Summary
Detta protokoll beskriver användningen av kommersiella, cellfria proteinuttryckssatser för att producera membranproteiner som stöds i nanoskivor som kan användas som antigener i subenhetsvacciner.
Abstract
Subenhetsvacciner erbjuder fördelar jämfört med mer traditionella inaktiverade eller försvagade helcellsbaserade vacciner när det gäller säkerhet, stabilitet och standardtillverkning. För att uppnå ett effektivt proteinbaserat subenhetsvaccin behöver proteinantigenet ofta anta en inhemsk-liknande konformation. Detta är särskilt viktigt för patogenytantigener som är membranbundna proteiner. Cellfria metoder har framgångsrikt använts för att producera korrekt veckat funktionellt membranprotein genom samöversättning av nanolipoproteinpartiklar (NLP), allmänt kända som nanoskivor.
Denna strategi kan användas för att producera subenhetsvacciner bestående av membranproteiner i en lipidbunden miljö. Cellfri proteinproduktion är dock ofta begränsad till småskalighet (<1 ml). Mängden protein som produceras i småskaliga produktionsserier är vanligtvis tillräcklig för biokemiska och biofysiska studier. Den cellfria processen måste dock skalas upp, optimeras och testas noggrant för att få tillräckligt med protein för vaccinstudier i djurmodeller. Andra processer som är involverade i vaccinproduktion, såsom rening, adjuvanstillsats och frystorkning, måste optimeras parallellt. Detta dokument rapporterar utvecklingen av ett uppskalat protokoll för att uttrycka, rena och formulera ett membranbundet proteinsubenhetsvaccin.
Uppskalade cellfria reaktioner kräver optimering av plasmidkoncentrationer och förhållanden vid användning av multipla plasmiduttrycksvektorer, lipidval och adjuvanstillsats för högnivåproduktion av formulerade nanolipoproteinpartiklar. Metoden demonstreras här med uttryck av ett klamydialt större yttre membranprotein (MOMP) men kan tillämpas i stor utsträckning på andra membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan utvärderas in vivo genom immuniseringsstudier för att mäta antikroppsproduktion, vilket visas här.
Introduction
Prokaryota eller eukaryota lysat för cellfritt uttryck av proteiner är lätt tillgängliga som kommersiella produkter för att syntetisera proteiner av intresse (för en fullständig genomgång, se 1). Dessa uttryckssystem finns i olika skalor och använder lysater från olika organismer, inklusive E. coli, tobaksplantor och däggdjurskulturer. Cellfria lysater erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella rekombinanta proteinproduktionsmetoder, inklusive användarvänlighet och robust, snabb proteinproduktion. Även om dessa metoder främst används för att producera lösliga proteiner, har denna grupp banat väg för ett tillvägagångssätt för deras användning för att uttrycka membranproteiner.
Detta nya tillvägagångssätt gör mindre modifieringar av befintliga cellfria expressionssystem genom att inkludera DNA som kodar för två proteinprodukter för uttryck, ett apolipoprotein och membranproteinet av intresse. Det uttryckta apolipoproteinet (derivat av antingen ApoA1 eller ApoE4) interagerar med lipider tillsatta till det cellfria lysatet för att spontant montera (~ 20 nm) NLP. När de översätts tillsammans med ett membranprotein av intresse bildar NLP och membranproteinet ett lösligt nanopartikelkomplex där membranproteinet är inbäddat i NLP-lipiddubbelskiktet. Således är membranproteinet mer tillgängligt för nedströmsapplikationer, eftersom det finns i lösliga, diskreta partiklar. Detta tillvägagångssätt kan producera funktionella oligomera proteinkomplex inom NLP-bilager2 och kan producera antigenkomponenten i ett subenhetsvaccin, som därefter blandas med lipofila adjuvans för att bilda ett nanopartikelvaccin med samlokaliserat antigen och adjuvans lämpligt för in vivo-bedömning .
