Summary
Denne protokollen beskriver bruk av kommersielle, cellefrie proteinuttrykkssett for å produsere membranproteiner støttet i nanodisc som kan brukes som antigener i subenhetsvaksiner.
Abstract
Subenhetsvaksiner gir fordeler i forhold til mer tradisjonelle inaktiverte eller svekkede helcellederiverte vaksiner i sikkerhet, stabilitet og standardproduksjon. For å oppnå en effektiv proteinbasert subenhetsvaksine må proteinantigenet ofte vedta en innfødt-lignende konformasjon. Dette er spesielt viktig for patogen-overflateantigener som er membranbundne proteiner. Cellefrie metoder har blitt brukt til å produsere riktig foldet funksjonelt membranprotein gjennom samoversettelse av nanolipoproteinpartikler (NLP), kjent som nanodisker.
Denne strategien kan brukes til å produsere subenhetsvaksiner bestående av membranproteiner i et lipidbundet miljø. Imidlertid er cellefri proteinproduksjon ofte begrenset til småskala (<1 ml). Mengden protein produsert i småskala produksjonsserier er vanligvis tilstrekkelig for biokjemiske og biofysiske studier. Den cellefrie prosessen må imidlertid oppskaleres, optimaliseres og testes nøye for å oppnå nok protein til vaksinestudier i dyremodeller. Andre prosesser involvert i vaksineproduksjon, som rensing, adjuvant tillegg og lyofilisering, må optimaliseres parallelt. Dette papiret rapporterer utviklingen av en oppskalert protokoll for å uttrykke, rense og formulere en membranbundet proteinsubenhetsvaksine.
Oppskalerte cellefrie reaksjoner krever optimalisering av plasmidkonsentrasjoner og forhold ved bruk av flere plasmidekspresjonsvektorer, lipidseleksjon og adjuvans tilsetning for høynivåproduksjon av formulerte nanolipoproteinpartikler. Metoden er her demonstrert med ekspresjon av et klamydialt stort ytre membranprotein (MOMP), men kan i stor grad brukes på andre membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan evalueres in vivo gjennom immuniseringsstudier for å måle antistoffproduksjon, som vist her.
Introduction
Prokaryote eller eukaryote lysater for cellefri ekspresjon av proteiner er lett tilgjengelige som kommersielle produkter for syntetisering av proteiner av interesse (for en fullstendig gjennomgang, se 1). Disse ekspresjonssystemene er tilgjengelige på forskjellige skalaer og benytter lysater fra forskjellige organismer, inkludert E. coli, tobakkplanter og pattedyrkulturer. Cellefrie lysater gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle rekombinante proteinproduksjonsmetoder, inkludert brukervennlighet og robust, rask proteinproduksjon. Selv om disse tilnærmingene primært brukes til å produsere løselige proteiner, har denne gruppen banebrytende en tilnærming for deres bruk for å uttrykke membranproteiner.
Denne nye tilnærmingen gjør mindre endringer i eksisterende cellefrie ekspresjonssystemer ved å inkludere DNA som koder for to proteinprodukter for ekspresjon, et apolipoprotein og membranproteinet av interesse. Det uttrykte apolipoproteinet (derivater av enten ApoA1 eller ApoE4) interagerer med lipider tilsatt til det cellefrie lysatet for spontant å sette sammen (~ 20 nm) NLP. Når det oversettes sammen med et membranprotein av interesse, danner NLP og membranproteinet et løselig nanopartikkelkompleks hvor membranproteinet er innebygd i NLP-lipid-dobbeltlaget. Dermed er membranproteinet mer tilgjengelig for nedstrøms applikasjoner, da det er inneholdt i løselige, diskrete partikler. Denne tilnærmingen kan produsere funksjonelle oligomere proteinkomplekser i NLP-dobbeltlaget2 og kan produsere antigenkomponenten i en subenhetsvaksine, som deretter blandes med lipofile adjuvanser for å danne en nanopartikkelvaksine med samlokalisert antigen og adjuvans egnet for in vivo-vurdering .
Denne nåværende metoden er modifisert fra en tidligere publisert protokoll3. Nøkkelmodifikasjoner er fokusert på oppskalering av den cellefrie reaksjonen og påfølgende rensing av protein-NLP-komplekset. En ytterligere modifikasjon inkluderer tilsetning av en amfifil polymer kjent som en telodendrimer, som først blandes med lipidene før tilsetning til den cellefrie reaksjonen. Samtranslasjon av plasmidene i nærvær av telodendrimeren og lipidene produserer en telodendrimer NLP (tNLP). Tilsetningen av telodendrimeren bidrar også til å modulere størrelsen og monodispersiteten til de resulterende tNLP nanopartiklene4. Denne protokollen er spesielt optimalisert for storskala vaksinestudier for å produsere et membranbundet subenhetsantigenprotein, klamydial MOMP 5,6. Metoden produserer rekombinant MOMP assosiert med tNLP for å danne et høyoppløselig MOMP-tNLP-kompleks som beholder MOMP-oligomerisering. En typisk oppskaleringsproduksjon på 3 ml gir >1,5 mg renset MOMP. Den cellefrie produserte MOMP-tNLP er egnet til rask adjuvant tilsetning for in vivo immunogenisitetstesting.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført ved University of California, Irvine, i Public Health Service (PHS) -sikrede fasiliteter i samsvar med retningslinjene fastsatt av Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse av glass
MERK: Alle materialer som brukes til å produsere vaksineformuleringer for dyr, er endotoksinfrie.
