Summary
Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.
Abstract
Elektronenkristallografie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van structuren met hoge resolutie. Macromoleculen zoals oplosbare of membraaneiwitten kunnen onder gunstige omstandigheden worden gekweekt tot zeer geordende tweedimensionale (2D) kristallen. De kwaliteit van de gekweekte 2D kristallen is cruciaal voor de resolutie van de uiteindelijke reconstructie via 2D beeldverwerking. In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie van integrale membraaneiwitten, maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om partitionering naar de monolaag te bevorderen. Een lipide monolaag vormt zich op het lucht-water interface zodanig dat de polaire lipidekopgroepen gehydrateerd blijven in de waterige fase en de niet-polaire, acylketens, staarten zich in de lucht afscheiden, waardoor de oppervlaktespanning wordt verbroken en het wateroppervlak wordt afgevlakt. De geladen aard of onderscheidende chemische eigenschappen van de kopgroepen bieden affiniteit voor eiwitten in oplossing, waardoor binding voor 2D-arrayvorming wordt bevorderd. Een nieuw gevormde monolaag met de 2D-array kan gemakkelijk worden overgedragen in een elektronenmicroscoop (EM) op een met koolstof gecoat koperen raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op te tillen en te ondersteunen. In dit werk beschrijven we een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronen microscopische (cryo-EM) beeldvorming.
Introduction
Elektronendiffractie door 2D-kristallen of spiraalvormige arrays van eiwitten kan sub-nanometerresoluties bereiken in gunstige gevallen1,2,3. Van bijzonder belang zijn gereconstitueerde 2D-membraaneiwitarrays of kristallen in hun near-native omgevingen1. Omdat een kristal fungeert als een signaalversterker die de intensiteit van de structurele factoren bij specifieke ruimtelijke frequenties verbetert, maakt elektronenkristallografie het mogelijk om een doelwit te onderzoeken met een kleinere grootte bij hoge resoluties, zoals kleine moleculen, dan die voor cryo-EM met één deeltje. De elektronenbundel kan worden gediffracteerd door een geordende 2D-array van eiwitten, waardoor een diffractiepatroon of een roosterbeeld wordt gegenereerd, afhankelijk van waar het beeldvlak wordt geregistreerd op de detector4. De diffracted intensiteiten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en verwerkt om een 2D-projectiestructuur van het kristal te reconstrueren. Elektronen hebben een grotere verstrooiingsdoorsnede dan röntgenstralen en de verstrooiing ervan volgt meestal het Rutherford-model op basis van de Coulomb-interactie tussen de elektronen en de geladen atomen in het molecuul5. De diktes van 2D-membraankristallen zijn meestal minder dan 100 nm, geschikt voor elektronenoverdracht zonder dynamische verstrooiing binnen monster6. Van elektronkristallografische studies is aangetoond dat het een krachtig hulpmiddel is om structurele informatie met hoge resolutie van membraaneiwitten en lipide-eiwitinteracties7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17te onderzoeken.
Een lipide monolaag is een enkele lipidelaag die bestaat uit fosfolipiden die dicht opeengepakt zijn op een lucht-waterinterface6, die de vorming van 2D-arrays voor oplosbare eiwitten of perifere membraaneiwitten kan helpen18. Afhankelijk van de dichtheid van de lipiden en hun laterale druk, kunnen de lipidemoleculen een geordende 2D-array vormen op de lucht-waterinterface met hun acylketens uitgebreid naar de lucht en hydrofiele hoofdgroepen blootgesteld in de waterige oplossing1,6,19. De lipidehoofdgroep kan interageren met eiwitten via elektrostatische interactie of kan worden aangepast om een affiniteitstag te bieden om een specifiek eiwitdomein te binden. Bijvoorbeeld, de DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) wordt vaak gebruikt bij het vormen van een lipide monolaag om de eiwitten te binden met een poly-histidine tag20,21,22. Ook kan het choleratoxine B een bepaalde pentasaccharide van ganglioside GM1 binden in een lipide monolaag voor structurele studies23,24. Door de eiwitten op de lipidehoofdgroepen te verankeren, kan de lipide monolaag helpen bij de vorming van de 2D-arrays die dun zijn voor elektronenkristallografische studies met hoge resolutie. De lipide monolayer techniek is gebruikt in de elektronenkristallografie voor structurele studies van eiwitten, zoals streptavidin2,25,annexine V26,cholera toxine27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase 25,29,30, carboxysome shell proteins31 en de capsid eiwitten van het HIV-132 en Moloney murine leukemie virus 33. Vanwege de stabiliteit en chemische eigenschap van de lipide monolaag, zijn verschillende toepassingen voor monstervoorbereiding onderzocht voor cryo-EM-beeldvorming34. Optimalisatie zal echter nodig zijn voor de vorming van eiwitarrays.
