tabell 2.
- Tilsett 2,55 μL av blandingen til hvert rør som inneholder RNA og Master Mix 1; det totale volumet av reaksjonen skal være 10 μL. Hold rørene på RT i 10 minutter.
- Overfør rørene til et tørt bad eller en termisk syklist og inkuber først ved 50 °C i 60 minutter og deretter ved 70 °C i 15 minutter.
- Etter inkubasjon, tilsett 10 μL 2x formamid RNA lastefargestoff til hver prøve og lagre i en akrylboks ved -20 °C eller fortsett med separasjon av fragmenter ved urea-PAGE ved hjelp av en 14 cm lang gel og visualisering av gelbilde som beskrevet nedenfor i trinn 8.
- Utfør densitometrisk skanning av gelbildet med en bildeanalyseprogramvare og bruk båndintensitetene til inkluderte og hoppet over produkter for å beregne prosentandelen av exon 2-inkludering som vist nedenfor.
5. Analyse av skjøtede reporterutskrifter ved fluorescerende RT-PCR
MERK: RT-PCR-analysen beskrevet nedenfor bruker tilfeldige heksamere for cDNA-syntese og en kombinasjon av umerket Dup8f og Cy5-merket Dup3r oligonukleotider for PCR-forsterkning av skjøtede produkter.
- For cDNA-syntese, tilsett 2,0 μg RNA ekstrahert fra de transfekterte Hela-cellene i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsett RNase-fritt vann for å utgjøre volumet til 11,0 μL.
- Forbered Master Mix I, som inneholder tilfeldige heksamere og dNTP som vist i tabell 3 , og tilsett 2,0 μL av blandingen i hver prøve. Inkuber først ved 65 °C i 5 minutter og deretter på is i 1 min.
- Forbered Master Mix II, som inneholder First Strand Buffer, RNase inhibitor, DTT, og omvendt transkripsjon som vist i tabell 3 og tilsett 7,0 μL av blandingen til hvert rør som inneholder RNA og Master Mix I.
- Hold rørene på RT i 10 min, og inkuber deretter ved 50 °C i 60 minutter og 70 °C i 15 minutter.
MERK: Fullførte cDNA-reaksjoner kan oppbevares ved -20 °C. - For PCR overfører du 1,0 μL (100 ng/μL) av hver cDNA-prøve til nye PCR-rør.
- Forbered en masterblanding bestående av Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPer, Taq buffer, Taq polymerase og vann som beskrevet i tabell 4 og tilsett 11,5 μL av blandingen til hvert rør som inneholder cDNA.
- Utfør PCR ved hjelp av en termisk syklist med et innledende denatureringstrinn ved 94 °C i 3 minutter; etterfulgt av 20 sykluser med denaturering (94 °C i 30 s), gløding (65 °C i 30 s) og forlengelse (72 °C i 15 s), og et avslutningstrinn ved 72 °C i 5 minutter.
- Tilsett 12,5 μL 2x formamid DNA-lastfarge til hvert rør og varm ved 95 °C i 5 minutter.
- Oppbevar PCR-reaksjonen ved -20 °C eller fortsett med urea-PAGE som beskrevet nedenfor i trinn 8.1-8.4.
- Etter elektroforese, fjern glassplatene fra elektroforeseapparatet og skann ved hjelp av en fluorescensbilde for å visualisere gelen.
- Utfør densitometrisk skanning av gelbildet og bruk båndintensiteten til de inkluderte og de hoppede produktene for å beregne prosentandelen av exon 2-inkludering som beskrevet i trinn 4.8.
6. Analyse av variant U1 snRNA uttrykk ved primer forlengelse
- Tilsett 2,0 μg RNA ekstrahert fra Hela-cellene i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsett RNase-fritt vann for å utgjøre volumet til 4.325 μL og tilsett deretter dATP, som vist i tabell 5.
- Legg til 10 000 CPM for 32P-U17-26-R oligonukleotid i hvert rør.
