Summary
Las monocapas lipídicas se han utilizado como base para formar cristales de proteína bidimensionales (2D) para estudios estructurales durante décadas. Son estables en la interfaz aire-agua y pueden servir como un material de soporte delgado para la obtención de imágenes electrónicas. Aquí presentamos los pasos comprobados en la preparación de monocapas lipídicas para estudios biológicos.
Abstract
La cristalografía electrónica es una herramienta poderosa para la determinación de estructuras de alta resolución. Las macromoléculas como las proteínas solubles o de membrana se pueden cultivar en cristales bidimensionales (2D) altamente ordenados en condiciones favorables. La calidad de los cristales 2D cultivados es crucial para la resolución de la reconstrucción final a través del procesamiento de imágenes 2D. A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D de proteínas de membrana integral, pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa. Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua de tal manera que los grupos de cabeza lipídica polar permanecen hidratados en la fase acuosa y las cadenas de acilo no polares, las colas se dividen en el aire, rompiendo la tensión superficial y aplanando la superficie del agua. La naturaleza cargada o las partículas químicas distintivas de los grupos de cabeza proporcionan afinidad por las proteínas en solución, promoviendo la unión para la formación de matrices 2D. Una monocapa recién formada con la matriz 2D se puede transferir fácilmente a un microscopio electrónico (EM) en una rejilla de cobre recubierta de carbono utilizada para levantar y soportar la matriz cristalina. En este trabajo, describimos una metodología monocapa lipídica para imágenes criogénicas microscópicas electrónicas (crio-EM).
Introduction
La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos1. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector4. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula5. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua6, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica18. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina2,25,la anexina V26,la toxina del cólera27,la subunidad28de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma31 y las proteínas de la cápside del VIH-132 y el virus de la leucemia murina de Moloney 33. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM34. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.
Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.
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Protocol
1. Preparación del bloque de teflón
- Prepare el bloque de teflón a partir de resina de PTFE (politetrafluoroetileno) resistente a los productos químicos. Haga taladros en el bloque utilizando un taladro general seguido de las dimensiones etiquetadas en la Figura 1.
2. Preparación lipídica monocapa
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 30- 45 minutos
- Preparación de stock de lípidos
- Preparar una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en cloroformo/metanol 9:1 (v/v) utilizando 8,91 ml de cloroformo, 0,99 ml de metanol y 0,01 ml de lípidos de 10 mg/ml.
- Preparación de placas de teflón
- Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante 5 minutos.
- Lavar con agua caliente durante 15 minutos.
- Enjuague con agua destilada.
- Seque la placa de teflón en un desecador durante 30 minutos y manténgala al vacío cuando no esté en uso(Figura 1).
3. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas
- Prepare recién una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en una mezcla 9:1 de cloroformo/metanol el día del experimento.
- Coloque un papel de filtro Tipo 1 en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro.
- Llene los pozos de la placa de teflón con 60 μL del tampón.
- Agregue cuidadosamente la mezcla de lípidos en la parte superior de la superficie tampón gota a gota (idealmente 1 μL por gota) usando una jeringa Hamilton.
- Humedezca el papel de filtro con agua destilada para mantener la humedad en la placa de Petri.
- Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. El cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie del tampón.
4. Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas
- Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono agujereada sin descarga de resplandor, con el lado de carbono hacia abajo, en la parte superior de cada depósito de amortiguación.
- Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral. Utilice las concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de 1 μM de proteína como punto de partida. Pre-optimizar la concentración de proteínas antes del experimento.
- Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
- Inyecte suavemente aproximadamente 20-30 μL de tampón en el puerto de inyección lateral. Esto elevará la cuadrícula por encima de la superficie del bloque de teflón.
- Inmediatamente levante la rejilla con una pinza y levántela verticalmente de la gota.
- Preparar muestras monocapa para tinción negativa o imágenes crio-TEM (Figura 2). Si las proteínas forman una matriz 2D, el espectro de potencia de la imagen o el periodograma de Fourier mostrarán intensidades de difracción en las frecuencias espaciales basadas en la simetría cristalina. Si no se muestran puntos de difracción en el espectro de potencia, es poco probable que las proteínas formen un cristal 2D.
- Compruebe la cobertura de la monocapa lipídica en la red EM utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Una imagen de electrones de menor magnificado es útil para identificar la morfología de la monocapa cubierta. Por lo general, el contraste de imagen del área cubierta de monocapa será ligeramente menor que el de las áreas descubiertas. Además, el espectro de potencia de imagen 2D calculado ayudará a identificar la ubicación del cristalino 2D.
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Representative Results
Una monocapa lipídica depositada en la rejilla EM se puede visualizar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) sin tinción. La presencia monocapa se puede reconocer por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en la trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste local más bajo que las que no tienen cobertura, ya que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión y muestra una iluminación más brillante(Figura 3).
