Summary
Denne protokol beskriver brugen af kommercielle, cellefrie proteinekspressionssæt til fremstilling af membranproteiner understøttet i nanodisk, der kan bruges som antigener i underenhedsvacciner.
Abstract
Underenhedsvacciner giver fordele i forhold til mere traditionelle inaktiverede eller svækkede helcelleafledte vacciner i sikkerhed, stabilitet og standardfremstilling. For at opnå en effektiv proteinbaseret underenhedsvaccine skal proteinantigenet ofte vedtage en native-lignende konformation. Dette er især vigtigt for patogenoverfladeantigener, der er membranbundne proteiner. Cellefrie metoder er med succes blevet anvendt til at producere korrekt foldet funktionelt membranprotein gennem co-oversættelse af nanolipoproteinpartikler (NLP'er), almindeligvis kendt som nanodiske.
Denne strategi kan bruges til at producere underenhedsvacciner bestående af membranproteiner i et lipidbundet miljø. Imidlertid er cellefri proteinproduktion ofte begrænset til lille skala (<1 ml). Mængden af protein, der produceres i små produktionsserier, er normalt tilstrækkelig til biokemiske og biofysiske undersøgelser. Den cellefrie proces skal dog skaleres op, optimeres og omhyggeligt testes for at opnå nok protein til vaccinestudier i dyremodeller. Andre processer, der er involveret i vaccineproduktion, såsom oprensning, tilsætning af adjuvans og lyofilisering, skal optimeres parallelt. Dette papir rapporterer udviklingen af en opskaleret protokol til at udtrykke, rense og formulere en membranbundet proteinunderenhedsvaccine.
Opskalerede cellefrie reaktioner kræver optimering af plasmidkoncentrationer og -forhold, når der anvendes flere plasmidekspressionsvektorer, lipidudvælgelse og adjuvanstilsætning til produktion på højt niveau af formulerede nanolipoproteinpartikler. Metoden demonstreres her med ekspression af et chlamydial major ydre membranprotein (MOMP), men kan anvendes bredt på andre membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan evalueres in vivo gennem immuniseringsundersøgelser for at måle antistofproduktion, som demonstreret her.
Introduction
Prokaryote eller eukaryote lysater til cellefri ekspression af proteiner er let tilgængelige som kommercielle produkter til syntetisering af proteiner af interesse (for en fuldstændig gennemgang, se 1). Disse ekspressionssystemer er tilgængelige i forskellige skalaer og udnytter lysater fra forskellige organismer, herunder E. coli, tobaksplanter og pattedyrkulturer. Cellefri lysater tilbyder flere fordele i forhold til traditionelle rekombinante proteinproduktionsmetoder, herunder brugervenlighed og robust, hurtig proteinproduktion. Mens disse tilgange primært bruges til at producere opløselige proteiner, har denne gruppe været banebrydende for en tilgang til deres anvendelse til at udtrykke membranproteiner.
Denne nye tilgang foretager mindre ændringer af eksisterende cellefrie ekspressionssystemer ved at inkludere DNA, der koder for to proteinprodukter til ekspression, et apolipoprotein og membranproteinet af interesse. Det udtrykte apolipoprotein (derivater af enten ApoA1 eller ApoE4) interagerer med lipider tilsat til det cellefrie lysat for spontant at samle (~ 20 nm) NLP'er. Når det oversættes sammen med et membranprotein af interesse, danner NLP og membranproteinet et opløseligt nanopartikelkompleks, hvori membranproteinet er indlejret i NLP-lipiddobbeltlaget. Således er membranproteinet mere tilgængeligt til downstream-applikationer, da det er indeholdt i opløselige, diskrete partikler. Denne tilgang kan producere funktionelle oligomere proteinkomplekser inden for NLP-dobbeltlag2 og kan producere antigenkomponenten i en underenhedsvaccine, som efterfølgende blandes med lipofile adjuvanser til dannelse af en nanopartikelvaccine med co-lokaliseret antigen og adjuvans egnet til in vivo-vurdering .
Denne aktuelle metode er ændret fra en tidligere offentliggjort protokol3. Nøglemodifikationer er fokuseret på opskalering af den cellefrie reaktion og efterfølgende oprensning af protein-NLP-komplekset. En yderligere modifikation indbefatter tilsætning af en amfifil polymer kendt som en telodendrimer, som først blandes med lipiderne før tilsætning til den cellefrie reaktion. Co-oversættelse af plasmiderne i nærvær af telodendrimer og lipiderne producerer en telodendrimer NLP (tNLP). Tilsætningen af telodendrimer hjælper også med at modulere størrelsen og monodispersiteten af de resulterende tNLP nanopartikler4. Denne protokol er specifikt optimeret til store vaccinestudier til fremstilling af et membranbundet underenhedsantigenprotein, chlamydial MOMP 5,6. Metoden producerer rekombinant MOMP forbundet med tNLP til dannelse af et meget opløseligt MOMP-tNLP-kompleks, der bevarer MOMP-oligomerisering. En typisk 3 ml opskaleringsproduktion giver >1,5 mg renset MOMP. Den cellefri producerede MOMP-tNLP kan hurtigt tilsættes adjuvans til in vivo immunogenicitetstest.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført på University of California, Irvine, i Public Health Service (PHS) -sikrede faciliteter i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af glasvarer
BEMÆRK: Alle materialer, der anvendes til fremstilling af formuleringer af vaccinekvalitet til dyr, er endotoksinfrie.