Hier geven we uitgebreide details over de algemene voorbereiding van lipide monolagen voor cryo-EM beeldvorming en enkele overwegingen die de kwaliteit van de gevormde monolagen kunnen beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het teflonblok
- Bereid het teflonblok voor uit chemisch resistente PTFE-hars (polytetrafluorethyleen). Maak gaten in het blok met behulp van een algemene boor gevolgd door de afmetingen die zijn gelabeld in figuur 1.
2. Monolaags lipidepreparaat
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 30- 45 minuten
- Lipidenvoorraad voorbereiding
- Bereid een lipidenmengsel van 0,01 mg / ml in 9:1 (v / v) chloroform / methanol met behulp van 8,91 ml chloroform, 0,99 ml methanol en 0,01 ml 10 mg / ml lipiden.
- Teflon plaat voorbereiding
- Soniceer een teflonplaat in een methanolbad gedurende 5 minuten.
- Wassen met heet water gedurende 15 minuten.
- Afspoelen met gedestilleerd water.
- Droog de teflonplaat gedurende 30 minuten in eensiccator en houd deze onder vacuüm wanneer deze niet in gebruik is(figuur 1).
3. Vorming van lipide monolaag op bufferreservoir
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1,5 uur
- Bereid op de dag van het experiment een lipidenmengsel van 0,01 mg/ml in een 9:1 mengsel van chloroform/methanol.
- Plaats een Type-1 filterpapier in een petrischaaltje en schik het teflonblok bovenop het filterpapier.
- Vul de putjes van de teflonplaat met 60 μL van de buffer.
- Voeg voorzichtig druppelsgeer voor druppel (idealiter 1 μL per druppel) een lipidenmengsel toe aan het bufferoppervlak met behulp van een Hamilton-spuit.
- Maak het filtreerpapier nat met gedestilleerd water om de vochtigheid in de petrischaal te houden.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. Het chloroform moet verdampen en er moet een monolaag lipide op het oppervlak van de buffer worden gevormd.
4. Toepassing van een EM-raster op een lipide monolaag
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1,5 uur
- Plaats voorzichtig een gatachtig koolstofgecoat EM-rooster zonder gloeiende ontlading, koolstofzijde naar beneden, op de bovenkant van elk bufferreservoir.
- Injecteer voorzichtig eiwitten in de zijinjectieput. Gebruik de uiteindelijke eiwitconcentraties in de put rond 1 μM eiwit als uitgangspunt. Optimaliseer de eiwitconcentratie vooraf voor het experiment.
- Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Injecteer voorzichtig ongeveer 20-30 μL buffer in de injectiepoort aan de zijkant. Hierdoor wordt het raster boven het oppervlak van het teflonblok opgetild.
- Pak het rooster meteen op met een pincet en til het verticaal van de druppel.