Denna nuvarande metod är modifierad från ett tidigare publicerat protokoll3. Viktiga modifieringar är inriktade på uppskalning av den cellfria reaktionen och efterföljande rening av protein-NLP-komplexet. En ytterligare modifiering innefattar tillsats av en amfifil polymer känd som en telodendrimer, som först blandas med lipiderna innan den tillsätts till den cellfria reaktionen. Samöversättning av plasmiderna i närvaro av telodendrimeren och lipiderna ger en telodendrimer NLP (tNLP). Tillsatsen av telodendromen hjälper också till att modulera storleken och monodispersiteten hos de resulterande tNLP-nanopartiklarna4. Detta protokoll är specifikt optimerat för storskaliga vaccinstudier för att producera ett membranbundet subenhetsantigenprotein, klamydialt MOMP 5,6. Metoden producerar rekombinant MOMP associerad med tNLP för att bilda ett mycket lösligt MOMP-tNLP-komplex som behåller MOMP-oligomerisering. En typisk 3 ml uppskalningsproduktion ger >1,5 mg renad MOMP. Den cellfria producerade MOMP-tNLP är mottaglig för snabb adjuvant tillsats för immunogenicitetstestning in vivo.
Protocol
Alla djurstudier utfördes vid University of California, Irvine, i Public Health Service (PHS)-försäkrade anläggningar i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Förberedelse av glasvaror
OBS: Alla material som används vid framställning av formuleringar av vaccinkvalitet för djur är endotoxinfria.
- För att förstöra förorenande endotoxin, baka rengjorda glasvaror som håller buffertar i en ugn vid 180 ° C i 4 timmar.
2. Förberedelse av buffert
- Bered 250 ml av de Ni-affinitetsreningsbuffertar som anges i tabell 1. Förvara dem vid 4 °C i upp till 6 månader.
3. Beredning av reaktion
- Väg upp 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC) i ett endotoxinfritt 1,5 ml centrifugrör. Lös upp det i 1 ml endotoxinfritt vatten, sond-sonicate minst fyra gånger vid 6 A i 1 min, med 1 min pauser däremellan, tills det är klart. Ta bort eventuell förorenande metall från sonden genom centrifugering vid 13 000 × g i 2 minuter vid 22 °C och överför sedan den lösliga lipiden till ett nytt 1,5 ml endotoxinfritt rör.
- Väg upp 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer i ett 1,5 ml endotoxinfritt rör. Lös i endotoxinfritt vatten till en koncentration av 20 mg/ml. Virvel tills den är helt upplöst och späd till 2 mg/ml.
- I ett nytt endotoxinfritt rör kombinerar du 210 μL 20 mg/ml DMPC-lösning med 210 μL 2 mg/ml telodendrimerlösning.
4. Cellfri produktion av MOMP-tNLP för subenhetsvaccinformuleringar
- Förbered MOMP-tNLP med cellfria metoder modifierade från ett tidigare publicerat protokoll5.
- Två timmar innan du ställer in den cellfria reaktionen, öppna det prokaryota cellfria proteinuttryckssatsen och tina en av rekonstitueringsbuffertarna. När den har tinats, tillsätt en tablett EDTA-fri proteashämmarecocktail och låt den lösas upp helt.
- Följ detta protokoll med ett kit som är utformat för att köra 5 x 1 ml reaktioner.
OBS: En typisk uppskalningsproduktion är 3 x 1 ml.- För varje 1 ml reaktion, tillsätt 525 μL beredningsbuffert till E. coli-lysatflaskan och rulla försiktigt för att lösa upp . Tillsätt 250 μl beredningsbuffert till flaskan som innehåller reaktionsadditiv (t.ex. ATP, GTP) och rulla försiktigt för att lösa upp den.
- Tillsätt 8,1 ml beredningsbuffert till reaktionsmatningsflaskan, sätt tillbaka locket med en gummipropp (var försiktig så att du inte vidrör gummiproppens insida) och vänd/rulla försiktigt för att lösa upp det.
- Tillsätt 3 ml beredningsbuffert till aminosyrablandningsflaskan, sätt på locket med en gummipropp och vänd/rulla försiktigt för att lösa upp.
