Summary
Les monocouches lipidiques sont utilisées comme base pour former des cristaux de protéines bidimensionnelles (2D) pour des études structurelles depuis des décennies. Ils sont stables à l’interface air-eau et peuvent servir de matériau de support mince pour l’imagerie électronique. Nous présentons ici les étapes éprouvées de la préparation des monocouches lipidiques pour les études biologiques.
Abstract
La cristallographie électronique est un outil puissant pour la détermination de structures à haute résolution. Les macromolécules telles que les protéines solubles ou membranaires peuvent être cultivées en cristaux bidimensionnels (2D) hautement ordonnés dans des conditions favorables. La qualité des cristaux 2D cultivés est cruciale pour la résolution de la reconstruction finale via le traitement d’image 2D. Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D de protéines membranaires intégrales, mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser le partage avec la monocouche. Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau de telle sorte que les groupes de tête lipidique polaire restent hydratés dans la phase aqueuse et que les chaînes acyles non polaires se divisent dans l’air, brisant la tension superficielle et aplatissant la surface de l’eau. La nature chargée ou les fractions chimiques distinctives des groupes de tête fournissent une affinité pour les protéines en solution, favorisant la liaison pour la formation de réseaux 2D. Une monocouche nouvellement formée avec le réseau 2D peut être facilement transférée dans un microscope électronique (EM) sur une grille de cuivre recouverte de carbone utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin. Dans ce travail, nous décrivons une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie cryogénique au microscope électronique (cryo-EM).
Introduction
La diffraction d’électrons à travers des cristaux 2D ou des réseaux hélicoïdaux de protéines peut atteindre des résolutions inférieures au nanomètre dans des cas favorables1,2,3. Les réseaux de protéines membranaires 2D reconstitués ou les cristaux dans leur environnement quasi natif sont particulièrement intéressants1. Parce qu’un cristal agit comme un amplificateur de signal améliorant les intensités des facteurs structurels à des fréquences spatiales spécifiques, la cristallographie électronique permet de sonder une cible de taille plus petite à haute résolution, telle que de petites molécules, que celles de cryo-EM à particule unique. Le faisceau d’électrons peut être diffracté par un réseau ordonné de protéines 2D, générant un motif de diffraction ou une image en treillis selon l’endroit où le plan d’image est enregistré sur le détecteur4. Les intensités diffractées peuvent ensuite être extraites et traitées pour reconstruire une structure de projection 2D du cristal. Les électrons ont une plus grande section de diffusion que les rayons X et sa diffusion suit principalement le modèle de Rutherford basé sur l’interaction de Coulomb entre les électrons et les atomes chargés dans la molécule5. Les épaisseurs des cristaux de membrane 2D sont généralement inférieures à 100 nm, adaptées à la transmission d’électrons sans diffusion dynamique se produisant dans l’échantillon6. Les études cristallographiques électroniques se sont révélées être un outil puissant pour sonder l’information structurelle à haute résolution des protéines membranaires et des interactions lipide-protéine7,8,9,10 , 11,12, 13,14,15,16,17.
Une monocouche lipidique est une seule couche lipidique composée de phospholipides densément emballés à une interface air-eau6, qui peut aider à la formation du réseau 2D pour les protéines solubles ou les protéines de la membrane périphérique18. En fonction de la densité des lipides et de leur pression latérale, les molécules lipidiques peuvent former un réseau ordonné 2D sur l’interface air-eau avec leurs chaînes acyl étendues à l’air et aux groupes de tête hydrophiles exposés dans la solution aqueuse1,6,19. Le groupe de tête lipidique peut interagir avec les protéines via une interaction électrostatique ou peut être modifié pour fournir une balise d’affinité pour lier un domaine protéique spécifique. Par exemple, le DOGS-NTA-Ni (acide 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)acide iminodiacétique)succinyl]2-Ni2+) est souvent utilisé pour former une monocouche lipidique pour lier les protéines avec une étiquette poly-histidine20,21,22. En outre, la toxine B du choléra peut lier un pentasaccharide particulier de ganglioside GM1 dans une monocouche lipidique pour les études structurelles23,24. En ancrant les protéines sur les groupes de tête lipidiques, la monocouche lipidique peut aider à la formation des réseaux 2D qui sont minces pour les études cristallographiques électroniques à haute résolution. La technique de la monocouche lipidique a été utilisée en cristallographie électronique pour des études structurales de protéines, telles que la streptavidine2,25, l’annexine V26, la toxine cholérique27, la sous-unité B e. coli gyraseB 28, l’ARN polymérase E. coli 25,29,30, les protéines de la coquille de carboxysomes31 et les protéines de capside du VIH-132 et du virus de la leucémie murine Moloney 33. En raison de la stabilité et des propriétés chimiques de la monocouche lipidique, différentes applications pour la préparation des échantillons ont été explorées pour l’imagerie cryo-EM34. Cependant, une optimisation sera nécessaire pour la formation de réseaux de protéines.