MERK: For å lage en 10.000 cpm/μL-løsning av 32P-U17-26-R (fra trinn 3), fortynn det merkede oligonukleotidet (1:20 fortynning), bestem cpm i 1,0 μL ved hjelp av en scintillasjonsteller, og fortynn videre med deionisert vann for å lage en løsning på 10.000 cpm / μL i et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Inkuber ved 65 °C i 5 minutter, og deretter på is i 1 min.
- Forbered en masterblanding med 5x First Strand Buffer, RNase inhibitor, DTT og omvendt transkripsjon som vist i tabell 5 og tilsett 1,8 μL av blandingen i hver prøve.
- Inkuber først ved RT i 10 minutter og deretter ved 42 °C i 10 minutter.
- Etter inkubasjon, tilsett 10 μL 2x formamid RNA-lastfarge i hver prøve og oppbevar i en akrylboks ved -20 °C eller fortsett med separasjon av fragmenter ved urea-PAGE ved hjelp av en 38 cm lang gel (se trinn 8).
7. Analyse av variant U1 snRNA uttrykk av RT-qPCR
- Fortynn cDNA-lageret som er fremstilt som beskrevet ovenfor i trinn 5.1 - 5.4 til en konsentrasjon på 0,2 ng / μL.
- Pipette 5,0 μL fortynnet cDNA i individuelle brønner av en 96-brønns qPCR-plate i triplikat. Tilsett deionisert vann i stedet for cDNA for kontroll uten mal (NTC).
- Forbered to separate primerblandinger som består av de fremre og omvendte primerne for U1- og U2-snRNAer, og vann som vist i tabell 6.
MERK: Sekvenser for U1- og U2 snRNA-spesifikke primere er angitt i tabell 7. - Tilsett 5,0 μL av U1- og U2 snRNA-primerblandingen i prøve- og NTC-brønnene.
- Tilsett 10,0 μL PCR-blanding i sanntid til hver brønn.
- Forsegle platene med en optisk film, og sentrifuger deretter på 1000 x g i 2 min ved RT for å samle reaksjonene på bunnen av brønnene.
- Utfør qPCR med et innledende denatureringstrinn ved 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av en 2-trinns protokoll som består av denaturering (95 °C i 15 s) og gløding/forlengelse (62 °C i 60 s) mens du samler terskel kvantifiseringssyklusverdiene (Cq) for målforsterkere.
- Fullfør qPCR-reaksjonen ved å se etter en enkelt topp i dissosiasjonskurven for U1- og U2 snRNA-reaksjoner.
- Fra Cq-verdiene beregner du delta Cq (ΔCq) for U1- og U2-snRNAer sammenlignet med pcDNA-kontrollen.
- Bestem variant U1 snRNA-uttrykk som relativ mengde (RQ) av U1 sammenlignet med U2 ved hjelp av ΔΔCq-verdien som vist nedenfor for alle prøver.
8. Oppsett og kjøring av Urea-PAGE geler
MERK: Montering av glassplater og gelløpeapparatet skal utføres i henhold til produsentens anvisninger. Støpingen av 10% urea-PAGE gel kan utføres i henhold til en tidligere beskrevet protokoll av Summer et al.10. Trinn som involverer fremstilling av markører og prøver, og for løping og visualisering av geler er beskrevet nedenfor. Eventuelt, for å forhindre at gelen stikker til glassplater, kan den indre overflaten være belagt med silikonoppløsning ved å legge til 1 ml av løsningen på overflaten og jevnt spre seg over hele overflaten med vev. Når de er tørre, skal platene vaskes med deionisert vann og tørkes igjen.
FORSIKTIG: Ukolymerisert akrylamid er nevrotoksisk og må håndteres med beskyttelser som anbefales i databladet for materialsikkerhet.
- Forbered primerforlengelsesprøvene og markørene ved oppvarming ved 95 °C i 5 minutter og sentrifuger deretter i en mikrosentermikrosenter på bordplate ved 3000 x g i 5 s ved RT.
- Før du laster markørene og prøvene, skyll brønnene med 1x TBE-buffer for å fjerne den avgjorte ureaen.