OBS: Var försiktig så att du inte vidrör insidan av gummiproppen eftersom det kan leda till kontaminering. - Tillsätt 1,8 ml beredningsbuffert till metioninflaskan, rulla försiktigt för att lösa upp och förvara sedan på is tills den används.
- Förbered reaktionslösningen.
- Tillsätt 225 μl färdigberedd reaktionsblandning, 270 μl rekonstituerad aminosyrablandning utan metionin och 30 μl rekonstituerad metionin till E. coli-lysatflaskan . Tillsätt dessutom 400 μL av DMPC/telodendrimerblandningen, 15 μg MOMP-plasmid och 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rulla/skaka försiktigt för att blanda.
OBS: Se till att båda plasmiderna är konstruerade från samma plasmidryggrad. Virvla inte. - Ta 20 μl av den totala lösningen och lägg den åt sidan i ett 1,5 ml rör för GFP-uttryckande kontrollreaktion (se nedan).
- Tillsätt 225 μl färdigberedd reaktionsblandning, 270 μl rekonstituerad aminosyrablandning utan metionin och 30 μl rekonstituerad metionin till E. coli-lysatflaskan . Tillsätt dessutom 400 μL av DMPC/telodendrimerblandningen, 15 μg MOMP-plasmid och 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rulla/skaka försiktigt för att blanda.
- Förbered matningslösningen. Tillsätt 2,65 ml färdigberedd aminosyrablandning utan metionin och 300 μl rekonstituerat metionin till foderblandningsflaskan. Rulla/skaka försiktigt för att lösa upp.
OBS: Vid denna tidpunkt kan den oanvända beredningsbufferten och metionin återföras till frysen för förvaring. - Överför 1 ml av reaktionslösningen till den inre reaktionskammaren som finns i den cellfria reaktionssatsen och försegla när den är fylld. Överför 10 ml av matningslösningen till reaktionskärlets yttre kammare och tätning.
OBS: Överfyll inte kamrarna! Närvaron av luftbubblor på toppen av både den inre reaktionskammaren och den inre matningskammaren kommer att påverka reaktionen negativt. Eventuell återstående reaktionslösning kan placeras i ett 1,5 ml rör och får blandas vid sidan av huvudkärlet. - Tillsätt 0,5 μl GFP-kontrollplasmid (0,5 mg/ml) till den tidigare alikvoterade reaktionsblandningen på 20 μl.
OBS: Många kit levereras med en kontrollplasmid för kvalitetskontrolländamål. De flesta GFP-uttryckande plasmider med en T7-promotor och E. coli-ribosombindningsställe (RBS) kan också användas som kontrollplasmid. - Placera reaktionen i en shaker vid 300 rpm, 30 °C i upp till 18 timmar. För att verifiera att reaktionen lyckades, använd en UV-ljuskälla för att kontrollera fluorescens på grund av syntesen av kontroll-GFP (figur 1A) efter så lite som 15 minuters inkubation.
OBS: Dessa förhållanden, särskilt temperatur, kan behöva optimeras för uttryck av andra membranproteiner.
5. MOMP-tNLP-rening
- Använd immobiliserad nickelaffinitetskromatografi för att rena MOMP-tNLP-nanopartikelkomplexet från den cellfria reaktionsblandningen med användning av His-taggen på Δ49ApoA1-proteinet.
- Överför 1 ml av en 50% uppslamning av His-Tag Resin till en engångs 10 ml kromatografikolonn och balansera den med 3 ml bindningsbuffert.
- Låt bufferten rinna av, täck utloppet och tillsätt 250 μL bindningsbuffert till hartset.
- Innan du lägger till den cellfria reaktionen i kolonnen, spara 20 μL för senare analys med SDS-PAGE. Blanda den cellfria reaktionen med det jämviktsbaserade hartset och inkubera det på en laboratorievippa vid 4 °C i 1 timme.