Ici, nous fournissons des détails détaillés sur la préparation générale des monocouches lipidiques pour l’imagerie cryo-EM et quelques considérations qui pourraient affecter la qualité des monocouches formées.
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Protocol
1. Préparation des blocs de téflon
- Préparez le bloc de téflon à partir de résine PTFE (polytétrafluoroéthylène) résistante aux produits chimiques. Faites des trous sur le bloc à l’aide d’une perceuse générale suivie des dimensions indiquées à la figure 1.
2. Préparation lipidique monocouche
REMARQUE: Durée de fonctionnement estimée: 30-45 minutes
- Préparation du stock lipidique
- Préparer un mélange lipidique de 0,01 mg/mL dans du chloroforme/méthanol 9:1 (v/v) en utilisant 8,91 mL de chloroforme, 0,99 mL de méthanol et 0,01 mL de lipides de 10 mg/mL.
- Préparation de plaques de téflon
- Sonicate une plaque de téflon dans un bain de méthanol pendant 5 minutes.
- Laver à l’eau chaude pendant 15 minutes.
- Rincer à l’eau distillée.
- Sécher la plaque de téflon dans un dessiccateur pendant 30 minutes et la garder sous vide lorsqu’elle n’est pas utilisée (Figure 1).
3. Formation d’une monocouche lipidique sur un réservoir tampon
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1,5 heures
- Préparer fraîchement un mélange lipidique de 0,01 mg/mL dans un mélange 9:1 de chloroforme/méthanol le jour de l’expérience.
- Placez un papier filtre de type 1 dans une boîte de Petri et disposez le bloc de téflon sur le dessus du papier filtre.
- Remplissez les puits de la plaque de téflon avec 60 μL de tampon.
- Ajouter soigneusement le mélange lipidique sur le dessus de la surface tampon goutte par goutte (idéalement 1 μL par goutte) à l’aide d’une seringue Hamilton.
- Mouillez le papier filtre avec de l’eau distillée pour maintenir l’humidité dans la boîte de Pétri.
- Incuber à température ambiante pendant 60 minutes. Le chloroforme devrait s’évaporer et une monocouche de lipides à la surface du tampon devrait être formée.
4. Application d’une grille EM sur une monocouche lipidique
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1,5 heures
- Placez doucement une grille EM recouverte de carbone trouée sans décharge de carbone, côté carbone vers le bas, sur le dessus de chaque réservoir tampon.
- Injectez soigneusement des protéines dans le puits d’injection latérale. Utilisez les concentrations finales de protéines dans le puits autour de 1 μM de protéines comme point de départ. Pré-optimiser la concentration en protéines avant l’expérience.
- Incuber pendant 60 minutes à température ambiante.
- Injectez doucement environ 20 à 30 μL de tampon dans l’aissent l’aissé du côté. Cela élèvera la grille au-dessus de la surface du bloc de téflon.
- Ramassez immédiatement la grille avec une pince à épiler et soulevez-la verticalement de la gouttelette.
- Préparer des échantillons monocouches pour la coloration négative ou l’imagerie cryo-TEM (Figure 2). Si les protéines forment un réseau 2D, le spectre de puissance de l’image ou le périogramme de Fourier montrera les intensités de diffraction aux fréquences spatiales en fonction de la symétrie cristalline. Si aucune tache de diffraction n’est montrée dans le spectre de puissance, il est peu probable que les protéines forment un cristal 2D.
- Vérifiez la couverture de la monocouche lipidique sur la grille EM à l’aide d’un microscope électronique à transmission (TEM). Une image électronique plus faiblement agrandie est utile pour identifier la morphologie de la monocouche couverte. Habituellement, le contraste d’image de la zone couverte de monocouche sera légèrement inférieur à celui des zones non couvertes. De plus, le spectre de puissance d’image 2D calculé aidera à identifier l’emplacement du cristal 2D.
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Representative Results
Une monocouche lipidique déposée sur la grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission (TEM) sans coloration. La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans aucun spécimen dans la trajectoire du faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste local plus faible que celles qui n’ont pas de couverture, car le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion et montre un éclairage plus lumineux(Figure 3).