- For at ødelægge forurenende endotoksin skal du bage renset glasvarer, der holder buffere i en ovn ved 180 ° C i 4 timer.
2. Forberedelse af buffer
- Der fremstilles 250 ml af Ni-affinitetsrensningsbufferne, der er anført i tabel 1. Opbevar dem ved 4 °C i op til 6 måneder.
3. Forberedelse af reaktion
- 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) afvejes i et endotoksinfrit, 1,5 ml centrifugerør. Opløs det i 1 ml endotoksinfrit vand, sonde-sonikere mindst fire gange ved 6 A i 1 min, med 1 min pauser imellem, indtil det er klart. Fjern ethvert forurenende metal fra sonden ved centrifugering ved 13.000 × g i 2 minutter ved 22 °C, og overfør derefter det opløselige lipid til et nyt 1,5 ml endotoksinfrit rør.
- Afvej 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer i et 1,5 ml endotoksinfrit rør. Opløs i endotoksinfrit vand til en koncentration på 20 mg / ml. Vortex, indtil den er helt opløst og fortyndes til 2 mg/ml.
- I et nyt endotoksinfrit rør kombineres 210 μL 20 mg/ml DMPC-opløsning med 210 μL 2 mg/ml telodendrimeropløsning.
4. Cellefri produktion af MOMP-tNLP'er til underenhedsvaccineformuleringer
- Forbered MOMP-tNLP'er ved hjælp af cellefrie metoder ændret fra en tidligere offentliggjort protokol5.
- To timer før opsætning af den cellefrie reaktion skal du åbne det prokaryote cellefrie proteinekspressionssæt og optø en af rekonstitutionsbufferne. Når den er optøet, tilsættes en tablet EDTA-fri proteasehæmmercocktail og lad den opløses helt.
- Følg denne protokol ved hjælp af et sæt, der er designet til at køre 5 x 1 ml reaktioner.
BEMÆRK: En typisk opskaleringsproduktion er 3 x 1 ml.- For hver 1 ml reaktion tilsættes 525 μL rekonstitutionsbuffer til E. coli-lysatflasken, og rullen forsigtigt for at opløse . Der tilsættes 250 μL rekonstitutionsbuffer til flasken med reaktionsadditiver (f.eks. ATP, GTP) og rulles forsigtigt for at opløses.
- Tilsæt 8,1 ml rekonstitutionsbuffer til reaktionsfødeflasken, sæt låget på med en gummiprop (pas på ikke at røre indersiden af gummiproppen), og vend/rul forsigtigt for at opløse.
- Tilsæt 3 ml rekonstitutionsbuffer til aminosyreblandingsflasken, sæt låg på med en gummiprop, og vend/rul forsigtigt for at opløse.
BEMÆRK: Pas på ikke at røre ved indersiden af gummiproppen, da dette kan føre til forurening. - Tilsæt 1,8 ml rekonstitutionsbuffer til methioninflasken, rul forsigtigt for at opløse den, og opbevar derefter på is indtil brug.
- Forbered reaktionsopløsningen.
- Til E. coli-lysatflasken tilsættes 225 μL rekonstitueret reaktionsblanding, 270 μL rekonstitueret aminosyreblanding uden methionin og 30 μL rekonstitueret methionin . Derudover tilsættes 400 μL DMPC/telodendrimer-blandingen, 15 μg MOMP-plasmid og 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rul/ryst forsigtigt for at blande.
BEMÆRK: Sørg for, at begge plasmider er konstrueret af den samme plasmidrygrad. Må ikke hvirvel. - Tag 20 μL af den totale opløsning og læg den til side i et 1,5 ml rør til GFP-ekspressionskontrolreaktionen (se nedenfor).
- Til E. coli-lysatflasken tilsættes 225 μL rekonstitueret reaktionsblanding, 270 μL rekonstitueret aminosyreblanding uden methionin og 30 μL rekonstitueret methionin . Derudover tilsættes 400 μL DMPC/telodendrimer-blandingen, 15 μg MOMP-plasmid og 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rul/ryst forsigtigt for at blande.
- Forbered foderopløsningen. Til foderblandingsflasken tilsættes 2,65 ml rekonstitueret aminosyreblanding uden methionin og 300 μL rekonstitueret methionin. Rul/ryst forsigtigt for at opløse.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan den ubrugte rekonstitutionsbuffer og methionin returneres til fryseren til opbevaring. - Der overføres 1 ml af reaktionsopløsningen til det indre reaktionskammer, der er tilvejebragt i det cellefrie reaktionssæt, og forseglingen, når den er fyldt. 10 ml af fødeopløsningen overføres til reaktionsbeholderens ydre kammer og forseglingen.