- Ta bort locket på kolonnen, tvätta locket med 500 μL ytterligare bindningsbuffert och tillsätt denna vätska till resten av kolonnen.
- Samla vätskeflödet från kolonnen för senare analys av SDS-PAGE.
- Tvätta kolonnen med 1 ml tvättbuffert innehållande 20 mM imidazol sex gånger och samla fraktioner. Var försiktig så att hartset inte torkar ut mellan tvättarna. Vid den andra tvätten, skaka kraftigt hartset genom pipettering upp och ner med en 1 ml pipett.
- Eluera MOMP-tNLP i sex 300 μl-fraktioner av elueringsbuffert 1 (innehållande 250 mM imidazol), följt av en slutlig eluering med 300 μl elueringsbuffert 2 (innehållande 500 mM imidazol). Vid den andra elueringen skakas hartset kraftigt genom pipettering upp och ner med en 1 ml pipett.
6. Analys av SDS-PAGE
OBS: Alla elueringsfraktioner bör analyseras av SDS-PAGE för att screena för kvantitet och renhet av proteinet av intresse.
- Fyll 1 μl på vardera det totala lysatet och genomströmningen och därefter 5 μl för alla uppsamlade tvättar och elueringsfraktioner.
- Blanda alikvoter av de eluerade MOMP-tNLP: erna, tvättar, genomströmning och totalt lysat med 4x SDS-PAGE provladdningsbuffert. Blanda och värmedenaturera proverna med 10x provreduktionsmedel om inte annat anges.
- Analysera fraktionerna med gelelektrofores med 1,0 mm, 4 till 12%, Bis-Tris SDS-PAGE geler med 1x MES-SDS löpande buffert, tillsammans med en lämplig molekylviktstandard. Kör gelerna i 35 min vid 200 V.
- Färga gelerna enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta bort gelén från kassetten och placera den i 60 ml gelfläck. Mikrovågsugn gelén i gelfläcken i 30 sekunder och skaka försiktigt behållaren i 30 sekunder för att fördela värmen jämnt. Mikrovågsugn gelen i fläcken till 80–85 ° C i ytterligare 30 sekunder och placera gelen på en orbital shaker för att rocka i 5 minuter.
- Mikrovågsugn gelén en tredje gång i 30 sekunder och återgå sedan till orbitalskakaren för att rocka i ytterligare 23 minuter.
- Överför gelen till en ren behållare och tvätta i 100 ml tvättlösning (10% metanol, 7% ättiksyra) i 30 minuter.
OBS: Detta är ett kritiskt steg eftersom det är viktigt att undvika uppvärmning av tvättlösningen. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i bakgrundsfärgning och oegentligheter i den slutliga gelbilden. - Efter tvättning, skölj gelén i ultrarent vatten två gånger i 5 minuter vardera.
- Avbilda gelerna med en gelkamera vid 600 nm (figur 2). Använd SDS-PAGE för att kvantifiera mängden individuellt protein i nanopartikellösningen om det finns en proteinstandard för jämförelse.
OBS: I detta exempel löses seriella utspädningar av rekombinant uttryckt MOMP med SDS-PAGE och bandens densiteter kvantifieras med hjälp av instrumentprogramvara. - Generera en standardkurva med hjälp av MOMP-bandens densiteter. Lös MOMP-tNLP-proverna på samma SDS-PAGE-gel och beräkna partiklarnas MOMP-komponent med MOMP-standardkurvan (figur 3).
7. Western och dot blots och lagring
- För western blotting, lös proverna med SDS-PAGE och överför gelerna med ett kommersiellt torrblottningssystem med standardinställningar enligt tillverkarens protokoll.
- Ta bort fläckarna från bunten när överföringen är klar och inkubera varje fläck över natten vid 4 °C i en lämplig blockerande buffert innehållande 0,2% Tween 20 och antingen 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS-antikropp riktad mot His-taggen från Δ49ApoA1-protein.
OBS: De antikroppsutspädningar som används för blotting är 1:1 000 för MAb40 och 1:500–1 000 för MAbHIS-antikroppar. - Tvätta varje fläck 3 gånger i 5 minuter med PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).