- For å ødelegge forurensende endotoksin, bake rengjort glass som vil holde buffere i en ovn ved 180 ° C i 4 timer.
2. Buffer forberedelse
- Klargjør 250 ml av Ni affinitetsrensebufferne oppført i tabell 1. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
3. Reaksjon forberedelse
- Vei ut 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC) i et endotoksinfritt, 1,5 ml sentrifugerør. Oppløs det i 1 ml endotoksinfritt vann, sonde-sonisk minst fire ganger ved 6 A i 1 min, med 1 min pauser i mellom, til det er klart. Fjern eventuelt kontaminerende metall fra sonden ved sentrifugering ved 13 000 × g i 2 minutter ved 22 °C og overfør deretter det oppløselige lipidet til et nytt endotoksinfritt rør på 1,5 ml.
- Vei ut 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer i en 1,5 ml endotoksinfri tube. Oppløses i endotoksinfritt vann til en konsentrasjon på 20 mg/ml. Vortex til helt oppløst og fortynnet til 2 mg / ml.
- I en ny endotoksinfri tube kombineres 210 mikrol 20 mg/ml DMPC-oppløsning med 210 mikrol 2 mg/ml telodendrimeroppløsning.
4. Cellefri produksjon av MOMP-tNLP for subenhetsvaksineformuleringer
- Klargjøre MOMP-tNLPer ved hjelp av cellefrie metoder modifisert fra en tidligere publisert protokoll5.
- To timer før du setter opp den cellefrie reaksjonen, åpner du det prokaryote cellefrie proteinuttrykkssettet og tiner en av rekonstitueringsbufferne. Når den er tint, tilsett en tablett EDTA-fri proteasehemmercocktail og la den oppløses helt.
- Følg denne protokollen ved hjelp av et sett designet for å kjøre 5 x 1 ml reaksjoner.
MERK: En typisk oppskaleringsproduksjon er 3 x 1 ml.- For hver 1 ml reaksjon, tilsett 525 mikrol rekonstitueringsbuffer til E. coli-lysatflasken og rull forsiktig for å løse den opp . Tilsett 250 mikrol rekonstitueringsbuffer til flasken som inneholder reaksjonsadditiver (f.eks. ATP, GTP) og rull forsiktig for å løse den opp.
- Tilsett 8,1 ml rekonstitueringsbuffer til reaksjonsmatingsflasken, sett på hetten med en gummipropp (pass på at du ikke berører innsiden av gummiproppen) og vend/rull forsiktig for å løse den opp.
- Tilsett 3 ml rekonstitueringsbuffer i aminosyreblandingsflasken, sett på korken med en gummipropp og vend/rull forsiktig opp ned.
MERK: Pass på at du ikke berører innsiden av gummiproppen, da dette kan føre til forurensning. - Tilsett 1,8 ml rekonstitueringsbuffer til metioninflasken, rull forsiktig for å løse opp, og oppbevar deretter på is til bruk.
- Forbered reaksjonsoppløsningen.
- Til E. coli-lysatflasken , tilsett 225 mikrol rekonstituert reaksjonsblanding, 270 mikrol rekonstituert aminosyreblanding uten metionin og 30 mikrol rekonstituert metionin. I tillegg tilsettes 400 μL av DMPC / telodendrimerblandingen, 15 μg MOMP-plasmid og 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rull/rist forsiktig for å blande.
MERK: Sørg for at begge plasmidene er konstruert fra samme plasmidryggrad. Ikke virvel. - Ta 20 μL av den totale oppløsningen og sett den til side i et 1,5 ml rør for GFP-uttrykkende kontrollreaksjon (se nedenfor).
- Til E. coli-lysatflasken , tilsett 225 mikrol rekonstituert reaksjonsblanding, 270 mikrol rekonstituert aminosyreblanding uten metionin og 30 mikrol rekonstituert metionin. I tillegg tilsettes 400 μL av DMPC / telodendrimerblandingen, 15 μg MOMP-plasmid og 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rull/rist forsiktig for å blande.
- Forbered matoppløsningen. Tilsett 2,65 ml rekonstituert aminosyreblanding uten metionin og 300 ml rekonstituert metionin til mateblandingsflasken. Rull/rist forsiktig for å løse opp.
MERK: På dette tidspunktet kan den ubrukte rekonstitueringsbufferen og metionin legges tilbake i fryseren for oppbevaring. - Overfør 1 ml av reaksjonsoppløsningen til det indre reaksjonskammeret som følger med i det cellefrie reaksjonssettet og forseglingen når den er fylt. Overfør 10 ml av matoppløsningen til det ytre kammeret til reaksjonsbeholderen og tetningen.