- Legg 10 μL/prøve/brønn og kjør gelen ved 300-500V i 2-3 timer eller til xylencyaniolen når bunnen.
MERK: Omtrent 1000 cpm av den 32P-merkede markøren kan lastes. - Etter elektroforese, fjern glassplatene fra elektroforeseapparatet.
- Separer forsiktig de to platene slik at gelen ligger flatt på en av glassoverflatene og overfør gelen til et filterpapir og dekk den med plastfolie.
- Støvsug gelen på filterpapiret ved 80 °C i 30 minutter med en geltørker.
- Plasser den tørkede gelen i en fosforavbildningskassett og hold den på RT over natten.
MERK: Fosforskjermen skal slettes ved hjelp av en lysboks før bruk. - For å visualisere gelbildet, fjern skjermen og skann ved hjelp av en fosforbilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skjøtende reporteren Dup51, en tre exon-to intron minigene, ble avledet fra det menneskelige β-globingenet og har blitt beskrevet tidligere (figur 1A)11,12 . Vi opprettet en mutant reporter, Dup51p, ved å introdusere Usher syndrom assosiert 5'-spleise stedet mutasjoner som forekommer i exon 3 av protocadherin 15 (PCDH15) gene13. 5'-spleiseområdesekvensen ved exon 2-intron 2-krysset ble endret fra CAG/GUUGGUAUC til AUG/GUGUGUAUC (/ er exon-intron-grensen) (figur 1B)14. Disse sekvensendringene endrer det predikerte mønsteret til 5'-spleisestedet basepairing med den endogene U1 snRNA og resulterer også i hopping av exon 2 i den modne transkripsjonen (figur 2). Effekten av disse mutasjonene kan undertrykkes av en kompenserende endring i 5'-regionen av U1 snRNA. Substitusjon av uracil med adenin i femte posisjon av U1 snRNA (U1-5a) reverserte effekten av 5'-skjøte stedet mutasjoner i Dup51p (Figur 1B).
Skjøtingen av Dup51- og Dup51p-transkripsjonene kan overvåkes av primerutvidelse ved hjelp av 32P-Dup3r eller ved semi kvantitativ RT-PCR ved hjelp av Dup8f og Dup3r oligonukleotider (figur 1); sekvenser er angitt i tabell 7. Når det uttrykkes i HeLa-celler, uttrykker Dup51-minigene den modne transkripsjonen i full lengde der exon 2 er spleiset effektivt (figur 2A, B, bane 1). Mutasjonene på 5'-spleisestedet i Dup51p reduserer exon 2-inkludering fra ~ 95% til ~ 30%, noe som fører til dannelsen av kortere transkripsjon (lane 5). Coexpression av Dup51p med U1-5a snRNA redder exon 2 skjøting og gjenoppretter dannelsen av full lengde transkripsjon (lane 8). Samtidig med wildtype U1 (U1-WT) eller U1-5g variant har ikke en lignende effekt på Dup51p skjøting (baner 6 og 7). U1-WT, U1-5g eller U1-5a coexpression endrer heller ikke skjøtemønsteret til Dup51-reporteren (baner 2-4). Samlet sett indikerer disse resultatene at redning av exon 2 skjøting i Dup51p transkripsjoner er spesielt på grunn av U>A mutasjonen i U1-5a snRNA.