- Inkubera blottorna i 1 timme i blockerande buffert innehållande sekundär antikropp konjugerad till en fluorofor (t.ex. IRDye) i en spädning på 1:10 000.
- Tvätta om fläckarna 3 gånger i 5 min med PBS-T. Använd en fluorescenskamera för att avbilda fläckarna efter den sista tvätten.
- Ta bort fläckarna från bunten när överföringen är klar och inkubera varje fläck över natten vid 4 °C i en lämplig blockerande buffert innehållande 0,2% Tween 20 och antingen 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS-antikropp riktad mot His-taggen från Δ49ApoA1-protein.
- För punktblottningar, tappa 3 μg renad MOMP-tNLP och töm tNLP med en punktfläckapparat. Blockera och utveckla fläckarna med samma metoder som beskrivs ovan för western blotting.
8. Bedömning av endotoxin
- Kvantifiera endotoxinnivåer med hjälp av ett endotoxintestsystem baserat på Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -analysen. Bered endotoxinfri 25 mM Tris, pH 7,4, provbuffert med 1 M Trishydrokloridlösning och endotoxinfritt vatten.
Anmärkning: Vanligtvis måste proverna spädas med denna provbuffert och utspädningarna justeras för att hitta lämpligt intervall för enskilda prover. Här späds MOMP-tNLP-prover 500 gånger i provbuffert och 25 μL laddas i varje brunn i en enhetskassett med 0,05 EU / ml känslighet. De endotoxinnivåer av MOMP-tNLP och tomt tNLP som används i de musstudier som beskrivs nedan är mellan 0,4 och 12 EU/μg-protein beroende på provet.
9. Frystorkning
- Frystorka och förvara MOMP-tNLP nanopartiklarna för långvarig (upp till år) användning vid -20 °C. För att förbereda tNLP- och MOMP-tNLP-suspensioner för lyofilisering, tillsätt trehalos som skyddsmedel under frysnings- och lyofiliseringsprocessen.
OBS: Denna process har validerats i stor utsträckning för en mängd olika tNLP-formuleringar 7,8. - Dela den aktuella volymen av MOMP-tNLP-lösningen med 9 för att erhålla volymen 1 M trehalos i sterilt, endotoxinfritt, avjoniserat vatten som krävs för att nå en slutlig koncentration av 0,1 M trehalos. Anteckna den slutliga volymen och alikvoten i endotoxinfria 15 ml eller 50 ml polypropenrör efter önskemål.
- Frys den blandade lösningen på torris och frysa den över natten med en lyofilisator. Förvara de torkade beredningarna vid -20 °C tills det behövs.
- Rekonstituera frystorkade tNLP med endotoxinfritt vatten. Rulla försiktigt tills den frystorkade kakan är helt upplöst och rehydratiserad. För att avlägsna trehalos, dialysera lösningen mot PBS med ett dialysmembran på 3,5 kD.
10. Adjuvans tillsats
OBS: Dessa och andra liknande NLP-baserade subenhetsvaccinformuleringar kan lätt införliva lipofila adjuvans såsom CpG-ODN1826 och FSL-1. CpG-ODN1826 är en modifierad klass B CpG-oligonukleotid (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') med en full fosforotiatryggrad med en 5'kolesteroldel (5'-chol-C6). Konjugeringen av CpG-ODN1826 till tNLP medieras av de hydrofoba interaktionerna mellan kolesteroldelen och fosfolipiddubbelskiktet i tNLP och har visats och karakteriserats väl, som tidigare rapporterats 9,10.
- Före införlivande i dessa formuleringar, rena den kolesterolmodifierade CpG genom omvänd faskromatografi för att avlägsna förorenande endotoxin såväl som eventuella omodifierade CpG-molekyler.
- Efter mottagande från säljaren, rehydrera det frystorkade CpG-materialet i endotoxinfritt vatten och rena det på en preparativ C4 RP-HPLC-kolonn med en separationsgradient bestående av 10 mM trietylammoniumacetat (TEAA) (mobil fas A) och acetonitril (mobil fas B).