BEMÆRK: Overfyld ikke kamrene! Tilstedeværelsen af luftbobler øverst i både det indre reaktionskammer og det indre fødekammer vil påvirke reaktionen negativt. Enhver resterende reaktionsopløsning kan anbringes i et 1,5 ml rør og få lov til at blande sammen med hovedbeholderen. - Der tilsættes 0,5 μL GFP-kontrolplasmidet (0,5 mg/ml) til den tidligere alikvotede 20 μL reaktionsblanding.
BEMÆRK: Mange sæt leveres med et kontrolplasmid til kvalitetskontrolformål. De fleste GFP-ekspressionelle plasmider med en T7-promotor og E. coli-ribosombindingssted (RBS) kan også anvendes som kontrolplasmid. - Reaktionen anbringes i en ryster ved 300 o/min, 30 °C i op til 18 timer. For at kontrollere, at reaktionen var vellykket, skal du bruge en UV-lyskilde til at kontrollere for fluorescens på grund af syntesen af kontrol-GFP (figur 1A) efter så lidt som 15 minutters inkubation.
BEMÆRK: Disse forhold, især temperatur, skal muligvis optimeres til ekspression af andre membranproteiner.
5. MOMP-tNLP oprensning
- Brug immobiliseret nikkelaffinitetskromatografi til at rense MOMP-tNLP nanopartikelkomplekset fra den cellefrie reaktionsblanding ved hjælp af His-mærket på Δ49ApoA1-proteinet.
- Overfør 1 ml af en 50% opslæmning af His-Tag Purification Resin til en engangs 10 ml kromatografikolonne og ekvilibrer den med 3 ml bindingsbuffer.
- Lad bufferen dræne, hætte udløbet, og tilsæt 250 μL bindingsbuffer til harpiksen.
- Før du tilføjer den cellefrie reaktion til kolonnen, skal du gemme 20 μL til senere analyse med SDS-PAGE. Den cellefrie reaktion blandes med den ekvilibrerede harpiks og inkuberes på en laboratorievipper ved 4 °C i 1 time.
- Fjern hætten på søjlen, vask hætten med 500 μL ekstra bindingsbuffer, og tilsæt denne væske til resten af kolonnen.
- Opsaml væskegennemstrømningen fra kolonnen til senere analyse med SDS-PAGE.
- Kolonnen vaskes seks gange med 1 ml vaskebuffer indeholdende 20 mM imidazol, og fraktionerne opsamles. Pas på ikke at lade harpiksen tørre ud mellem vaske. Ved den anden vask omrøres harpiksen kraftigt ved pipettering op og ned med en 1 ml pipette.
- MOMP-tNLP'erne elueres i seks 300 μL fraktioner af elueringsbuffer 1 (indeholdende 250 mM imidazol) efterfulgt af en endelig eluering med 300 μL elueringsbuffer 2 (indeholdende 500 mM imidazol). På den anden eluering omrøres harpiksen kraftigt ved pipettering op og ned ved hjælp af en 1 ml pipette.
6. Analyse af SDS-PAGE
BEMÆRK: Alle elueringsfraktioner skal analyseres af SDS-PAGE for at screene for mængde og renhed af proteinet af interesse.
- Der fyldes 1 μL hver af de totale lysater og gennemstrømninger og derefter 5 μL for alle opsamlede vaske- og elueringsfraktioner.
- Bland alikvoter af de eluerede MOMP-tNLP'er, vasker, gennemstrømning og total lysat med 4x SDS-PAGE prøveindlæsningsbuffer. Prøverne blandes og varmedenatureres med 10x prøvereduktionsmiddel, medmindre andet er angivet.
- Analyser fraktionerne ved gelelektroforese ved hjælp af 1,0 mm, 4 til 12%, Bis-Tris SDS-PAGE geler med 1x MES-SDS løbende buffer sammen med en passende molekylvægtstandard. Kør gelerne i 35 min ved 200 V.
- Plet gelerne i henhold til producentens anvisninger.
- Fjern gelen fra kassetten og læg den i 60 ml gelplet. Mikrobølge gelen i gelpletten i 30 s, og vugge forsigtigt beholderen i 30 s for at fordele varmen jævnt. Mikrobølge gelen i pletten til 80-85 °C i yderligere 30 s, og læg gelen på en orbital shaker for at rocke i 5 min.
- Mikrobølge gelen en tredje gang i 30 s, og vend derefter tilbage til orbitalrysteren for at rocke i yderligere 23 minutter.
- Overfør gelen til en ren beholder og vask i 100 ml vaskeopløsning (10% methanol, 7% eddikesyre) i 30 min.
BEMÆRK: Dette er et kritisk trin, da det er vigtigt at undgå opvarmning af vaskeopløsningen. I modsat fald kan det resultere i baggrundsfarvning og uregelmæssigheder i det endelige gelbillede. - Efter vask skylles gelen i ultrarent vand to gange i 5 minutter hver.
- Gelerne afbildes ved hjælp af en gelbilleddanner ved 600 nm (figur 2). Brug SDS-PAGE til at kvantificere mængden af individuelt protein i nanopartikelopløsningen, hvis der er en proteinstandard til sammenligning.
BEMÆRK: I dette eksempel opløses serielle fortyndinger af rekombinant udtrykt MOMP af SDS-PAGE, og båndenes tætheder kvantificeres ved hjælp af instrumentsoftware. - Generer en standardkurve ved hjælp af MIMP-båndenes tætheder. MOMP-tNLP-prøverne opløses på den samme SDS-PAGE-gel, og partiklernes MOMP-komponent beregnes ved hjælp af MOMP-standardkurven (figur 3).