Para evaluar las condiciones para la cristalización monocapa 2D, investigue la imagen de la muestra utilizando imágenes EM de tinción negativa o imágenes crio-EM. Si la monocapa cubre los agujeros podría observarse mediante un contraste de borde más fuerte cuando el escenario está inclinado. Si se forma un cristal, el espectro de potencia de la imagen o el periodograma mostrarán los puntos de Fourier o de difracción. Los cristales en tamaños pequeños (< 200 nm) y orientados al azar pueden mostrar anillos de alta intensidad en el espectro de potencia. Si los cristales no crecen, el espectro de potencia no mostrará puntos de Fourier.
Figura 1. Bloque de teflón utilizado para la formación de monocapa lipídica. Un bloque de teflón se muestra en las vistas superior (arriba) y sección transversal (abajo). Contiene 12 pozos dispuestos en seis filas y dos columnas. El pozo tampón principal etiquetado A, que se muestra en azul más oscuro, en el medio tiene 4 mm de diámetro y 5 mm de profundidad con volúmenes de muestra de 60 μL. La monocapa se forma en la parte superior del reservorio tampón en el pozo principal y las proteínas se inyectan a través del puerto lateral etiquetado B que se muestra en azul claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Presentación esquemática del desarrollo del cristal 2D sobre monocapa lipídica. El reservorio de amortiguamiento se llena primero con el tampón, seguido por el lípido depositado en la parte superior del pozo. El lado de carbono de una rejilla EM se coloca en la monocapa lipídica, que interactuará con las colas hidrofóbicas. Primero, las proteínas se inyectan a través del pozo de inyección lateral B (paso 1). Con el tiempo, las proteínas se organizan en una red cristalina 2D e interactúan con los grupos de cabeza lipídica (paso 2). Para recoger la rejilla EM para un análisis posterior, se utiliza una pinza para levantar la rejilla del depósito de amortiguación verticalmente (paso 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ejemplo de la cobertura de monocapa lipídica en una rejilla EM. Se obtuvo una imagen de una rejilla EM recubierta de carbono monocapa y agujereada sin tinción utilizando un microscopio electrónico de transmisión CM12 de Philips a temperatura ambiente. La flecha naranja indica el área que no tiene cobertura de monocapa lipídica, y las flechas azules indican la cobertura completa de la monocapa lipídica en el orificio de la rejilla. La barra de escala es de 0,5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una monocapa lipídica es una poderosa herramienta que facilita el crecimiento de grandes cristales 2D para estudios estructurales de macromoléculas biológicas. Para preparar con éxito una monocapa lipídica intacta en la interfaz aire-agua, se recomienda encarecidamente que los lípidos se preparen recién el día del experimento, ya que la oxidación de la cadena de acil lipídico podría provocar la interrupción del empaquetamiento en la monocapa y afectar negativamente la formación de cristales resultante. Los lípidos comprados en forma de polvo deben disolverse utilizando una mezcla de cloroformo: disolvente de metanol, que se usa comúnmente para disolver fosfolípidos35. El disolvente de cloroformo:metanol puede ser prefabricado y almacenado en un vial de vidrio sellado. Mientras los lípidos disueltos se aplican en la interfaz aire-agua, espere hasta que el disolvente cloroformo:metanol se evapore completamente del tampón. El tiempo de espera adecuado para la formación de monocapa lipídica y la formación de cristales 2D es esencial en este experimento. Por lo general, la formación de una monocapa lipídica y matrices 2D puede tener lugar dentro de aproximadamente 30 a 60 minutos del tiempo de incubación18.
Cuando una monocapa lipídica se forma correctamente, asegúrese de que la formación de la matriz de cristales 2D pueda ser promovida por el lípido de manera efectiva. La composición tampón debe optimizarse para estabilizar el establecimiento de matrices 2D, especialmente cuando se utiliza lípido DOGS-NTA-Ni18,36. El éxito de la cristalización lipídica monocapa para este lípido puede verse afectado si hay altas concentraciones de EDTA (etilendiaminatetraacetato), TDT (1,4-ditiotreitol) o varios iones en el tampón. El quelante soluble EDTA puede alterar el complejo iónico-proteína lípido-metal36. Un ejemplo de esto es la interacción de la proteína estreptavidina con el lípido iminodiacetato-Cu (II); la adición de EDTA elimina El Cu (II) e interrumpe el complejo de iones lípido-metal-proteína20. Por lo tanto, la muestra puede necesitar ser diluida o intercambiada en tampón para eliminar el EDTA, lo que permite una unión más fuerte de la proteína y promueve la formación de cristales. La optimización del búfer debe hacerse antes de agregarlo al depósito de búfer en el bloque de teflón.