MERK: Ikke fyll kamrene for mye! Tilstedeværelsen av luftbobler på toppen av både det indre reaksjonskammeret og det indre matekammeret vil påvirke reaksjonen negativt. Enhver gjenværende reaksjonsløsning kan plasseres i et 1,5 ml rør og tillates å blandes sammen med hovedbeholderen. - Tilsett 0,5 μL av GFP-kontrollplasmidet (0,5 mg/ml) til den tidligere kvoterte 20 μL reaksjonsblandingen.
MERK: Mange sett leveres med et kontrollplasmid for kvalitetskontrollformål. De fleste GFP som uttrykker plasmid med en T7-promotor og E.coli ribosombindingssted (RBS) kan også brukes som kontrollplasmid. - Plasser reaksjonen i en shaker ved 300 o / min, 30 ° C i opptil 18 timer. For å bekrefte at reaksjonen var vellykket, bruk en UV-lyskilde for å kontrollere fluorescens på grunn av syntesen av kontroll-GFP (figur 1A) etter så lite som 15 min inkubasjon.
MERK: Disse forholdene, spesielt temperatur, må kanskje optimaliseres for ekspresjon av andre membranproteiner.
5. MOMP-tNLP rensing
- Bruk immobilisert nikkelaffinitetskromatografi for å rense MOMP-tNLP nanopartikkelkomplekset fra den cellefrie reaksjonsblandingen ved bruk av His-taggen på Δ49ApoA1-proteinet.
- Overfør 1 ml av en 50 % oppslemming av His-Tag renseharpiks til en engangs 10 ml kromatografikolonne og øk den med 3 ml bindingsbuffer.
- La bufferen renne av, lokk utløpet og tilsett 250 μL bindingsbuffer til harpiksen.
- Før du legger til den cellefrie reaksjonen til kolonnen, lagre 20 μL for senere analyse av SDS-PAGE. Bland den cellefrie reaksjonen med den likevektede harpiksen og inkuber den på en laboratorievipper ved 4 °C i 1 time.
- Fjern hetten på kolonnen, vask hetten med 500 μL ekstra bindingsbuffer, og tilsett denne væsken til resten av kolonnen.
- Samle væskegjennomstrømningen fra kolonnen for senere analyse av SDS-PAGE.
- Vask kolonnen med 1 ml vaskebuffer inneholdende 20 mM imidazol seks ganger og samle fraksjoner. Pass på at harpiksen ikke tørker ut mellom vask. Ved den andre vasken beveges harpiksen kraftig ved å pipettere opp og ned med en 1 ml pipette.
- Eluer MOMP-tNLPene i seks 300 μL fraksjoner av elueringsbuffer 1 (inneholdende 250 mM imidazol), etterfulgt av en siste eluering med 300 μL elueringsbuffer 2 (inneholdende 500 mM imidazol). Ved den andre elueringen, beveg harpiksen kraftig ved å pipettere opp og ned med en 1 ml pipette.
6. Analyse av SDS-PAGE
MERK: Alle elueringsfraksjoner skal analyseres av SDS-PAGE for å screene for mengde og renhet av proteinet av interesse.
- Belastning 1 μL hver av det totale lysatet og gjennomstrømningen og deretter 5 μL for alle oppsamlede vasker og elueringsfraksjoner.
- Bland alikoter av de eluerte MOMP-tNLP-ene, vask, gjennomstrømning og total lysat med 4x SDS-PAGE prøvelastebuffer. Bland og varmdenaturer prøvene med 10x prøvereduksjonsmiddel med mindre annet er angitt.
- Analyser fraksjonene ved gelelektroforese ved bruk av 1,0 mm, 4 til 12%, Bis-Tris SDS-PAGE geler med 1x MES-SDS løpende buffer, sammen med en passende molekylvektstandard. Kjør gelene i 35 min ved 200 V.
- Flekk gelene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fjern gelen fra kassetten og legg den i 60 ml gelflekk. Mikrobølgeovn gelen i gelflekken i 30 s, og vugg beholderen forsiktig i 30 s for å fordele varmen jevnt. Mikrobølgeovn gelen i flekken til 80–85 °C i ytterligere 30 s, og legg gelen på en orbital shaker for å gynge i 5 minutter.
- Mikrobølgeovn gelen en tredje gang i 30 s, og gå deretter tilbake til orbital shaker for å rocke i ytterligere 23 minutter.
- Overfør gelen til en ren beholder og vask i 100 ml vaskeoppløsning (10% metanol, 7% eddiksyre) i 30 minutter.
MERK: Dette er et kritisk trinn, da det er viktig å unngå oppvarming av vaskeoppløsningen. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til bakgrunnsfarging og uregelmessigheter i det endelige gelbildet. - Etter vask, skyll gelen i ultrarent vann to ganger i 5 minutter hver.
- Avbilde gelene ved hjelp av et gel-imager ved 600 nm (figur 2). Bruk SDS-PAGE til å kvantifisere mengden av individuelt protein i nanopartikkelløsningen hvis det er en proteinstandard for sammenligning.
MERK: I dette eksemplet løses serielle fortynninger av rekombinant uttrykt MOMP av SDS-PAGE og tetthetene til båndene kvantifiseres ved hjelp av instrumentprogramvare. - Generer en standardkurve ved hjelp av tetthetene til MOMP-båndene. Løs MOMP-tNLP-prøvene på samme SDS-PAGE gel og beregne MOMP-komponenten av partiklene ved hjelp av MOMP-standardkurven (figur 3).