Ytterligare detaljer finns i tabell 2. - Slå samman och frysa fraktionerna innehållande kolesterolmodifierad CpG. För att säkerställa fullständigt avlägsnande av kvarvarande TEAA, rekonstituera CpG med 15 ml endotoxinfritt vatten och frysa det tre gånger.
- Efter den slutliga frystorkningen, rekonstituera CpG i endotoxinfritt vatten (>20 mg/ml slutlig CpG-koncentration), alikvot och förvara den vid -80 °C tills det behövs. För tillsats till formuleringar, späd CpG till en koncentration av 1-2,5 mg / ml.
FSL-1 finns som ett frystorkat pulver av vaccinkvalitet. Detta bereds med sterilt och endotoxinfritt vatten i en koncentration av 1 mg/ml. Vaccinet administreras intramuskulärt (i.m.) och varje dos innehåller 10 μg MOMP i en total volym på 50 μl.
- Efter mottagande från säljaren, rehydrera det frystorkade CpG-materialet i endotoxinfritt vatten och rena det på en preparativ C4 RP-HPLC-kolonn med en separationsgradient bestående av 10 mM trietylammoniumacetat (TEAA) (mobil fas A) och acetonitril (mobil fas B).
- För att uppnå önskad formuleringsdos, dialysera nanopartiklarna till PBS och koncentrera dem med hjälp av en centrifugalvakuumkoncentrator före adjuvanstillsats. Var försiktig när du gör detta för att förhindra fullständig torkning av provet - kontrollera provvolymen var 20–30: e minut under centrifugeringen.
- Tillsätt adjuvansen under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp. För att bedöma framgångsrik inkorporering, analysera de slutliga formuleringarna och deras komponenter genom analytisk storleksuteslutningskromatografi (SEC).
OBS: För dessa preparat användes en SEC-kolonn i PBS-buffert (0,5 ml / m i flödeshastighet) och eluering detekterades med hjälp av en UV-vis-diodmatrisdetektor. Inkorporeringen bedömdes genom att jämföra absorptionen av de adjuvanterade partiklarna med absorptionen av de oadjuvanterade partiklarna vid 214 och 280 nm. - Förvara den adjuvanterade MOMP-tNLP och tomma tNLP vid 4 °C före användning av djur under en period på upp till 14 dagar. För att fullt ut bedöma stabiliteten hos en ny tNLP-formulering, analysera regelbundet de lagrade tNLP: erna av SEC.
OBS: Stabiliteten varierar från formulering till formulering.
11. Serumprov
- Skaffa kvinnliga 3 veckor gamla möss (BALB / c, n = 6).
- Vaccinera mössen intramuskulärt (i.m.) i varje bakben med 10 μg MOMP i form av MOMP-tNLP adjuvanterat med 5 μg CpG och 1 μg FSL-1 (total volym per injektion = 50 ml).
- Efter vaccination, observera mössen tills de kan behålla sternal liggande.
- Fyra veckor efter den första vaccinationen (prime), vaccinera djuren en andra gång (boost) med 10 μg MOMP i form av MOMP-tNLP adjuvanterat med 5 μg CpG och 1 μg FSL-1 (total volym per injektion = 50 ml).
- På dag 56 efter den första vaccinationen, samla blod för att bedöma antikroppstitrar. Börja med att bedöva mössen genom att injicera i.p. en lösning av xylazin (0,3 mg/20 g kroppsvikt) och ketamin (3,0 mg/20 g kroppsvikt). Nyp ihop fram- och bakbenen för att se till att inga ryck uppstår. Applicera vaselin runt ögonen för att förhindra ögontorrhet under anestesi.
- Använd ett mikrohematokritkapillärrör, punktera retro-orbital plexus. Samla 100 ml blod i ett mikrocentrifugrör.
- Efter blodinsamling, observera mössen tills de återhämtar sig från anestesi och kan upprätthålla sternal liggande.