For å overvåke uttrykket av transfekterte U1 snRNAer, kan primerutvidelse eller RT-qPCR brukes. Påvisning av U1-5a-variantutskrifter ved primerutvidelse bruker U17-26 oligonukleotid, som er 20 nukleotider lange og basepairs nær adeninen i femte posisjon av U1 snRNA (figur 3A). I nærvær av dATP alene tillater U17-26 inkorporering av 2-3 nukleotider for den endogene wildtypen U1 snRNA som gir 22 eller 23 nukleotider langt produkt (figur 3B, baner 1, 2, 5 og 6). For U1-5a- og U1-5g-variantene avsluttes utvidelsen etter at en enkelt adenosin produserer et 21 nukleotider langt produkt (baner 3, 4, 7 og 8). Analyse av RT-qPCR tillater estimering av foldøkning i uttrykk for varianten U1 over den endogene wildtype snRNA. Her er U1-spesifikke primerpar designet slik at det ikke eksisterer noen overlapping med mutasjonene introdusert i variant snRNAene (figur 3A). Etter normalisering til U2 snRNA-uttrykk ble de transfekterte U1-WT- og U1-5g- og U1-5a-variantene funnet å være uttrykt ved 3-5 folder over den endogene snRNA (figur 3C). Endogen U1 er anslått å være til stede ved 106 eksemplarer per celle i HeLa-cellene15. Dermed uttrykkes den eksogene varianten snRNAer på ~ 3-5 fold over den endogene U1. U1-5a snRNA's evne til å redde exon 2 inkludering til ~ 95% viser at nivåer av den eksogene variant snRNAer er tilstrekkelig for skjøting av nascent reporter transkripsjoner.
| Ingredienser | Beløp for én reaksjon |
| PNK-buffer (10x) | 2,0 μL |
| T4 Polynukleotid Kinase (T4 PNK) (10.000 U/ml) | 1,0 μL |
| Oligonukleotid* (10 μM) | 10,0 μL |
| 32 P-ATP (10 mM) | 1,0 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 6,0 μL |
| *For merking av markører brukes 0,5 μL av pBR322 DNA-MspI Digest eller Lavmolekylær vektmarkør. | |
Tabell 1: 32P-merking av oligonukleotider. Reaksjon for fremstilling av en 5′-32P-merket primer ved hjelp av 32P-ATP.
| Ingredienser - Master Mix I | Beløp for én reaksjon |
| RNA og H2O (DEPC behandlet) | 6,55 μL |
| 32 P-Dup3r (2,5 μM) | 0,4 μL |
| dNTP (10 mM) | 0,5 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Beløp for én reaksjon |
| Buffer med første tråd (5x) | 2,00 μL |
| RNase Inhibitor (40 U/µL) | 0,25 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,05 μL |
| Omvendt transkripsjon (RT) (200U/μL) | 0,25 μL |
Tabell 2: 32P-Dup3r primer forlengelse. Reaksjon for analyse av skjøtede reporterutskrifter ved primerforlengelse.
| Ingredienser - Master Mix I | Beløp for én reaksjon |
| RNA og ddH2O (DEPC behandlet) | 11,0 μL |
| Tilfeldig Hexamer (50 ng/μL) | 1,0 μL |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Beløp for én reaksjon |
| Buffer med første tråd (5x) | 4,0 μL |
| RNase Inhibitor (40 U/µL) | 1,0 μL |
| DTT (0,1 M) | 1,0 μL |
| Omvendt transkripsjon (RT) (200U/μL) | 1,0 μL |
Tabell 3: cDNA-syntese. Reaksjon for syntesen av cDNA fra total RNA.
| Ingredienser | Beløp for én reaksjon |
| cDNA-mal (100 ng/μL) | 1,00 μL |
| Fremoverprimer (Dup8f) (10 μM) | 0,25 μL |
| Cy5 omvendt primer (Cy5-Dup3r) (10 μM) | 0,25 μL |
| dNTP (10 μM) | 0,25 μL |
| Taq-buffer (10x) | 1,25 μL |
| Taq DNA Polymerase (5000 U/mL) | 0,25 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 9,25 μL |
Tabell 4: Fluorescerende RT-PCR. Reaksjon for analysen av de skjøtede reportertranskripsjonene av RT-PCR ved hjelp av Cy5-merket primer.