- Monolaagmonsters voorbereiden op negatieve kleuring of cryo-TEM-beeldvorming(figuur 2). Als de eiwitten een 2D-array vormen, zal het beeldvermogensspectrum of fourier-periodogram diffractie-intensiteiten vertonen op de ruimtelijke frequenties op basis van de kristalsymmetrie. Als er geen diffractievlekken worden getoond in het vermogensspectrum, is het onwaarschijnlijk dat de eiwitten een 2D-kristal vormen.
- Controleer de dekking van de lipide monolaag op het EM-net met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Een lager vergroot elektronenbeeld is nuttig om de morfologie van de bedekte monolaag te identificeren. Meestal zal het beeldcontrast van het met monolaag bedekte gebied iets lager zijn dan dat van de onbedekte gebieden. Bovendien zal het berekende 2D-beeldvermogensspectrum helpen bij het identificeren van de locatie van de 2D-kristallijne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een lipide monolaag afgezet op het EM-raster kan worden gevisualiseerd onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) zonder kleuring. De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in het bundelpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager lokaal contrast dan die zonder dekking, omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft en een helderdere verlichting vertoont(figuur 3).
Om de omstandigheden voor 2D-monolaagkristallisatie te screenen, onderzoekt u het beeld van het monster met behulp van negatieve-vlek EM- of cryo-EM-beeldvorming. Of de monolaag de gaten bedekt, kan worden waargenomen door een sterker randcontrast wanneer het podium wordt gekanteld. Als een kristal wordt gevormd, zal het beeldkrachtspectrum of periodogram de Fourier- of diffractievlekken weergeven. Kristallen in kleine maten (< 200 nm) en willekeurig georiënteerd kunnen ringen met een hoge intensiteit in het vermogensspectrum vertonen. Als de kristallen niet worden gekweekt, zal het vermogensspectrum geen Fouriervlekken vertonen.
Figuur 1. Teflon blok gebruikt voor lipide monolaag vorming. Een teflonblok wordt weergegeven in de bovenste (boven) en doorsnede (onder) weergaven. Het bevat 12 putten gerangschikt in zes rijen en twee kolommen. De hoofdbuffer met het label A, weergegeven in donkerder blauw, in het midden is 4 mm in diameter en 5 mm diep met 60 μL monstervolumes. De monolaag wordt gevormd bovenop het bufferreservoir in de hoofdput en eiwitten worden geïnjecteerd via de zijpoort met het label B die in lichtblauw wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische presentatie van de ontwikkeling van 2D-kristal op lipide monolaag. Het bufferreservoir wordt eerst gevuld met de buffer, gevolgd door het lipide dat bovenop de put wordt afgezet. De koolstofzijde van een EM-raster wordt op de lipide monolaag geplaatst, die zal interageren met de hydrofobe staarten. Eerst worden eiwitten via de zijinjectieput B ingespoten (stap 1). Na verloop van tijd worden de eiwitten gerangschikt in een 2D-kristalrooster en interageren ze met de lipidekopgroepen (stap 2). Om het EM-rooster op te pakken voor verdere analyse, wordt een pincet gebruikt om het rooster verticaal van het bufferreservoir te tillen (stap 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorbeeld van de lipide monolaag dekking op een EM grid. Een monolayer- en holey carbon-gecoat EM-raster zonder kleuring werd afgebeeld met behulp van een Philips CM12 transmissie-elektronenmicroscoop bij kamertemperatuur. De oranje pijl geeft het gebied aan dat geen lipide monolaagdekking heeft en de blauwe pijlen geven de volledige dekking van de lipide monolaag in het rastergat aan. Schaalbalk is 0,5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een lipide monolaag is een krachtig hulpmiddel dat de groei van grote 2D-kristallen vergemakkelijkt voor structurele studies van biologische macromoleculen. Om met succes een intacte lipide monolaag op het lucht-water interface te bereiden, wordt het sterk aanbevolen dat de lipiden vers worden bereid op de dag van het experiment, omdat oxidatie van de lipide acylketen kan leiden tot verstoring van de verpakking in de monolaag en de resulterende kristalvorming nadelig kan beïnvloeden. Gekochte lipiden in poedervorm moeten worden opgelost met behulp van een mengsel van chloroform: methanoloplosmiddel, dat vaak wordt gebruikt om fosfolipiden op te lossen35. Het chloroform:methanol oplosmiddel kan vooraf worden gemaakt en worden opgeslagen in een verzegelde glazen injectieflacon. Terwijl de opgeloste lipiden worden aangebracht op het lucht-water-grensvlak, wacht u tot het chloroform:methanol-oplosmiddel volledig uit de buffer verdampt. Een goede wachttijd voor de vorming van lipide monolaag en de vorming van 2D-kristallen is essentieel in dit experiment. Typisch kan de vorming van een lipide monolaag en 2D-arrays plaatsvinden binnen ongeveer 30 tot 60 minuten incubatietijd18.