7. Western og dot blots og lagring
- For vestlig blotting, løs prøvene ved SDS-PAGE og overfør gelene ved hjelp av et kommersielt tørrblottingssystem med standardinnstillinger i henhold til produsentens protokoll.
- Fjern flekkene fra stabelen etter at overføringen er fullført, og inkuber hver flekk over natten ved 4 °C i en egnet blokkeringsbuffer inneholdende 0,2 % mellom 20 og enten 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS anti-His-tag antistoff rettet mot His-taggen fra Δ49ApoA1 protein.
MERK: Antistofffortynningene som brukes til blotting er 1:1,000 for MAb40 og 1:500-1,000 for MAbHIS antistoff. - Vask hver flekk 3 ganger i 5 minutter med PBS-T (1x PBS, 0,2% mellom 20, pH 7,4).
- Inkuber flekkene i 1 time i blokkerende buffer som inneholder sekundært antistoff konjugert til en fluorofor (f.eks. IRDye) ved en fortynning på 1:10 000.
- Vask blottene 3 ganger i 5 min med PBS-T. Bruk et fluorescensbilde til å avbilde flekkene etter den siste vasken.
- Fjern flekkene fra stabelen etter at overføringen er fullført, og inkuber hver flekk over natten ved 4 °C i en egnet blokkeringsbuffer inneholdende 0,2 % mellom 20 og enten 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS anti-His-tag antistoff rettet mot His-taggen fra Δ49ApoA1 protein.
- For punktflekker, blott 3 μg renset MOMP-tNLP og tøm tNLP ved hjelp av et prikkblotapparat. Blokker og utvikle flekkene ved å bruke de samme metodene som beskrevet ovenfor for vestlig blotting.
8. Endotoksin vurdering
- Kvantifiser endotoksinnivåer ved hjelp av et endotoksintestsystem basert på Limulus Amebocyte Lysate (LAL) analysen. Forbered endotoksinfri 25 mM Tris, pH 7,4, prøvebuffer ved bruk av 1 M Tris hydrokloridløsning og endotoksinfritt vann.
MERK: Vanligvis må prøvene fortynnes ved hjelp av denne prøvebufferen, og fortynningene justeres for å finne det passende området for individuelle prøver. Her fortynnes MOMP-tNLP-prøver 500 ganger i prøvebuffer og 25 μL lastes inn i hver brønn på en enhetskassett med 0,05 EU/ml følsomhet. Endotoksinnivåene av MOMP-tNLP og tNLP brukt i musestudiene beskrevet nedenfor er mellom 0,4 og 12 EU/μg protein, avhengig av prøven.
9. Lyofilisering
- Lyophilize og lagre MOMP-tNLP nanopartikler for langvarig (opp til år) bruk ved -20 ° C. For å forberede tNLP- og MOMP-tNLP-suspensjoner for lyofilisering, legg til trehalose som et beskyttelsesmiddel under fryse- og lyofiliseringsprosessen.
MERK: Denne prosessen har blitt grundig validert for en rekke tNLP formuleringer 7,8. - Del det nåværende volumet av MOMP-tNLP-løsningen med 9 for å oppnå volumet av 1 M trehalose i sterilt, endotoksinfritt, avionisert vann som kreves for å nå en endelig konsentrasjon på 0,1 M trehalose. Noter det endelige volumet og alikot i endotoksinfrie 15 ml eller 50 ml polypropylenrør etter ønske.
- Frys den blandede løsningen på tørris og lyofiliser den over natten ved hjelp av en lyofilisator. Oppbevar de tørkede formuleringene ved -20 °C til det trengs.
- Rekonstituer lyofiliserte tNLP ved bruk av endotoksinfritt vann. Rull forsiktig til den lyofiliserte kaken er fullstendig oppløst og rehydrert. For å fjerne trehalose, dialyser oppløsningen mot PBS ved hjelp av en 3,5 kDa cutoff dialysemembran.
10. Adjuvant tillegg
MERK: Disse og andre lignende NLP-baserte sub-enhet vaksineformuleringer kan lett innlemme lipofile hjelpestoffer som CpG-ODN1826 og FSL-1. CpG-ODN1826 er et modifisert klasse B CpG oligonukleotid (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') med en full fosforotioatryggrad med en 5' kolesteroldel (5'-chol-C6). Konjugeringen av CpG-ODN1826 til tNLP er mediert av de hydrofobe interaksjonene mellom kolesteroldelen og fosfolipid-dobbeltlaget av tNLP og har blitt demonstrert og godt karakterisert, som tidligere rapportert 9,10.
- Før inkorporering i disse formuleringene, rens kolesterolmodifisert CpG ved omvendt fasekromatografi for å fjerne forurensende endotoksin, så vel som eventuelle umodifiserte CpG-molekyler.
- Etter mottak fra leverandøren, rehydrer det lyofiliserte CpG-materialet i endotoksinfritt vann og rens det på en preparativ C4 RP-HPLC-kolonne ved bruk av en separasjonsgradient bestående av 10 mM trietylammoniumacetat (TEAA) (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B).