7. Western og dot blots og opbevaring
- Til western blotting opløses prøverne med SDS-PAGE og overføres gelerne ved hjælp af et kommercielt tørblottingsystem med standardindstillinger i henhold til producentens protokol.
- Blottene fjernes fra stakken, når overførslen er afsluttet, og hver plet inkuberes natten over ved 4 °C i en passende blokerende buffer indeholdende 0,2 % Tween 20 og enten 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS anti-His-tag antistof rettet mod His-mærket fra Δ49ApoA1-proteinet.
BEMÆRK: De antistoffortyndinger, der anvendes til blotting, er 1: 1.000 for MAb40 og 1: 500-1.000 for MAbHIS antistof. - Hver plet vaskes 3 gange i 5 minutter med PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).
- Inkuber blottene i 1 time i blokerende buffer indeholdende sekundært antistof konjugeret med en fluorofor (f.eks. IRDye) ved en 1:10.000 fortynding.
- Vask blotterne igen 3 gange i 5 minutter med PBS-T. Brug et fluorescenskamera til at afbilde blotterne efter den endelige vask.
- Blottene fjernes fra stakken, når overførslen er afsluttet, og hver plet inkuberes natten over ved 4 °C i en passende blokerende buffer indeholdende 0,2 % Tween 20 og enten 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS anti-His-tag antistof rettet mod His-mærket fra Δ49ApoA1-proteinet.
- For dot blots, blot 3 μg renset MOMP-tNLP og tom tNLP ved hjælp af et dot blot-apparat. Bloker og udvikl blotterne ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet ovenfor for western blotting.
8. Vurdering af endotoksin
- Kvantificer endotoksinniveauer ved hjælp af et endotoksintestsystem baseret på Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay. Forbered endotoksinfri 25 mM Tris, pH 7,4, prøvebuffer ved hjælp af 1 M Tris hydrochloridopløsning og endotoksinfrit vand.
BEMÆRK: Prøver skal typisk fortyndes ved hjælp af denne prøvebuffer, og fortyndingerne justeres for at finde det passende interval for individuelle prøver. Her fortyndes MOMP-tNLP-prøver 500 gange i prøvebuffer, og 25 μL lægges i hver brønd i en enhedspatron med en følsomhed på 0,05 EU / ml. Endotoksinniveauerne af MOMP-tNLP og tom tNLP, der anvendes i museundersøgelserne beskrevet nedenfor, er mellem 0,4 og 12 EU/μg protein afhængigt af prøven.
9. Lyofilisering
- Frysefryse og opbevare MOMP-tNLP nanopartikler til langvarig (op til år) brug ved -20 °C. For at forberede tNLP- og MOMP-tNLP-suspensioner til lyofilisering tilsættes trehalose som beskyttelsesmiddel under fryse- og frysetørringsprocessen.
BEMÆRK: Denne proces er blevet grundigt valideret for en række tNLP-formuleringer 7,8. - Det aktuelle volumen af MOMP-tNLP-opløsningen divideres med 9 for at opnå volumenet på 1 M trehalose i sterilt, endotoksinfrit, deioniseret vand, der kræves for at nå en endelig koncentration på 0,1 M trehalose. Bemærk det endelige volumen og delprøve i endotoksinfrie 15 ml eller 50 ml polypropylenrør efter ønske.
- Frys den blandede opløsning på tøris og frysefiliser den natten over ved hjælp af en lyofilisator. De tørrede formuleringer opbevares ved -20 °C, indtil de skal bruges.
- Rekonstituer frysetørrede tNLP'er ved hjælp af endotoksinfrit vand. Rul forsigtigt, indtil den frysetørrede kage er helt opløst og rehydreret. For at fjerne trehalose dialyseres opløsningen mod PBS ved hjælp af en 3,5 kDa afskåret dialysemembran.
10. Tilsætning af adjuvans
BEMÆRK: Disse og andre lignende NLP-baserede underenhedsvaccineformuleringer kan let inkorporere lipofile adjuvanser såsom CpG-ODN1826 og FSL-1. CpG-ODN1826 er et modificeret klasse B CpG-oligonukleotid (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') med en fuld phosphorothioat-rygrad med en 5' kolesteroldel (5'-chol-C6). Konjugeringen af CpG-ODN1826 til tNLP'er medieres af de hydrofobe interaktioner mellem kolesteroldelen og phospholipid-dobbeltlaget af tNLP og er blevet demonstreret og velkarakteriseret, som tidligere rapporteret 9,10.
- Før inkorporering i disse formuleringer renses den kolesterolmodificerede CpG ved omvendt fasekromatografi for at fjerne forurenende endotoksin såvel som eventuelle umodificerede CpG-molekyler.
- Efter modtagelse fra sælgeren rehydreres det frysetørrede CpG-materiale i endotoksinfrit vand og renses på en præparativ C4 RP-HPLC-søjle ved hjælp af en separationsgradient bestående af 10 mM triethylammoniumacetat (TEAA) (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B).