Wanneer een lipide monolaag goed is gevormd, zorg er dan voor dat de vorming van de 2D-kristalarray effectief door het lipide kan worden bevorderd. De buffersamenstelling moet worden geoptimaliseerd om de oprichting van 2D-arrays te stabiliseren, vooral wanneer DOGS-NTA-Ni lipide wordt gebruikt18,36. Het succes van de lipide monolaag kristallisatie voor dit lipide kan worden beïnvloed als er hoge concentraties EDTA (ethyleendiaminetetraacetaat), DTT (1,4-dithiothreitol) of verschillende ionen in de buffer zijn. De oplosbare chelator EDTA kan het lipide-metaal ion-eiwit complex verstoren36. Een voorbeeld hiervan is de streptavidin eiwitinteractie met iminodiacetaat-Cu (II) lipide; de toevoeging van EDTA verwijdert Cu (II) en onderbreekt het lipide-metaal ion-eiwit complex20. Daarom moet het monster mogelijk worden verdund of buffer worden uitgewisseld om EDTA te verwijderen, waardoor een sterkere binding van eiwitten mogelijk wordt en kristalvorming wordt bevorderd. De optimalisatie van de buffer moet worden gedaan voordat deze wordt toegevoegd aan het bufferreservoir in het teflonblok.
Om het structurele detail met hoge resolutie van het 2D-kristal te behouden, is het van cruciaal belang om de vlakheid van het monster te behouden. Vanwege oppervlaktespanning, differentiële warmtecapaciteiten tussen het monster en de ondersteuning of menselijk ingrijpen, is het echter niet triviaal om de vlakheid van het 2D-kristal tijdens de monsteroverdracht te behouden. Wanneer het EM-rooster uit het bufferreservoir wordt getild, moet men het met zo min mogelijk verstoring bedienen om de monolaaginterface intact te laten. Elke drastische rotatie of beweging van het raster kan de monolaaginterface breken. Dit geldt ook voor monsterbevriezingsstappen, waarbij het raster met kristallen met zorg moet worden behandeld en snel moet worden ingevroren om ijskristallen te voorkomen, die de nieuw gevormde 2D-eiwitkristallen kunnen beschadigen.
Men kan een lacey carbon-gecoat rooster gebruiken om monolagen in verschillende maten te ondersteunen, afhankelijk van de gatgroottes op de lacey carbon film. De vlakheid van de monolaaginterface kan worden beïnvloed door verschillende gatgroottes op de lacey carbonfilm, wat kan helpen bij het screenen van een platte monolaag met de diffractie-intensiteiten in isotrope richtingen.