MERK: Ytterligere detaljer er tilgjengelig i tabell 2. - Basseng og lyofiliser fraksjonene som inneholder kolesterolmodifisert CpG. For å sikre fullstendig fjerning av gjenværende TEAA, rekonstituer CpG med 15 ml endotoksinfritt vann og re-lyofiliser det tre ganger.
- Etter endelig lyofilisering rekonstitueres CpG i endotoksinfritt vann (>20 mg/ml endelig CpG-konsentrasjon), alikot og oppbevares ved -80 °C til det trengs. For tilsetning til formuleringer, fortynn CpG til en konsentrasjon på 1-2,5 mg / ml.
MERK: FSL-1 er tilgjengelig som et vaksine-grade, lyofilisert pulver. Dette rekonstitueres ved bruk av sterilt og endotoksinfritt vann i en konsentrasjon på 1 mg/ml. Vaksinen administreres intramuskulært (i.m.), med hver dose som inneholder 10 μg MOMP i et totalvolum på 50 μL.
- Etter mottak fra leverandøren, rehydrer det lyofiliserte CpG-materialet i endotoksinfritt vann og rens det på en preparativ C4 RP-HPLC-kolonne ved bruk av en separasjonsgradient bestående av 10 mM trietylammoniumacetat (TEAA) (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B).
- For å oppnå ønsket formuleringsdose, dialyser nanopartiklene i PBS og konsentrerer dem ved hjelp av en sentrifugalvakuumkonsentrator før adjuvant tilsetning. Vær forsiktig når du gjør dette for å forhindre fullstendig tørking av prøven - kontroller prøvevolumet hvert 20-30 minutt under sentrifugering.
- Tilsett adjuvansen under sterile forhold i et biosikkerhetsskap. For å vurdere vellykket innlemmelse, analyser de endelige formuleringene og deres komponenter ved analytisk størrelsesekskluderingskromatografi (SEC).
MERK: For disse preparatene ble en SEC-kolonne brukt i PBS-buffer (0,5 ml/m i strømningshastighet), og eluering ble detektert ved hjelp av en UV-vis-diode-arraydetektor. Inkorporering ble vurdert ved å sammenligne absorpsjonen av de adjuvante partiklene med absorpsjonen til de ikke-adjuvante partiklene ved 214 og 280 nm. - Oppbevar adjuvans MOMP-tNLP og tøm tNLP ved 4 °C før bruk av dyr i en periode på opptil 14 dager. For å fullt ut vurdere stabiliteten til en ny tNLP-formulering, analyser regelmessig de lagrede tNLP-ene med SEC.
MERK: Stabiliteten vil variere fra formulering til formulering.
11. Serum-testing
- Få tak i hunnmus på 3 uker (BALB/c, n = 6).
- Vaksiner musene intramuskulært (i.m.) i hver baklem med 10 μg MOMP i form av MOMP-tNLP adjuvans med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (totalt volum per injeksjon = 50 ml).
- Etter vaksinasjon, observer musene til de er i stand til å opprettholde sternal recumbency.
- Fire uker etter første vaksinasjon (prime), vaksiner dyrene en gang til (boost) med 10 μg MOMP i form av MOMP-tNLP adjuvans med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (totalvolum per injeksjon = 50 ml).
- På dag 56 etter den første vaksinasjonen, samle blod for å vurdere antistofftitere. Begynn med å bedøve musene ved å injisere i.p. en løsning av xylazin (0,3 mg/20 g kroppsvekt) og ketamin (3,0 mg/20 g kroppsvekt). Klyp sammen for- og bakbena for å sikre at det ikke rykker. Påfør vaselin rundt øynene for å forhindre øyetørrhet under anestesi.
- Bruk et mikrohematokrit kapillærrør, punkter retro-orbital plexus. Samle 100 ml blod i et mikrosentrifugerør.
- Etter blodinnsamling, observer musene til de gjenoppretter fra anestesi og kan opprettholde sternal recumbency.
- La blodet koagulere ved romtemperatur i 30 min og deretter spinne ned ved 2000 × g i 10 minutter. Oppsamle serumet og frys ved -80 °C.
- På dette tidspunktet, utfordre dyrene med Chlamydia muridarum eller avlive dem. Avlive musene ved først å injisere i.p. en oppløsning av xylazin (0,3 mg/20 g kroppsvekt) og ketamin (3,0 mg/20 g kroppsvekt) etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Test serumantistoffer spesifikke for MOMP ved bruk av vestlige blottingsteknikker som beskrevet ovenfor. Bassengmussera fra alle immuniserte mus og bruk det samlede serumet i stedet for et primært antistoff ved 1:5 000 fortynning.
Representative Results
SDS-PAGE-profilen for Ni-affinitetsrensingen av MOMP-tNLP fra en cellefri reaksjon på 1 ml er vist i figur 1B. Reaksjonen resulterte i høye ekspresjonsnivåer for både MOMP og Δ49ApoA1-proteinet. Tidligere resultater viste at det cellefrie uttrykket av Δ49ApoA1 i nærvær av DMPC og telodendrimer resulterte i dannelsen av telodendrimer nanolipoproteinpartikler (tNLPs)4. Samelueringen av MOMP med Δ49ApoA1 indikerte at MOMP er assosiert med tNLP-er, da His-taggen bare er tilstede på tNLP-stillaset Δ49ApoA1 og ikke på MOMP. MOMP er et svært uoppløselig protein som bare kan elueres gjennom kompleksdannelse med tNLP, som har vist seg å lette oppløseliggjøringen av membranproteiner.