BEMÆRK: Yderligere oplysninger findes i tabel 2. - Pool og frysetørret fraktionerne indeholdende kolesterolmodificeret CpG. For at sikre fuldstændig fjernelse af resterende TEAA rekonstitueres CpG med 15 ml endotoksinfrit vand og frysefryses tre gange.
- Efter den endelige frysetørring rekonstitueres CpG i endotoksinfrit vand (>20 mg/ml endelig CpG-koncentration), alikvote, og opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt. For tilsætning til formuleringer fortyndes CpG til en koncentration på 1-2,5 mg / ml.
BEMÆRK: FSL-1 fås som et frysetørret pulver af vaccinekvalitet. Dette rekonstitueres ved hjælp af sterilt og endotoksinfrit vand i en koncentration på 1 mg / ml. Vaccinen administreres intramuskulært (i.m.), hvor hver dosis indeholder 10 μg MOMP i et samlet volumen på 50 μL.
- Efter modtagelse fra sælgeren rehydreres det frysetørrede CpG-materiale i endotoksinfrit vand og renses på en præparativ C4 RP-HPLC-søjle ved hjælp af en separationsgradient bestående af 10 mM triethylammoniumacetat (TEAA) (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B).
- For at opnå den ønskede formuleringsdosis dialyseres nanopartiklerne i PBS og koncentreres ved hjælp af en centrifugalvakuumkoncentrator før tilsætning af adjuvans. Vær forsigtig, når du gør dette for at forhindre fuldstændig tørring af prøven - kontroller prøvevolumenet hvert 20.-30. minut under centrifugering.
- Tilsæt adjuvansen under sterile forhold i et biosikkerhedsskab. For at vurdere vellykket inkorporering skal du analysere de endelige formuleringer og deres komponenter ved analytisk størrelseseksklusionskromatografi (SEC).
BEMÆRK: Til disse præparater blev der anvendt en SEC-kolonne i PBS-buffer (0,5 ml/m i strømningshastighed), og eluering blev detekteret ved hjælp af en UV-vis diode array-detektor. Inkorporeringen blev vurderet ved at sammenligne absorptionen af de adjuvanserede partikler med absorptionen af de ikke-adjuvanserede partikler ved 214 og 280 nm. - Den adjuvanserede MOMP-tNLP opbevares og tømmes tNLP ved 4 °C inden dyrebrug i op til 14 dage. For fuldt ud at vurdere stabiliteten af en ny tNLP-formulering skal du regelmæssigt analysere de lagrede tNLP'er efter SEC.
BEMÆRK: Stabiliteten varierer fra formulering til formulering.
11. Serumtest
- Få kvindelige 3 uger gamle mus (BALB / c, n = 6).
- Vacciner musene intramuskulært (i.m.) i hvert bagben med 10 μg MOMP i form af MOMP-tNLP adjuveret med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (samlet volumen pr. injektion = 50 ml).
- Efter vaccination skal du observere musene, indtil de er i stand til at opretholde bryst liggende.
- Fire uger efter den første vaccination (prime) vaccineres dyrene for anden gang (boost) med 10 μg MOMP i form af MOMP-tNLP adjuvanseret med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (totalvolumen pr. injektion = 50 ml).
- På dag 56 efter den første vaccination indsamles blod for at vurdere antistoftitere. Begynd med at bedøve musene ved at injicere i.p. en opløsning af xylazin (0,3 mg / 20 g legemsvægt) og ketamin (3,0 mg / 20 g legemsvægt). Klem for- og bagbenene for at sikre, at der ikke opstår ryk. Påfør vaselin omkring øjnene for at forhindre øjentørhed under anæstesi.
- Brug et mikro-hæmatokrit kapillarrør til at punktere retro-orbital plexus. Saml 100 ml blod i et mikrocentrifugerør.
- Efter blodindsamling skal du observere musene, indtil de kommer sig efter anæstesi og kan opretholde bryst liggende.
- Lad blodet størkne ved stuetemperatur i 30 min og drej derefter ned ved 2.000 × g i 10 min. Serumet opsamles og fryses ved -80 °C.
- På dette tidspunkt skal du udfordre dyrene med Chlamydia muridarum eller aflive dem. Afliv musene ved først at injicere i.p. en opløsning af xylazin (0,3 mg/20 g legemsvægt) og ketamin (3,0 mg/20 g legemsvægt) efterfulgt af cervikal dislokation.
- Testér serumantistoffer, der er specifikke for MOMP, ved hjælp af western blotting-teknikker som beskrevet ovenfor. Pool musesera fra alle immuniserede mus og brug det poolede serum i stedet for et primært antistof ved 1:5.000 fortynding.
Representative Results
SDS-PAGE-profilen for Ni-affinitetsoprensning af MOMP-tNLP fra en 1 ml cellefri reaktion er vist i figur 1B. Reaktionen resulterede i høje ekspressionsniveauer for både MOMP og Δ49ApoA1-proteinet. Tidligere resultater viste, at den cellefrie ekspression af Δ49ApoA1 i nærvær af DMPC og telodendrimer resulterede i dannelsen af telodendrimer nanolipoproteinpartikler (tNLP'er)4. Sam-elueringen af MOMP med Δ49ApoA1 indikerede, at MOMP er forbundet med tNLP'er, da His-mærket kun er til stede på tNLP-stilladset Δ49ApoA1 og ikke på MOMP. MOMP er et meget uopløseligt protein, der kun kan elueres gennem kompleksdannelse med tNLP'er, som har vist sig at lette opløseligheden af membranproteiner.
