Summary
지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.
Abstract
전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.
Introduction
2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본6내에서 발생하는 동적 산란없이 전자 전송에 적합합니다. 전자 결정학적 연구는 멤브레인 단백질및 지질 단백질 상호작용7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17의고해상도 구조 정보를 조사하는 강력한 도구로 나타났다.
지질 단층은 공기-물 인터페이스6에서조밀하게 포장된 인지질으로 구성된 단일 지질 층으로, 용해성 단백질 또는 말초막단백질(18)에대한 2D 어레이 형성을 지원할 수 있다. 지질의 밀도와 측면 압력에 따라 지질 분자는 수성 용액1,6,19에노출된 공기 및 친수성 헤드그룹에 확장된 아실 사슬을 사용하여 공기-물 인터페이스에 정렬된 2D 어레이를 형성할 수 있다. 지질 헤드그룹은 정전기 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있거나 특정 단백질 도메인을 결합하기 위한 친화성 태그를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카박스티펜틸)이 iminodiacetic acid]]2-Ni 2+)는폴리-히티딘 태그20,21로단백질을 묶는 지질 단층층을 형성하는 데 자주 사용된다. 또한, 콜레라 독소 B는 구조적 연구를 위한 지질 단층에서 간질산 GM1의 특정 펜타카라이드를 결합할 수있다(23,24). 지질 헤드그룹에 단백질을 고정함으로써 지질 단층은 고해상도 전자 결정연구를 위해 얇은 2D 어레이의 형성을 지원할 수 있습니다. 지질 단층 기술은 단백질의 구조 연구를 위한 전자 결정학에서 사용되었습니다, 예를 들어 스트렙타비딘2,25,부속서 V26,콜레라 독소27, 대장균 RNA 폴리머라제25,29,30,카박스형 쉘 단백질31 및 HIV-132 및 몰론 황두균 바이러스의 캡시드 단백질 33.지질 단층의 안정성 과 화학적 특성으로 인해, 시료 준비를 위한 다른 응용 분야는 극저온-EM이미징(34)에대해 탐구되었다. 그러나, 단백질 어레이 형성을 위해 최적화가 필요합니다.
여기에서, 우리는 극저온-EM 화상 진찰을 위한 지질 단층의 일반적인 준비의 광대한 세부 사항 및 형성된 단층의 질에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 고려사항을 제공합니다.
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Protocol
1. 테플론 블록 준비
- 화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다.
2. 모노레이어 지질 제제
참고: 예상 작동 시간: 30-45분
- 지질 재고 준비
- 9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 mg/mL 지질 혼합물을 준비하여 8.91mL의 클로로폼, 메탄올 0.99mL, 10 mg/mL 지질의 0.01mL를 사용한다.
- 테플론 플레이트 준비
- 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다.
- 뜨거운 물로 15분간 씻으시면 됩니다.
- 증류수로 헹구는 다.
- 데프론 플레이트를 건조기에서 30분 간 건조시키고 사용하지 않을 때진공 상태로 유지하십시오(그림1).
3. 완충 저수지에 지질 단층의 형성
참고: 예상 작동 시간: 1.5시간
- 실험 당일 클로로폼/메탄올의 9:1 혼합물에서 0.01 mg/mL의 지질 혼합물을 신선하게 준비한다.
- 페트리 접시에 Type-1 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다.
- 테플론 플레이트의 우물을 버퍼의 60 μL로 채웁니다.
- 조심스럽게 해밀턴 주사기를 사용하여 드롭 (이상적으로 드롭 당 1 μL)에 의해 드롭 버퍼 표면 드롭의 상단에 지질 혼합물을 추가합니다.
- 페트리 접시에 습도를 유지하기 위해 증류수로 필터 용지를 적시십시오.
- 실온에서 60분 동안 배양하세요. 클로로폼은 증발해야 하며, 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.
4. 지질 단층상에 EM 그리드 의 적용
참고: 예상 작동 시간: 1.5시간
- 각 버퍼 저장소의 상단에 빛을 배출하지 않고, 탄소 면을 아래로 가볍게 놓습니다.
- 조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입. 단백질의 약 1 μM 주위에 있는 마지막 단백질 농도를 출발점으로 사용하십시오. 실험 전에 단백질 농도를 미리 최적화합니다.
- 실온에서 60분 동안 배양하세요.
- 측면 사출 포트에 약 20-30 μL의 버퍼를 부드럽게 주입합니다. 이렇게 하면 테플론 블록의 표면 위에 그리드가 올립니다.
- 즉시 트위저로 그리드를 들고 물방울에서 수직으로 들어 올립니다.
- 음극 염색 또는 저온-TEM 이미징을 위한 단층 샘플을준비(그림 2). 단백질이 2D 어레이를 형성하는 경우, 이미지 파워 스펙트럼 또는 Fourier 주기도는 결정 대칭에 기초하여 공간 주파수에서 회절 강도를 표시합니다. 전력 스펙트럼에 회절 반점이 표시되지 않으면 단백질은 2D 결정을 형성할 가능성이 낮습니다.