Elusjonsfraksjonene som inneholdt MOMP-tNLP ble samlet og den totale proteinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av en fluorescensbasert kvantifiseringsanordning, eller en enhet som måler konsentrasjon gjennom absorbans ved 280 nm, i henhold til produsentens instruksjoner for proteinkvantifisering. For å muliggjøre presis dosering av MOMP-vaksinen, er det også viktig å bestemme konsentrasjonen av MOMP i de rensede kompleksene. Vi utviklet en metode for å kvantifisere MOMP basert på geldensitometri (figur 2) der en renset rekombinant MOMP med kjent konsentrasjon ble brukt som standard. Ved å etablere standardkurven og sammenligne den med MOMP-tNLP-prøven, kan MOMP-konsentrasjonen kvantifiseres nøyaktig. Bestemmelsen av MOMP-konsentrasjon i den rensede prøven gjorde det mulig å estimere utbyttet av MOMP i cellefrie reaksjoner på forskjellige skalaer, noe som er viktig for planlegging av reaksjonsoppsettet som passer til nedstrømsstudier (tabell 3).
MOMP må danne oligomerer for å fremkalle en robust immunrespons11. For å teste den oligomere tilstanden til MOMP ble MOMP-tNLP analysert i nærvær og fravær av både varme og reduksjonsmiddelet dithiothreitol (DTT, 50 mM, figur 3A). Høyere ordens oligomerer av MOMP ble identifisert gjennom SDS-PAGE når prøvene ikke ble behandlet med varme og DTT. Til sammenligning viste prøver behandlet med varme i nærvær av DTT primært to forskjellige bånd på gelen, tilsvarende MOMP og Δ49ApoA1 (henholdsvis ca. 40 kDa og 22 kDa). Disse resultatene ligner på gelbåndmønsteret som tilskrives oligomerdannelse av MOMP, noe som er kritisk for effektiviteten.
Videre western blot-analyse ved bruk av MAb40, et antistoff mot den lineære epitopen på det variable domenet til MOMP-protein, viste et lignende båndmønster, som bekreftet oligomerdannelsen av MOMP-protein i sin ikke-denaturerte tilstand (figur 3B). En viktig faktor som påvirker MOMP-oligomerdannelsen er forholdet mellom MOMP-plasmidet og Δ49ApoA1-plasmidet under det cellefrie reaksjonsoppsettet. Tabell 4 viser forholdet mellom plasmider og den resulterende innsettingshastigheten for MOMP i tNLP. Tidligere studier indikerte at klamydial MOMP og andre ytre membranproteiner kan eksistere primært som trimere12. For å maksimere trimerdannelsen i den cellefrie reaksjonen, er det ønskelig å ha innsettingshastigheten nær tre MOMP-proteiner per NLP, noe som tilsvarer et ~ 25: 1 MOMP-til-Δ49ApoA1 plasmidforhold.
En dot blot-analyse ble brukt som en mer strømlinjeformet metode for å oppdage tilstedeværelsen av MOMP og tNLP. MAb40-antistoffet ble brukt til å påvise total MOMP. MAbHES-antistoffet rettet mot His-taggen på Δ49ApoA1-stillaset til tNLP ble brukt til å vurdere tilstedeværelsen av tNLP. Samtidig signalering av MAb40- og MAbHIS-antistoffer indikerte MOMP-tNLP-dannelse. Kontrollreaksjonen ga tom tNLP, som bare viste et positivt signal fra MAbHIS (figur 3C). For å teste immunogeniteten til MOMP-tNLP produsert i den cellefrie reaksjonen, adjuvanterte vi MOMP-tNLP med CpG + FSL-1 og injiserte intramuskulært (im) i mus i et prime-boost-regime som beskrevet ovenfor. Sera ble samlet fra de immuniserte musene, og MOMP-spesifikt IgG-antistoff ble målt med en western blot-analyse (figur 4). Sera fra mus injisert med adjuvans MOMP-tNLP viste sterk MOMP-binding, noe som indikerer at MOMP-tNLP kunne fremkalle en immunrespons in vivo.