Elueringsfraktionerne indeholdende MOMP-tNLP'er blev samlet, og den totale proteinkoncentration blev bestemt ved hjælp af en fluorescensbaseret kvantificeringsanordning eller en anordning, der måler koncentrationen gennem absorbans ved 280 nm, efter producentens anvisninger for proteinkvantificering. For at muliggøre præcis dosering af MOMP-vaccinen er det også vigtigt at bestemme koncentrationen af MOMP i de oprensede komplekser. Vi udviklede en metode til kvantificering af MOMP baseret på geldensitometri (figur 2), hvor en oprenset rekombinant MOMP med kendt koncentration blev anvendt som standard. Ved at etablere standardkurven og sammenligne den med MOMP-tNLP-prøven kan MOMP-koncentrationen kvantificeres nøjagtigt. Bestemmelsen af MOMP-koncentrationen i den oprensede prøve gjorde det muligt at estimere udbyttet af MOMP i cellefrie reaktioner på forskellige skalaer, hvilket er vigtigt for planlægningen af reaktionsopsætningen, der er passende for downstream-undersøgelser (tabel 3).
MOMP skal danne oligomerer for at fremkalde et robust immunrespons11. For at teste MOMP's oligomere tilstand blev MOMP-tNLP analyseret i nærvær og fravær af både varme og reduktionsmidlet dithiothreitol (DTT, 50 mM, figur 3A). Højere ordens oligomerer af MOMP blev identificeret gennem SDS-PAGE, når prøver ikke blev behandlet med varme og DTT. Til sammenligning viste prøver behandlet med varme i nærvær af DTT primært to forskellige bånd på gelen, svarende til MOMP og Δ49ApoA1 (henholdsvis ca. 40 kDa og 22 kDa). Disse resultater ligner meget gelbåndsmønsteret, der tilskrives oligomerdannelse af MOMP, hvilket er kritisk for dets effektivitet.
Yderligere western blot-analyse ved hjælp af MAb40, et antistof mod den lineære epitop på MOMP-proteinets variable domæne, viste et lignende båndmønster, hvilket bekræftede oligomerdannelsen af MOMP-protein i dets ikke-denaturerede tilstand (figur 3B). En vigtig faktor, der påvirker MOMP-oligomerdannelsen, er forholdet mellem MOMP-plasmidet og Δ49ApoA1-plasmidet under den cellefrie reaktionsopsætning. Tabel 4 viser forholdet mellem plasmider og den resulterende indsættelseshastighed for MOMP i tNLP'er. Tidligere undersøgelser viste, at chlamydial MOMP og andre ydre membranproteiner primært kan eksistere som trimere12. For at maksimere trimerdannelsen i den cellefrie reaktion er det ønskeligt at have indsættelseshastigheden tæt på tre MOMP-proteiner pr. NLP, hvilket svarer til et ~ 25: 1 MOMP-til-Δ49ApoA1 plasmidforhold.
Et punktum blot-assay blev brugt som en mere strømlinet metode til at detektere tilstedeværelsen af MOMP og tNLP. MAb40-antistoffet blev brugt til at detektere total MOMP. MAbHIS-antistoffet rettet mod His-mærket på Δ49ApoA1-stilladset på tNLP blev brugt til at vurdere tilstedeværelsen af tNLP. Co-signaleringen af MAb40 og MAbHIS antistoffer indikerede MOMP-tNLP dannelse. Kontrolreaktionen producerede tom tNLP, som kun viste et positivt signal fra MAbHIS (figur 3C). For at teste immunogeniciteten af MOMP-tNLP'er produceret i den cellefrie reaktion adjuvanserede vi MOMP-tNLP med CpG + FSL-1 og injicerede intramuskulært (i.m.) i mus i et prime-boost-regime som beskrevet ovenfor. Sera blev indsamlet fra de immuniserede mus, og MOMP-specifikt IgG-antistof blev målt ved hjælp af et western blot-assay (figur 4). Sera fra mus injiceret med adjuveret MOMP-tNLP viste stærk MOMP-binding, hvilket indikerer, at MOMP-tNLP kunne fremkalde et immunrespons in vivo.