| Ingredienser | Beløp for én reaksjon |
| RNA og H2O (DEPC behandlet) | 4,325 μL |
| dATP (10 mM) | 0,375 μL |
| 32 P-U17-26-R oligo nukleotid* | 1.000 μL |
| Ingredienser – Master Mix | Beløp for én reaksjon |
| Buffer med første tråd (5x) | 1,5 μL |
| RNase Inhibitor (40 U/µL) | 0,1 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,1 μL |
| Omvendt transkripsjon (RT) (200U/μL) | 0,1 μL |
| *10 000 CPM av 32P-U17-26-R oligonukleotid skal tilsettes fortynnet RNA (trinn 6.2.). | |
Tabell 5: 32P-U1-snRNA primer forlengelse. Reaksjon for analyse av variant U1 snRNA uttrykk ved primer forlengelse.
| Ingredienser | Beløp for én reaksjon |
| PCR-miks i sanntid | 10,0 μL |
| cDNA (0,2 ng/μL) | 5,0 μL |
| Foroverprimer (10 μM) | 0,2 μL |
| Omvendt primer (10 μM) | 0,2 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 4,6 μL |
Tabell 6: Kvantitativ RT-qPCR. Reaksjoner for kvantitativ analyse av variant U1 snRNA-uttrykk av RT-qPCR.
| Oligo-navn | Sekvens (5′ til 3′) | Teknikk |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | Fluorescerende RT-PCR |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Fluorescerende RT-PCR |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Primer-utvidelse |
| U17-26R | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Primer-utvidelse |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80R | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84R | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
Tabell 7: Sekvens av oligonukleotider primere. Liste over primernavn, sekvenser og teknikken primerne ble brukt til.
Figur 1: Dup51 og Dup51p Minigene Reporters. (A) Skjematisk representasjon av tre-exon/to-intron minigene reportere, Dup51 og Dup51p. Plasseringene til Dup8f og Dup3r i henholdsvis exons 1 og 3 er angitt. (B) Forutsagt basepairing av wildtype U1 snRNA og U1-5a-varianten med 5'-spleise nettstedsekvenser av Dup51 og Dup51p reporter transkripsjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av skjøtede reporterutskrifter. HeLa celler ble cotransfected med Dup51 eller Dup51p minigene plasmider og pcDNA kontroll eller pNS6U1 plasmider for U1-WT, U1-5g, eller U1-5a snRNAs. (A) Primer forlengelse analyse med 32P-merket Dup3r primer demonstrere skjøting av Dup51 og Dup51p minigene transkripsjoner. mRNA-produktene er indikert til venstre for gelbildet. Prosentandelen av fulllengdeproduktet (± s.d., n = 3) ble beregnet fra båndintensiteter av de to mRNA-isoformene og er representert i grafene nedenfor. (B) RT-PCR-analyse med Dup8f- og Cy5-Dup3r-primere på cDNA fremstilt fra totalt RNA ekstrahert fra HeLa-celler som demonstrerer skjøting av Dup51- eller Dup51p minigene transkripsjoner. mRNA-produktene er indikert til venstre for gelbildet. Prosentandelen av fulllengdeproduktet (± s.d., n = 3) ble beregnet fra båndintensiteter av de to mRNA-isoformene og er representert i grafene nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av varianten U1-5a snRNA. HeLa celler ble cotransfected med Dup51 eller Dup51p minigene plasmider og pcDNA kontroll eller pNS6U1 plasmider for U1-WT, U1-5g, eller U1-5a snRNAs. (A) En todimensjonal representasjon av U1 snRNA-sekvensen. Posisjonen til U17-26R primeren, som brukes til primerforlengelsesanalyse av U1 snRNA, er indikert av den røde linjen. Plasseringen av U1/17-39F og U1/58-80R primere, som brukes til RT-qPCR av U1 snRNA, er indikert av de blå linjene. (B) Primer forlengelse analyse med 32P-merket U17-26 for å oppdage uttrykket av wildtype U1 snRNA, og U1-5g og U1-5a varianter. Stillinger av produktene dannet fra U1-WT og variantene snRNAer er indikert. (C) RT-qPCR-analyse av nivåene av U1 snRNA-uttrykk i Hela-celler. Foldendringen i U1-snRNA-uttrykket ble beregnet i forhold til pcDNA-negativ kontroll og normalisert til U2-snRNA, foldendring (± s.d.; n = 3) i U1 er grafert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen kan tilpasses for skjøteanalyse i andre cellelinjer enn HeLa, men faktorer som påvirker transfeksjonseffektiviteten, for eksempel cellesammenstrømning og mengde DNA, må kanskje optimaliseres. Konstruereforholdet mellom reporter og U1 er en annen kritisk parameter som kanskje må bestemmes avhengig av uttrykksnivåene som observeres i andre celletyper. Kvaliteten på ekstrahert RNA er avgjørende for skjøteanalyse; Derfor anbefales bruk av RNase-fritt vann og dekontaminering av overflater med RNase inaktiveringsmidler på det sterkeste.