Er zijn vier veelgebruikte methoden om 2D-kristallen te laten groeien en ontwikkelen voor structurele studies: dialyse, verdunning, hydrofobe adsorptie en lipide monolaag37,38,39. De dialysemethode verwijdert de reinigingsmiddelen die worden gebruikt om membraaneiwitten op te slokken in de vroege stap van de zuivering. De 2D-kristallen worden gekweekt door detergent-opgeloste membraaneiwitten onder gunstige omstandigheden te reconstitueren tot lipide bilayers35. Om de reconstitutie te laten plaatsvinden, moeten detergentia worden verwijderd door dialyse. Daarom helpt de dialysemethode om de vorming van 2D-kristallen40te stimuleren . De dialysemethode is echter meestal tijdrovend, vooral voor detergentia met een kleine kritische micelconcentratie (CMC). De vorming van 2D-arrays kan ook worden bereikt via een gecontroleerde verdunning. Deze methode biedt een vaste verhouding voor het eiwit-lipide-wasmiddelmengsel om kristalvorming te induceren als de wasmiddelconcentratie onder de CMC daalt. Dit kan worden vergemakkelijkt door een specifieke verdunningsmachine om het werk uit te voeren, te beginnen met een hogere initiële eiwitconcentratie41. Bovendien leidt hydrofobe adsorptie tot de groei van 2D-kristallen door polystyreenparels (bijv. Bio-kralen) te gebruiken om de wasmiddelen met een laag CMC-cmc-bestand te verwijderen42. Als het eiwit van belang is oplosbaarheid met hoge CMC-detergenten, is deze methode niet ideaal. De lipide monolayer-methode is daarentegen veelzijdig en biedt niet-ingewikkelde stappen voor 2D-kristallisatie43. Zoals hier besproken, vereist het een eenvoudig apparaat en enkele materialen om de experimenten uit te voeren. Met onze methode kan de totale tijd die nodig is voor het experiment worden verkort tot 4 uur17. Hoewel pre-optimalisatie van bepaalde parameters, zoals eiwitconcentratie en buffercomponenten, nog steeds vooraf nodig kan zijn, is het mogelijk om iemands efficiëntie in routinematig laboratoriumwerk te maximaliseren.
Voor het kristalliseren van integrale membraaneiwitten met behulp van een lipide monolaag, moet men testen of de detergentconcentratie voor het oplosbare eiwit en lipiden de monolaaginterface verstoort. Over het algemeen wordt voorgesteld om de wasmiddelconcentratie lager dan de CMC 44te gebruiken. In gevallen dat de monolaaginterface gevoelig is voor het bestaan van het reinigingsmiddel, kan een alternatieve benadering zijn om de lipidemonolaag te vormen met behulp van fluorlipiden, die nauwelijks worden opgelost door detergent en de toepasbaarheid van integrale membraaneiwitkristallisatie uitbreiden met behulp van de monolaagmethode45.
Hoewel de lipide monolayer-methode eenvoudig en minder kostbaar is, hangt de reproduceerbaarheid van het monolaagpreparaat af van verschillende factoren, zoals omgevingsvochtigheid en temperatuur. Het succes van de monsteroverdracht voor cryo-EM-beeldvorming is afhankelijk van een zorgvuldige behandeling van het monster. In sommige gevallen kan het een uitdaging zijn om resultaten met een hoge resolutie te verkrijgen door een beginner of in de beginfase van een nieuw onderzoeksproject.
Kortom, de lipide monolayer-methode biedt een mogelijkheid voor het bestuderen van eiwitstructuren vanwege zijn eenvoud. Het kan een alternatieve benadering bieden om het proces van 2D-kristalvorming te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
De voorbereiding van dit manuscript werd gedeeltelijk ondersteund door het US Army Research Office (W911NF2010321) en de start-upfondsen van de Arizona State University aan P.-L.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
- Braun, T., Engel, A.
- Wang, H. -W., Wang, J. -W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
- Williams, D. B., Carter, C. B. Transmission electron microscopy. , Springer. New York, NY. (2016).
- Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
- Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
- Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
- Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
- Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
- Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
- Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
- Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
- Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
- Chiu, P. -L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
- Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
- Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
- Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
- Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
- Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
- Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
- Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
- Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
- Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
- Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
- Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
- Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
- Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
- Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
- Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
- Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
- Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
- Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
- Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
- Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
- Dietrich, J., nien-Bryan, C. Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , Imperial College Press. (2005).
- Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
- De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
- Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
- Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
- Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A.
- Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).