Figur 1: Ekspression og oprensning af MOMP-tNLP. (A) Billede af rør indeholdende små delprøver af en cellefri reaktion, der med succes udtrykte GFP-kontroller, der lyser under UV-lyskilde (højre) sammenlignet med lysater uden GFP-plasmid (venstre). (B) Proteingel farvet med SYPRO Ruby efter SDS-PAGE viser rensningsprofilen for MOMP-tNLP. MOMP migrerer ved 40 kDa og 49ApoA1 migrerer ved 22 kDa. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; GFP = grønt fluorescerende proteinkodende plasmid; MW = Molekylvægtsmarkør; T = total cellefri lysat; FT = gennemstrømning; R1-R3 = cellefrie reaktionsallikvotter; W1, W6 = vasker 1 og 6; E1-E7 = Elutioner 1 til 7; Δ49ApoA1 = Hans-tagget mus ApoA1 derivat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvantificering af MOMP i MOMP-tNLP-prøver. (A) SDS-PAGE gel farvet med SYPRO Ruby til kvantificering af MOMP. Rekombinant MOMP med kendt koncentration blev lagt på gelen for at opnå standardkurven. Hver bane indeholdt 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg og 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-prøver, der blev kvantificeret, blev lagt på den samme gel. (B) MOMP-koncentrationsstandardkurven blev genereret ved hjælp af densitometri. En ligning vedrørende normaliseret båndtæthed og mængden af MOMP blev etableret. Ligningen blev brugt til at beregne MOMP-indholdet i de ukendte prøver. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellefrit produceret MOMP-tNLP tillader MOMP at danne strukturer af højere orden. (A) SDS-PAGE gel af MOMP-tNLP med og uden behandling af varme og reduktionsmiddel DTT, farvet med SYPRO Ruby. Med varme og DTT fremstod MOMP primært som et monomerbånd ved ~40 kDa, da varme og reduktionsmidlet nedbrød størstedelen af MOMP-strukturen af højere orden. I fravær af varme og DTT var de højere ordensbånd til stede, hvilket indikerer MOMP oligomerkonformation. B) Western blottet af MOMP-tNLP og MOMP alene, ubehandlet og behandlet med varme og DTT. Efter overførslen blev membranen undersøgt med MAb40 (1:1.000 fortynding). Et båndmønster svarende til SYPRO Ruby-farvet gel blev observeret, hvilket bekræftede, at båndene med højere molekylvægt faktisk var MOMP-oligomerer. (C) Dot blot, MOMP-tNLP og tomme tNLP-prøver (i to eksemplarer) undersøgt med MAb40 og MAbHIS. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese; DTT = dithiothreitol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellefrit produceret MOMP-tNLP er stærkt immunogent. Serum fra immuniserede mus viste stærkt anti-MOMP IgG-signal. MOMP-tNLP adjuvanseret med CpG + FSL-1 blev brugt til at immunisere mus. Sera fra seks immuniserede mus blev indsamlet, samlet og brugt til at sonde MOMP-tNLP. Serummet var i stand til at binde til MOMP i et western blotting-assay og viste stærkt IgG-signal (venstre). Western blot, der brugte MAb40 som primært antistof (højre), viste lignende bånd, hvilket indikerer, at serumet indeholdt MOMP-specifikt IgG. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; CpG = kolesterolmodificeret CpG-adjuvans; FSL-1 = lipofil adjuvans. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Buffer navn | NaH2PO4 | NaCl | Imidazol | ph |
| Bindende buffer | 50 mM | 300 mM | 10 mM | 8.0 |
| Vask buffer | 50 mM | 300 mM | 20 mM | 8.0 |
| Elueringsbuffer 1 | 50 mM | 300 mM | 250 mM | 8.0 |
| Elueringsbuffer 2 | 50 mM | 300 mM | 500 mM | 8.0 |
Tabel 1: Liste over buffere, der er nødvendige til rensning af nikkelaffinitet, med detaljerede koncentrationer af hver komponent og pH.
| Runtime | 50 minutter |
| Strømningshastighed | 6,0 ml/min |
| Gradueringstype | Binær |
| Buffer A | 10 mM TEAA i H20 |
| Buffer B | MeCN |
| Stigning | % buffer B |
| 0 min | 25% |
| 30 minutter | 60% |
| 30,5 min | 100% |
| 40 minutter | 100% |
| 40,5 min | 25% |
| 50 minutter | 25% |
Tabel 2: Betingelser for omvendt fase HPLC-oprensning af kolesterolmodificeret CpG. Forkortelser: TEAA = triethylammoniumacetat; MeCN = acetonitril.
| Cellefrit lysat (ml) | DMPC lipid (mg) | Telodendrimer (mg) | MOMP plasmid (μg) | Renset MOMP-udbytte (mg) |
| 1 | 4 | 0.4 | 15 | 0.5 |
| 2 | 8 | 0.8 | 30 | 1.1 |
| 3 | 12 | 1.2 | 45 | 1.6 |
| 5 | 20 | 2 | 75 | 2.7 |
Tabel 3: Mængden af lipider, telodendrimer og plasmider, der anvendes til forskelligt skalerede cellefrie reaktioner og de tilsvarende udbytter. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin.
| Forhold mellem plasmidinput, MOMP: Δ49ApoA1 | 1:1 | 5:1 | 10:1 | 25:1 | 50:1 | 100:1 | |
| Forholdet mellem mængden af produceret protein, MOMP : Δ49ApoA1 | 0.02 | 0.32 | 0.64 | 3.46 | 6.55 | 20.04 | |
| Anslået antal MIMP-indsættelser pr. tNLP | 0.03 | 0.37 | 0.75 | 4.04 | 7.65 | 23.39 | |
Tabel 4: Plasmidforholdene i en cellefri reaktion og de resulterende MOMP-indsættelseshastigheder. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; Δ49ApoA1 = Hans-tagget mus ApoA1 derivat.