Figur 1: Ekspresjon og rensing av MOMP-tNLP. (A) Bilde av rør som inneholder små alikoter av en cellefri reaksjon som vellykket uttrykte GFP-kontroller som lyserer under UV-lyskilde (høyre) sammenlignet med lysater uten GFP-plasmid (venstre). (B) Proteingel farget med SYPRO Ruby etter SDS-PAGE viser renseprofilen til MOMP-tNLP. MOMP migrerer ved 40 kDa og 49ApoA1 migrerer ved 22 kDa. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikkel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; GFP = grønt fluorescerende proteinkodende plasmid; MW = Molekylvektmarkør; T = totalt cellefritt lysat; FT = gjennomstrømning; R1-R3 = cellefrie reaksjonsalikoter; W1, W6 = vasker 1 og 6; E1-E7 = Eluions 1 til 7; Δ49ApoA1 = His-merket mus ApoA1 derivat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av MOMP i MOMP-tNLP-prøver. (A) SDS-PAGE gel farget med SYPRO Ruby for kvantifisering av MOMP. Rekombinant MOMP med kjent konsentrasjon ble lastet på gelen for å oppnå standardkurven. Hver bane inneholdt 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg og 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-prøver som ble kvantifisert, ble lastet på samme gel. (B) MOMP-konsentrasjonsstandardkurven ble generert ved hjelp av densitometri. En ligning knyttet til normalisert båndtetthet og mengden MOMP ble etablert. Ligningen ble brukt til å beregne MOMP-innholdet i de ukjente prøvene. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikkel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellefri produsert MOMP-tNLP tillater MOMP å danne høyere ordens strukturer. (A) SDS-PAGE gel av MOMP-tNLP med og uten behandling av varme og reduksjonsmiddel DTT, farget med SYPRO Ruby. Med varme og DTT oppstod MOMP primært som et monomerbånd ved ~ 40 kDa, da varme og reduksjonsmiddel brøt ned flertallet av høyere ordens MOMP-struktur. I fravær av varme og DTT var de høyere ordensbåndene til stede, noe som indikerer MOMP-oligomerkonformasjon. (B) Western blot av MOMP-tNLP og MOMP alene, ubehandlet og behandlet med varme og DTT. Etter overføring ble membranen undersøkt med MAb40 (1:1000 fortynning). Et båndmønster som ligner på SYPRO Ruby-farget gel ble observert, og bekreftet at de høyere molekylvektbåndene faktisk var MOMP-oligomerer. (C) Dot blot av MOMP-tNLP og tomme tNLP prøver (i duplikat) undersøkt med MAb40 og MAbHIS. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikkel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese; DTT = dithiothreitol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cellefritt produsert MOMP-tNLP er svært immunogent. Serum fra immuniserte mus viste sterkt anti-MOMP IgG-signal. MOMP-tNLP adjuvans med CpG + FSL-1 ble brukt til å immunisere mus. Sera fra seks immuniserte mus ble samlet, samlet og brukt til å undersøke MOMP-tNLP. Serumet klarte å binde seg til MOMP i en vestlig blottingsanalyse og viste sterkt IgG-signal (venstre). Western blot med MAb40 som primært antistoff (til høyre) viste lignende bånd, noe som indikerer at serumet inneholdt MOMP-spesifikk IgG. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikkel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; CpG = kolesterolmodifisert CpG-adjuvans; FSL-1 = lipofil adjuvans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på buffer | NaH2PO4 | NaCl | Imidazol | Ph |
| Bindende buffer | 50 mM | 300 mM | 10 mM | 8.0 |
| Vask buffer | 50 mM | 300 mM | 20 mM | 8.0 |
| Elution Buffer 1 | 50 mM | 300 mM | 250 mM | 8.0 |
| Eluion Buffer 2 | 50 mM | 300 mM | 500 mM | 8.0 |
Tabell 1 Liste over buffere som trengs for rensing av nikkelaffinitet, med detaljer om konsentrasjoner av hver komponent og pH.
| Runtime | 50 min |
| Strømningshastighet | 6,0 ml/min |
| Gradert type | Binær |
| Buffer A | 10 mM TEAA i H20 |
| Buffer B | MeCN |
| Gradient | % Buffer B |
| 0 min | 25% |
| 30 min | 60% |
| 30,5 min | 100% |
| 40 min | 100% |
| 40,5 min | 25% |
| 50 min | 25% |
Tabell 2: Betingelser for omvendt fase HPLC-rensing av kolesterolmodifisert CpG. Forkortelser: TEAA = trietylammoniumacetat; MeCN = acetonitril.
| Cellefritt lysat (ml) | DMPC lipid (mg) | Telodendrimer (mg) | MOMP plasmid (μg) | Renset MOMP-utbytte (mg) |
| 1 | 4 | 0.4 | 15 | 0.5 |
| 2 | 8 | 0.8 | 30 | 1.1 |
| 3 | 12 | 1.2 | 45 | 1.6 |
| 5 | 20 | 2 | 75 | 2.7 |
Tabell 3: Mengden lipider, telodendrimer og plasmider som brukes til forskjellige skalerte cellefrie reaksjoner og tilsvarende utbytter. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin.
| Forhold mellom plasmidinngang, MOMP: Δ49ApoA1 | 1:1 | 5:1 | 10:1 | 25:1 | 50:1 | 100:1 | |
| Forhold mellom mengden protein produsert, MOMP: Δ49ApoA1 | 0.02 | 0.32 | 0.64 | 3.46 | 6.55 | 20.04 | |
| Anslått antall MOMP-innsetting per tNLP | 0.03 | 0.37 | 0.75 | 4.04 | 7.65 | 23.39 | |
Tabell 4: Plasmidforholdene i en cellefri reaksjon og de resulterende MOMP-innsettingshastighetene. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ytre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikkel; Δ49ApoA1 = His-merket mus ApoA1 derivat.