Analyse av reporter transkripsjoner av enten primer forlengelse eller fluorescerende RT-PCR gir lignende resultater, derfor kan begge teknikkene brukes til å overvåke endringer i inkludering av exon 2 i moden transkripsjon. Den fluorescerende PCR-reaksjonen må stoppes og kvantifiseres i den eksponentielle fasen av forsterkning, som er avhengig av den første RNA-konsentrasjonen. Dermed kan antall forsterkningssykluser måtte bestemmes for analyser med forskjellige transfeksjonsbetingelser enn de som er beskrevet her. Brukervennligheten på grunn av den ikke-radioaktive naturen er en fordel med RT-PCR-analysen. Selv om primerforlengelse med radioaktivt merket primer krever ekstra sikkerhetsforanstaltninger, kan den oppdage signaler fra en lav mengde RNA. Den lave gjennomstrømningen til primerutvidelsen og RT-PCR er en begrensning av denne analysen.
U1 snRNP-komplementeringsanalysen har blitt brukt til flere formål. I tillegg til å reversere effektene av 5'-spleisestedmutasjoner, har U1 snRNAer som bærer endringer i 5-regionen blitt brukt til genaktivering og for å studere skjøtemekanismer. Fortes et al. viste at målretting av U1 snRNAer mot terminale eksoner av endogene transkripsjoner effektivt kan hemme genuttrykk16. Roca et al. brukte U1-komplementasjonen til å studere de ikke-kanoniske mekanismene for 5'-spleise nettstedgjenkjenning og viste at U1 snRNA kan basepair til 5'-spleise steder i et alternativt register der basepairing er forskjøvet av ett nukleotid og også i "bulge registre" der bulged nukleotider er til stede i enten pre-mRNA eller snRNA17, 18. Dette reportersystemet kan potensielt brukes til å studere rollen som U1 snRNP i skjøting modulasjon av små molekyler og skjøte regulatoriske proteiner. Ved å erstatte exon 2 av Dup51p med en målekson, kan analysen brukes til å undersøke virkningsmekanismen til små molekyler som er kjent for å forbedre eller undertrykke skjøting av spesifikke eksoner, som i tilfelle av skjøtevekslingsforbindelser19. Ved å inkorporere regulatoriske sekvenser for alternative skjøtefaktorer i eksoner eller introner, bør det være mulig å undersøke U1-avhengighet i skjøteregulering. Dette konseptet ble anvendt av Hamid et al. for å demonstrere involvering av stamme-loop 4 av U1 snRNA i skjøteregulering av polypyrimidinkanalen bindingsprotein 120. Vi har brukt denne analysen til å studere funksjonene til stammeløkker 3 og 4 av U1 snRNA. Ved å inkorporere mutasjoner i stammesløyfen til undertrykkeren U1-5a snRNA som aktiverer et mutant 5'-spleisested i Dup51p-skjøtereporteren, har vi identifisert deres kritiske roller i dannelsen av kryssintronkontakter med det U2 snRNP-spesifikke proteinet SF3A1 i de tidlige trinnene i skjøteosommontering14,21. Dermed fungerer tre-exon to-intron Dup51 reporter som et adaptivt verktøy for overvåking av skjøteeffektivitet i studier på mekanismer underliggende skjøteosom montering og skjøting-assosiert sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler til S.S. fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) og til S.S. og W.M. fra Valley Research Partnership Program (P1-4009 og VRP77). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