Pour examiner les conditions de cristallisation monocouche 2D, étudiez l’image de l’échantillon à l’aide de l’imagerie EM à coloration négative ou cryo-EM. La question de savoir si la monocouche recouvre les trous pourrait être observée par un contraste de bord plus fort lorsque la scène est inclinée. Si un cristal est formé, le spectre de puissance de l’image ou le périogramme montrera les taches de Fourier ou de diffraction. Les cristaux de petites tailles (< 200 nm) et orientés de manière aléatoire peuvent présenter des anneaux de haute intensité dans le spectre de puissance. Si les cristaux ne sont pas cultivés, le spectre de puissance ne montrera pas de taches de Fourier.
Graphique 1. Bloc de téflon utilisé pour la formation de monocouches lipidiques. Un bloc de téflon est affiché en haut (ci-dessus) et en coupe transversale (ci-dessous). Il contient 12 puits disposés en six rangées et deux colonnes. Le tampon principal bien étiqueté A, représenté en bleu plus foncé, au milieu mesure 4 mm de diamètre et 5 mm de profondeur avec des volumes d’échantillon de 60 μL. La monocouche est formée au-dessus du réservoir tampon dans le puits principal et les protéines sont injectées à travers l’orifice latéral marqué B en bleu clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Présentation schématique du développement du cristal 2D sur monocouche lipidique. Le réservoir tampon est d’abord rempli avec le tampon, suivi par le lipide déposé sur le dessus du puits. Le côté carbone d’une grille EM est placé sur la monocouche lipidique, qui interagira avec les queues hydrophobes. Tout d’abord, les protéines sont injectées à travers le puits d’injection latéral B (étape 1). Au fil du temps, les protéines sont disposées en un réseau cristallin 2D et interagissent avec les groupes de tête lipidique (étape 2). Pour récupérer la grille EM pour une analyse plus approfondie, une pince à épiler est utilisée pour soulever la grille du réservoir tampon verticalement (étape 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Exemple de la couverture monocouche lipidique sur une grille EM. Une grille EM monocouche et trouée recouverte de carbone sans coloration a été imagée à l’aide d’un microscope électronique à transmission Philips CM12 à température ambiante. La flèche orange indique la zone qui n’a pas de couverture monocouche lipidique, et les flèches bleues indiquent la couverture complète de la monocouche lipidique dans le trou de la grille. La barre d’échelle est de 0,5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une monocouche lipidique est un outil puissant qui facilite la croissance de gros cristaux 2D pour les études structurales de macromolécules biologiques. Pour préparer avec succès une monocouche lipidique intacte à l’interface air-eau, il est fortement recommandé que les lipides soient préparés fraîchement le jour de l’expérience, car l’oxydation de la chaîne lipidique acyle pourrait entraîner une perturbation de l’emballage dans la monocouche et nuire à la formation de cristaux qui en résulte. Les lipides achetés sous forme de poudre doivent être dissous à l’aide d’un mélange de chloroforme: solvant de méthanol, qui est couramment utilisé pour dissoudre les phospholipides35. Le solvant chloroforme:méthanol peut être préfabriqué et stocké dans un flacon en verre scellé. Pendant que les lipides dissous sont appliqués à l’interface air-eau, attendez que le solvant chloroforme:méthanol s’évapore complètement du tampon. Un temps d’attente approprié pour la formation de monocouches lipidiques et la formation de cristaux 2D est essentiel dans cette expérience. En règle générale, la formation d’une monocouche lipidique et de réseaux 2D peut avoir lieu dans un délai d’environ 30 à 60 minutes après le temps d’incubation18.
Lorsqu’une monocouche lipidique est correctement formée, assurez-vous que la formation du réseau de cristaux 2D peut être favorisée efficacement par le lipide. La composition tampon doit être optimisée pour stabiliser l’établissement de matrices 2D, en particulier lorsque le lipide DOGS-NTA-Ni est utilisé18,36. Le succès de la cristallisation de la monocouche lipidique pour ce lipide peut être affecté s’il y a des concentrations élevées d’EDTA (éthylènediaminetétraacétate), de TNT (1,4-dithiothréitol) ou de divers ions dans le tampon. Le chélateur soluble EDTA peut perturber le complexe lipide-métal ion-protéine36. Un exemple de ceci est l’interaction de la protéine streptavidine avec le lipide iminodiacétate-Cu (II); l’ajout d’EDTA élimine le Cu (II) et interrompt le complexe lipide-métal ion-protéine20. Par conséquent, l’échantillon peut avoir besoin d’être dilué ou d’échanger un tampon pour éliminer l’EDTA, ce qui permet une liaison plus forte des protéines et favorise la formation de cristaux. L’optimisation du tampon doit être effectuée avant qu’il ne soit ajouté au réservoir tampon dans le bloc Téflon.