- 전염 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EM 그리드에서 지질 단층의 커버리지를 확인한다. 낮은 확대 전자 이미지는 덮여 단층의 형태를 식별하는 데 도움이됩니다. 일반적으로 단층으로 덮인 영역의 이미지 대비는 발견된 영역보다 약간 낮습니다. 또한, 계산된 2D 이미지 파워 스펙트럼은 2D 결정선의 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다.
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Representative Results
EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다.
2D 단층 결정화의 조건을 검사하려면 네거티브 얼룩 EM 또는 극저온-EM 이미징을 사용하여 시편의 이미지를 조사합니다. 단층이 구멍을 덮는지 여부는 스테이지가 기울어질 때 더 강한 가장자리 대비로 관찰될 수 있습니다. 결정이 형성되면 이미지 전원 스펙트럼 또는 주기각표가 포리에 또는 회절 반점을 표시합니다. 작은 크기(< 200nm)의 크리스탈과 임의로 지향되는 결정은 전력 스펙트럼에서 고강도 링을 나타낼 수 있다. 결정이 재배되지 않으면 파워 스펙트럼에 Fourier 반점이 표시되지 않습니다.
그림 1. 지질 단층 형성에 사용되는 테플론 블록. 테프론 블록은 위(위) 및 단면(아래) 뷰에 표시됩니다. 6개의 행과 2개의 열로 배열된 12개의 우물이 포함되어 있습니다. 메인 버퍼는 어두운 파란색으로 표시된 A로 잘 표시되었으며, 중간에는 직경 4mm, 깊이는 60 μL 샘플 볼륨이 있습니다. 단층은 주요 우물의 완충 저수지 위에 형성되고 단백질은 밝은 파란색으로 표시된 B라고 표시된 측면 포트를 통해 주입된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 지질 단층상에 2D 결정의 발달의 회로도 프리젠 테이션. 버퍼 저장소는 먼저 버퍼로 채워지며, 그 다음에는 우물 위에 증착된 지질이 뒤따릅니다. EM 그리드의 탄소 면은 소수성 꼬리와 상호 작용하는 지질 단층위에 배치됩니다. 첫째, 단백질은 측면 주입 웰 B(1단계)를 통해 주입된다. 시간이 지남에 따라, 단백질은 2D 결정 격자로 배열되고 지질 헤드 그룹 (2 단계)과 상호 작용합니다. 추가 분석을 위해 EM 그리드를 선택하려면, 트위저가 버퍼 저장소에서 그리드를 수직으로 들어 올리는 데 사용됩니다(3단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. EM 그리드에서 지질 단층 커버리지의 예. 실온에서 필립스 CM12 전송 전자 현미경을 사용하여 염색하지 않은 단층 및 구멍이 있는 탄소 코팅 EM 그리드를 이미지화하였다. 주황색 화살표는 지질 단층 커버리지가 없는 영역을 나타내고 파란색 화살표는 그리드 구멍에 있는 지질 단층의 전체 커버리지를 나타냅니다. 스케일 바는 0.5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적으로인지질(35)을용해시키는 데 사용되는 클로로폼:메탄올 용매의 혼합물을 사용하여 용해되어야 한다. 클로로폼:메탄올 용매는 밀봉된 유리 바이알에 미리 만들어 보관할 수 있다. 용존지질은 공기-물 인터페이스에 적용되는 동안 클로로폼:메탄올 용매가 완충제에서 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 지질 단층의 형성과 2D 결정의 형성을 위한 적당한 대기 시간은 이 실험에서 필수적입니다. 전형적으로, 지질 단층 및 2D 어레이의 형성은 인큐베이션 시간18의약 30 60 분 이내에 일어날 수 있다.
지질 단층이 제대로 형성되면 지질에 의해 2D 결정 어레이 형성을 효과적으로 촉진할 수 있는지 확인하십시오. 완충 조성물은 2D 어레이의 확립을 안정화하도록 최적화되어야 하며, 특히 DOGS-NTA-Ni 지질이18,36을사용하는 경우 더욱 이 수있습니다. 이러한 지질에 대한 지질 단층 결정화의 성공은 EDTA(에틸렌디아민테트라아테이트), DTT(1,4-디티오트레이톨) 또는 완충제의 다양한 이온의 고농도가 있는 경우 영향을 받을 수 있다. 수용성 첼레이터 EDTA는 지질 금속 이온 단백질복합체(36)를방해할 수 있다. 이것의 한 예는 비노이아테이트-Cu (II) 지질을 가진 연쇄상 비딘 단백질 상호 작용입니다; EDTA의 첨가는 Cu(II)를 제거하고 지질금속 이온 단백질복합체(20)를차단한다. 따라서, 시료는 EDTA를 제거하기 위해 희석되거나 완충이 교환되어야 할 수 있으며, 단백질의 강한 결합을 허용하고 결정 형성을 촉진할 수 있다. 테플론 블록의 버퍼 저장소에 버퍼 저장소를 추가하기 전에 버퍼의 최적화를 수행해야 합니다.