Discussion
Klamydia er den mest almindelige seksuelt overførte infektion, der påvirker både mænd og kvinder. Selvom vaccineforskning på klamydia spænder over årtier, er en sikker og effektiv vaccine, der kan skaleres til masseproduktion, forblevet undvigende13. Chlamydial MOMP betragtes som hovedkandidat som et beskyttende vaccineantigen; MOMP er dog meget hydrofob og tilbøjelig til forkert foldning14,15. Yderligere undersøgelser har afsløret, at MOMP findes i oligomere tilstande, der er afgørende for dets immunogenicitet11. Detaljeret her er en valideret, cellefri co-ekspressionsmetode, der producerer oligomere MOMP dannet i tNLP nanopartikel som en vaccine med udbytter på ca. 1,5 mg renset MOMP pr. 3 ml lysat. Denne fuldt indsamlede procedure kan skaleres yderligere til industriel produktion, hvilket øger udsigterne som en nyttig tilgang til generering af vacciner.
Vi har tidligere publiceret om brugen af cellefri ekspression til at producere membranproteiner indlejret i NLP'er 3,16, samt ekspression i telodendrimer-stabiliserede skiver. Denne sidstnævnte teknik producerede imidlertid membranproteinpartikler med større heterogenitet og lavere opløselighed. 4 Derudover er immunogeniciteten af MOMP-telodendrimerpartikler uklar sammenlignet med MOMP-tNLP-partikler6.
Denne procedure kan tilpasses til at opskalere ekspressionen af bakterielle membranproteiner, der er lovende kandidater som antigener til brug i underenhedsvacciner. Ikke alene producerer denne procedure opløseligt bakteriemembranprotein, men den overordnede nanopartikelstruktur kan ændres yderligere ved hjælp af en række lipofile vaccineadjuvanser, herunder, men ikke begrænset til, CpG konjugeret til en kolesteroldel eller FSL-1. Ekspression af andre kandidatantigener fra bakterier er mulig, selvom parametre som ekspressionstemperatur, lipidvalg og type ekspressionssystem muligvis skal undersøges for at opnå optimale udbytter.
Derudover er plasmidvalg og -forhold afgørende i denne proces. Begge anvendte plasmider skal konstrueres fra samme rygrad. Hvis indsatserne er omtrent samme længde, kan forholdene baseres på massen af det tilsatte plasmid som beskrevet her. Imidlertid vil forhold baseret på mol give mere reproducerbare resultater, især ved skalering af reaktionerne. Forhold, der fungerer godt i skærmskalareaktioner (< 0,5 ml), gælder muligvis ikke for større reaktioner og kan kræve yderligere optimering. Ikke-membranproteiner kan stadig udtrykkes ved hjælp af cellefrie kits, men kræver muligvis ikke lipidnanopartiklen (co-ekspression) for at producere et opløseligt produkt. Derudover, mens denne protokol beskriver adjuvans med CpG og FSL-1, er dette system egnet til formulering med andre lipofile adjuvanser eller blanding med opløselige adjuvanser efter ønske.
Det er vigtigt at undgå kontaminering, når den cellefrie ekspressionsreaktion opsættes, da dette kan påvirke udbyttet. Eventuelle tilsætningsstoffer til reaktionen, herunder plasmiderne selv, bør være meget rene. Derudover bør de udtrykte proteiner kun være i kontakt med materialer og opløsninger, der er fri for endotoksinforurening. Endotoksinforurening i kandidatformuleringer kan føre til inkonsekvente og falske resultater af immunologiske assays og kan være skadelige i tilstrækkelige mængder. Selvom det ikke er beskrevet her, kan yderligere oprensning efter nikkelaffinitetskromatografi være nødvendig, hvis mange forurenende stoffer observeres i efterfølgende analysetrin, såsom gennem SDS-PAGE. Dette kan opnås med SEC, selvom forholdene kan kræve optimering på formuleringsbasis.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud R21 AI20925 og U19 AI144184 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dette arbejde blev udført i regi af U.S. Department of Energy af Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
| 1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
| 1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
| Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
| C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
| cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
| CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
| Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
| Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
| Electrophoresis Power Supply | |||
| Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
| Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
| Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
| HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
| HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
| HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
| iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
| iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
| Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
| Microcentrifuge | |||
| Microwave oven | |||
| NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
| Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Orbital Shaker | |||
| PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
| PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
| pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
| Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
| Probe sonicator | |||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
| Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
| Rainin Pipettes | Rainin | ||
| Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
| Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
| Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
| Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
| SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
| UV light source | |||
| Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
| Vortexer | |||
| VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
| VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
| XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Coleman, M. A., et al. Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles. PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- He, W., et al. Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry. Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).
- He, W., et al. Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).
- Tifrea, D. F., et al. Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles. Vaccines. 9 (7), 755 (2021).
- Cleveland, T. E., et al. Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles. Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).
- Fischer, N. O., et al. Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).
- Fischer, N. O., et al. Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).
- Fischer, N. O., et al. Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).
- Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria. Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).
- Sun, G., et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).
- Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection. Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).
- Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein. BMC Microbiology. 5, 5 (2005).
- Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein. Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).
- He, W., et al. Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases. Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).