Pour préserver les détails structurels à haute résolution du cristal 2D, il est essentiel de maintenir la planéité de l’échantillon. Cependant, en raison de la tension superficielle, des capacités thermiques différentielles entre l’échantillon et le support ou de l’intervention humaine, il n’est pas anodin de maintenir la planéité du cristal 2D pendant le transfert de l’échantillon. Lorsque la grille EM est soulevée du réservoir tampon, il faut l’utiliser avec le moins de perturbation possible pour laisser l’interface monocouche intacte. Toute rotation ou mouvement drastique de la grille peut fracturer l’interface monocouche. Cela s’applique également aux étapes de congélation des échantillons, où la grille avec des cristaux doit être manipulée avec soin et congelée rapidement pour éviter les cristaux de glace, qui peuvent endommager les cristaux de protéines 2D nouvellement formés.
On peut utiliser une grille recouverte de carbone dentelle pour soutenir des monocouches de différentes tailles, en fonction de la taille des trous sur le film de carbone de dentelle. La planéité de l’interface monocouche peut être affectée par différentes tailles de trous sur le film de carbone de dentelle, ce qui peut aider à filtrer une monocouche plate avec les intensités de diffraction dans les directions isotropes.
Il existe quatre méthodes courantes utilisées pour cultiver et développer des cristaux 2D pour les études structurelles: dialyse, dilution, adsorption hydrophobe et monocouche lipidique37,38,39. La méthode de dialyse élimine les détergents utilisés pour solubiliser les protéines membranaires au début de la purification. Les cristaux 2D sont cultivés en reconstituant des protéines membranaires solubilisées par détergent en bicouches lipidiques dans des conditions favorables35. Pour que la reconstitution ait lieu, les détergents doivent être éliminés par dialyse. Par conséquent, la méthode de dialyse aide à conduire à la formation de cristaux 2D40. Cependant, la méthode de dialyse prend généralement beaucoup de temps, en particulier pour les détergents à faible concentration micellaire critique (CMC). La formation de matrices 2D peut également être réalisée via une dilution contrôlée. Cette méthode fournit un rapport défini pour le mélange protéine-lipide-détergent afin d’induire la formation de cristaux si la concentration de détergent tombe en dessous de son CMC. Cela pourrait être facilité par une machine de dilution spécifique pour effectuer les travaux en commençant par une concentration initiale de protéines plus élevée41. De plus, l’adsorption hydrophobe provoque la croissance de cristaux 2D en utilisant des billes de polystyrène (par exemple, des biobilles) pour éliminer les détergents à faible teneur en CMC42. Si la protéine d’intérêt est solubilisée avec des détergents à haute teneur en CMC, cette méthode n’est pas idéale. En revanche, la méthode monocouche lipidique est polyvalente et fournit des étapes non alambiquées pour la cristallisation 2D43. Comme discuté ici, il nécessite un appareil simple et quelques matériaux pour mener les expériences. Avec notre méthode, le temps total nécessaire à l’expérience peut être raccourci à 4 heures17. Même si la pré-optimisation de certains paramètres, tels que la concentration en protéines et les composants tampons, peut encore être nécessaire au préalable, il est possible de maximiser son efficacité dans les travaux de laboratoire de routine.
Pour cristalliser des protéines membranaires intégrales à l’aide d’une monocouche lipidique, il faut vérifier si la concentration de détergent pour la solubilisation des protéines et des lipides perturbe l’interface monocouche. Généralement, il est suggéré d’utiliser la concentration de détergent inférieure à celle du CMC 44. Dans les cas où l’interface monocouche est sensible à l’existence du détergent, une autre approche peut consister à former la monocouche lipidique à l’aide de fluor-lipides, qui sont à peine solubilisés par le détergent et élargissent l’applicabilité de la cristallisation intégrale des protéines membranaires en utilisant la méthode monocouche45.
Bien que la méthode de la monocouche lipidique soit simple et moins coûteuse, la reproductibilité de la préparation monocouche dépend de divers facteurs, tels que l’humidité ambiante et la température. Le succès du transfert d’échantillons pour l’imagerie cryo-EM repose sur une manipulation minutieuse des échantillons. Dans certains cas, il peut être difficile d’obtenir des résultats à haute résolution par un novice ou dans la phase initiale d’un nouveau projet de recherche.
En conclusion, la méthode de la monocouche lipidique offre la possibilité d’étudier les structures protéiques en raison de sa simplicité. Il peut fournir une approche alternative pour faciliter le processus de formation de cristaux 2D.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
La préparation de ce manuscrit a été partiellement soutenue par le US Army Research Office (W911NF2010321) et les fonds de démarrage de l’Arizona State University à P.-L.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
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