Para preservar el detalle estructural de alta resolución del cristal 2D, es fundamental mantener la planitud de la muestra. Sin embargo, debido a la tensión superficial, las capacidades caloríficas diferenciales entre la muestra y el soporte o la intervención humana, no es trivial mantener la planitud del cristal 2D durante la transferencia de la muestra. Cuando la rejilla EM se levanta del depósito de amortiguación, se debe operar con la menor perturbación posible para dejar intacta la interfaz monocapa. Cualquier rotación o movimiento drástico de la rejilla puede fracturar la interfaz monocapa. Esto también se aplica a los pasos de congelación de muestras, donde la rejilla con cristales debe manejarse con cuidado y congelarse rápidamente para evitar cristales de hielo, que pueden dañar los cristales de proteína 2D recién formados.
Se puede usar una rejilla recubierta de carbono de encaje para soportar monocapas en diferentes tamaños, dependiendo de los tamaños de agujero en la película de carbono de encaje. La planitud de la interfaz monocapa puede verse afectada por varios tamaños de orificios en la película de carbono de encaje, lo que puede ayudar a proyectar una monocapa plana con las intensidades de difracción en direcciones isotrópicas.
Existen cuatro métodos comunes utilizados para cultivar y desarrollar cristales 2D para estudios estructurales: diálisis, dilución, adsorción hidrofóbica y monocapa lipídica37,38,39. El método de diálisis elimina los detergentes que se utilizan para solubilizar las proteínas de membrana en el primer paso de la purificación. Los cristales 2D se cultivan reconstituyendo proteínas de membrana solubilizadas con detergente en bicapas lipídicas en condiciones favorables35. Para que la reconstitución tenga lugar, los detergentes deben eliminarse mediante diálisis. Por lo tanto, el método de diálisis ayuda a impulsar la formación de cristales 2D40. Sin embargo, el método de diálisis suele llevar mucho tiempo, especialmente para detergentes con una pequeña concentración crítica de micelas (CMC). La formación de matrices 2D también se puede lograr a través de una dilución controlada. Este método proporciona una proporción establecida para la mezcla de proteína, lípido y detergente para inducir la formación de cristales si la concentración de detergente cae por debajo de su CMC. Esto podría ser facilitado por una máquina de dilución específica para llevar a cabo el trabajo comenzando con una mayor concentración inicial deproteínas 41. Además, la adsorción hidrofóbica provoca el crecimiento de cristales 2D mediante el uso de perlas de poliestireno (por ejemplo, bioperlas) para eliminar los detergentes de bajo CMC42. Si la proteína de interés se solubiliza con detergentes cmc altos, este método no es el ideal. Por el contrario, el método de monocapa lipídica es versátil y proporciona pasos no enrevesados para la cristalización 2D43. Como se discutió aquí, se requiere un aparato simple y algunos materiales para llevar a cabo los experimentos. Con nuestro método, el tiempo total necesario para el experimento se puede acortar a 4 horas17. A pesar de que la optimización previa de ciertos parámetros, como la concentración de proteínas y los componentes tampón, aún puede ser necesaria de antemano, es posible maximizar la eficiencia en el trabajo de laboratorio de rutina.
Para cristalizar proteínas de membrana integral utilizando una monocapa lipídica, se debe probar si la concentración de detergente para solubilizar proteínas y lípidos perturba la interfaz monocapa. Generalmente, se sugiere utilizar la concentración de detergente inferior a la CMC 44. En los casos en que la interfaz monocapa sea sensible a la existencia del detergente, un enfoque alternativo puede ser formar la monocapa lipídica utilizando fluoro-lípidos, que apenas son solubilizados por detergente y ampliar la aplicabilidad de la cristalización integral de proteínas de membrana utilizando el método monocapa45.
Aunque el método de monocapa lipídica es simple y menos costoso, la reproducibilidad de la preparación de monocapa depende de varios factores, como la humedad ambiental y la temperatura. El éxito de la transferencia de muestras para imágenes crio-EM se basa en un manejo cuidadoso de la muestra. En algunos casos, puede ser difícil obtener resultados de alta resolución por parte de un principiante o en la fase inicial de un nuevo proyecto de investigación.
En conclusión, el método de la monocapa lipídica ofrece una oportunidad para estudiar las estructuras de las proteínas debido a su simplicidad. Puede proporcionar un enfoque alternativo para facilitar el proceso de formación de cristales 2D.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.
Acknowledgments
La preparación de este manuscrito fue parcialmente apoyada por la Oficina de Investigación del Ejército de los Estados Unidos (W911NF2010321) y los fondos iniciales de la Universidad Estatal de Arizona para P.-L.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
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