Discussion
Klamydia er den vanligste seksuelt overførbare infeksjonen som rammer både menn og kvinner. Selv om vaksineforskning på klamydia strekker seg over flere tiår, har en trygg og effektiv vaksine som kan skaleres til masseproduksjon vært unnvikende13. Den klamydiale MOMP regnes som hovedkandidaten som et beskyttende vaksineantigen; MOMP er imidlertid svært hydrofob og utsatt for feil folding14,15. Videre studier har vist at MOMP eksisterer i oligomere tilstander som er essensielle for immunogeniteten11. Detaljert her er en validert, cellefri samuttrykksmetode som produserer oligomere MOMP dannet i tNLP nanopartikkel som en vaksine, med utbytter på ca. 1, 5 mg renset MOMP per 3 ml lysat. Denne fullt sammensatte prosedyren kan skaleres ytterligere for industriell produksjon, og øke utsiktene som en nyttig tilnærming for å generere vaksiner.
Vi har tidligere publisert om bruk av cellefritt uttrykk for å produsere membranproteiner innebygd i NLP 3,16, samt ekspresjon i telodendrimerstabiliserte skiver. Imidlertid produserte denne sistnevnte teknikken membran-proteinpartikler med større heterogenitet og lavere oppløselighet. 4 I tillegg er immunogeniteten til MOMP-telodendrimerpartikler uklar sammenlignet med MOMP-tNLP-partikler6.
Denne prosedyren kan tilpasses for å skalere opp uttrykket av bakterielle membranproteiner som er lovende kandidater som antigener for bruk i subenhetsvaksiner. Ikke bare produserer denne prosedyren løselig bakteriell membranprotein, men den generelle nanopartikkelstrukturen er egnet til ytterligere modifikasjon ved hjelp av en rekke lipofile vaksinehjelpestoffer, inkludert, men ikke begrenset til, CpG konjugert til en kolesteroldel eller FSL-1. Ekspresjon av andre kandidatantigener fra bakterier er mulig, selv om parametere som ekspresjonstemperatur, lipidvalg og type ekspresjonssystem kanskje må utforskes for å oppnå optimale utbytter.
I tillegg er plasmidvalg og forhold kritisk i denne prosessen. Begge plasmidene som brukes skal være konstruert fra samme ryggrad. Hvis innsatsene er omtrent like lange, kan forholdene baseres på massen av plasmidet som er tilsatt, som beskrevet her. Imidlertid vil rasjonering basert på føflekker gi mer reproduserbare resultater, spesielt ved skalering av reaksjonene. Forhold som fungerer bra i skjermskalareaksjoner (< 0,5 ml) kan ikke gjelde for større reaksjoner og kan kreve ytterligere optimalisering. Ikke-membranproteiner kan fortsatt uttrykkes ved hjelp av cellefrie sett, men kan ikke kreve lipidnanopartikkelen (samuttrykk) for å produsere et løselig produkt. I tillegg, mens denne protokollen beskriver adjuvans med CpG og FSL-1, er dette systemet egnet til formulering med andre lipofile hjelpestoffer eller blanding med løselige hjelpestoffer etter ønske.
Det er viktig å unngå forurensning når du setter opp den cellefrie uttrykksreaksjonen, da dette kan påvirke utbyttet. Eventuelle tilsetningsstoffer til reaksjonen, inkludert plasmidene selv, bør være svært rene. I tillegg bør de uttrykte proteinene bare være i kontakt med materialer og løsninger som er fri for endotoksinforurensning. Endotoksinforurensning i kandidatformuleringer kan føre til inkonsistente og falske resultater av immunologiske analyser og kan være skadelig i tilstrekkelige mengder. Selv om det ikke er beskrevet her, kan ytterligere rensing etter nikkelaffinitetskromatografi være nødvendig hvis mange kontaminanter observeres i påfølgende analysetrinn, for eksempel gjennom SDS-PAGE. Dette kan oppnås med SEC, selv om forholdene kan kreve optimalisering på en formulering ved formulering basis.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service grant R21 AI20925 og U19 AI144184 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dette arbeidet ble utført i regi av US Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
| 1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
| 1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
| Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
| C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
| cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
| CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
| Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
| Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
| Electrophoresis Power Supply | |||
| Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
| Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
| Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
| HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
| HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
| HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
| iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
| iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
| Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
| Microcentrifuge | |||
| Microwave oven | |||
| NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
| Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Orbital Shaker | |||
| PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
| PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
| pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
| Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
| Probe sonicator | |||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
| Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
| Rainin Pipettes | Rainin | ||
| Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
| Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
| Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
| Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
| SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
| UV light source | |||
| Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
| Vortexer | |||
| VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
| VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
| XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Coleman, M. A., et al. Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles. PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- He, W., et al. Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry. Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).
- He, W., et al. Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).
- Tifrea, D. F., et al. Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles. Vaccines. 9 (7), 755 (2021).
- Cleveland, T. E., et al. Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles. Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).
- Fischer, N. O., et al. Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).
- Fischer, N. O., et al. Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).
- Fischer, N. O., et al. Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).
- Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria. Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).
- Sun, G., et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).
- Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection. Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).
- Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein. BMC Microbiology. 5, 5 (2005).
- Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein. Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).
- He, W., et al. Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases. Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).