2D 결정의 고해상도 구조 적 세부 사항을 보존하려면 시편 평탄도를 유지하는 것이 중요합니다. 그러나, 표면 장력, 시편 및 지지체 또는 인간의 개입 사이의 차동 열 용량으로 인해, 시료 전달 시 2D 결정의 평탄도를 유지하는 것은 사소한 일이 아니다. 완충 저장소에서 EM 그리드를 해제하면 단층 인터페이스를 그대로 두려면 가능한 한 적은 방해로 작동해야 합니다. 그리드의 급격한 회전 또는 이동은 단층 인터페이스를 파괴할 수 있습니다. 이것은 또한 새로 형성된 2D 단백질 결정을 손상시킬 수 있는 얼음 결정을 피하기 위하여 결정이 있는 격자를 주의하고 급속하게 동결해야 하는 견본 동결 단계에 적용됩니다.
레이스 카본 필름의 구멍 크기에 따라 다양한 크기의 단층층을 지원하기 위해 레이스 카본 코팅 그리드를 사용할 수 있습니다. 단층 인터페이스의 평탄도는 레이스 카본 필름의 다양한 구멍 크기에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 등위위방향에서 회절 강도로 평평한 단층을 스크린하는 데 도움이 될 수 있다.
투석, 희석, 소수성 흡착 및 지질 단층37,38,39: 구조 연구를위한 2D 결정을 성장하고 개발하는 데 사용되는 네 가지 일반적인 방법이 있습니다. 투석 방법은 정화의 초기 단계에서 막 단백질을 용해시키는 데 사용되는 세제를 제거합니다. 2D 결정은 세제 용용막 단백질을 유리한 조건 하에서 지질 이중층으로 재구성하여재배된다(35). 재구성이 이루어지려면 투석에 의해 세제를 제거해야합니다. 따라서 투석 방법은 2D결정(40)의형성을 유도하는 데 도움이 된다. 그러나 투석 방법은 일반적으로 시간이 많이 소요되며, 특히 작은 임계 미셀 농도(CMC)를 가진 세제의 경우 시간이 많이 소요됩니다. 2D 어레이의 형성은 또한 제어희석을 통해 달성될 수 있다. 이 방법은 세제 농도가 CMC 이하로 떨어지면 결정 형성을 유도하기 위해 단백질 지질 세제 혼합물에 대한 설정 비율을 제공한다. 이는 보다 높은 초기 단백질농도(41)로시작하여 작업을 수행하기 위해 특정 희석 기계에 의해 촉진될 수 있다. 또한, 소수성 흡착은 낮은 CMC세제(42)를제거하기 위해 폴리스티렌 구슬(예를 들어, 바이오비드)을 사용하여 2D 결정의 성장을 유도한다. 관심있는 단백질이 높은 CMC 세제로 용해되면이 방법은 이상적이지 않습니다. 대조적으로, 지질 단층 방법은 다재다능하며 2D결정화(43)를위한 비복잡한 단계를 제공한다. 여기서 설명한 바와 같이, 실험을 수행하기 위해서는 간단한 장치와 일부 물질이 필요합니다. 우리의 방법을 사용하면 실험에 필요한 총 시간을 4 시간17로단축 할 수 있습니다. 단백질 농도 및 완충 성분과 같은 특정 파라미터의 사전 최적화는 여전히 사전에 필요할 수 있지만 일상적인 실험실 작업에서 효율성을 극대화할 수 있습니다.
지질 단층층을 사용하여 일체형 멤브레인 단백질을 결정화하기 위해, 단백질과 지질용 세제 농도가 단층 인터페이스를 방해하는지 여부를 테스트해야 합니다. 일반적으로, CMC(44)보다낮은 세제 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 단층 인터페이스가 세제 존재에 민감한 경우, 세제에 의해 거의 용해되지 않는 플루오로 지질을 사용하여 지질 단층을 형성하고 모노레이어방법을사용하여 일체형 막 단백질 결정화의 적용성을 확대하는 대안적 접근법이 될 수 있다.
지질 단층 방법은 간단하고 비용이 적게 드는 방법이지만, 단층 제제의 재현성은 주변 습도 및 온도와 같은 다양한 요인에 달려 있습니다. 저온-EM 이미징을 위한 샘플 전달의 성공은 신중한 시편 처리에 달려 있습니다. 어떤 경우에는 초보자또는 새로운 연구 프로젝트의 시작 단계에서 고해상도 결과를 얻는 것이 어려울 수 있습니다.
결론적으로, 지질 단층 방법은 단순성 때문에 단백질 구조를 공부할 수 있는 기회를 제공합니다. 2D 결정 형성의 과정을 용이하게 하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고의 준비는 부분적으로 P.-L.C에 미 육군 연구 실 (W911NF2010321)과 애리조나 주립 대학 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
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