- Låt blodet koagulera i rumstemperatur i 30 minuter och snurra sedan ner vid 2 000 × g i 10 minuter. Samla upp serumet och frys vid -80 °C.
- Utmana nu djuren med Chlamydia muridarum eller avliva dem. Avliva mössen genom att först injicera i.p. en lösning av xylazin (0,3 mg/20 g kroppsvikt) och ketamin (3,0 mg/20 g kroppsvikt) följt av cervikal dislokation.
- Testa serumantikroppar som är specifika för MOMP med västerländska blottingtekniker enligt beskrivningen ovan. Poolmusserum från alla immuniserade möss och använd det poolade serumet i stället för en primär antikropp vid spädning 1:5 000.
Representative Results
SDS-PAGE-profilen för Ni-affinitetsrening av MOMP-tNLP från en 1 ml cellfri reaktion visas i figur 1B. Reaktionen resulterade i höga uttrycksnivåer för både MOMP- och Δ49ApoA1-proteinet. Tidigare resultat visade att det cellfria uttrycket av Δ49ApoA1 i närvaro av DMPC och telodendrimer resulterade i bildandet av telodendrimer nanolipoproteinpartiklar (tNLP)4. Samelueringen av MOMP med Δ49ApoA1 indikerade att MOMP är associerad med tNLP, eftersom His-taggen endast finns på tNLP-ställningen Δ49ApoA1 och inte på MOMP. MOMP är ett mycket olösligt protein som endast kan elueras genom komplexbildning med tNLP, vilket har visat sig underlätta lösligheten av membranproteiner.
Elutionsfraktionerna innehållande MOMP-tNLP poolades och den totala proteinkoncentrationen bestämdes med hjälp av en fluorescensbaserad kvantifieringsanordning eller en anordning som mäter koncentrationen genom absorbans vid 280 nm, enligt tillverkarens anvisningar för proteinkvantifiering. För att möjliggöra exakt dosering av MOMP-vaccinet är det också viktigt att bestämma koncentrationen av MOMP i de renade komplexen. Vi utvecklade en metod för att kvantifiera MOMP baserat på geldensitometri (Figur 2) där en renad rekombinant MOMP med känd koncentration användes som standard. Genom att fastställa standardkurvan och jämföra den med MOMP-tNLP-provet kan MOMP-koncentrationen kvantifieras exakt. Bestämningen av MOMP-koncentrationen i det renade provet möjliggjorde uppskattning av utbytet av MOMP i cellfria reaktioner i olika skalor, vilket är viktigt för planeringen av den reaktionsuppställning som är lämplig för nedströmsstudier (tabell 3).
MOMP måste bilda oligomerer för att framkalla ett robust immunsvar11. För att testa MOMP:s oligomera tillstånd analyserades MOMP-tNLP i närvaro och frånvaro av både värme och reduktionsmedlet ditiotreitol (DTT, 50 mM, figur 3A). Högre ordningens oligomerer av MOMP identifierades genom SDS-PAGE när prover inte behandlades med värme och DTT. Som jämförelse visade prover behandlade med värme i närvaro av DTT främst två distinkta band på gelen, motsvarande MOMP och Δ49ApoA1 (cirka 40 kDa respektive 22 kDa). Dessa resultat liknar det gelbandmönster som tillskrivs oligomerbildning av MOMP, vilket är avgörande för dess effektivitet.
Ytterligare western blot-analys med MAb40, en antikropp mot den linjära epitopen på den variabla domänen av MOMP-protein, visade ett liknande bandmönster, vilket bekräftade oligomerbildningen av MOMP-protein i dess icke-denaturerade tillstånd (figur 3B). En viktig faktor som påverkar MOMP-oligomerbildningen är förhållandet mellan MOMP-plasmiden och Δ49ApoA1-plasmiden under den cellfria reaktionsinställningen. Tabell 4 listar förhållandet mellan plasmider och den resulterande insättningshastigheten för MOMP i tNLP. Tidigare studier indikerade att klamydial MOMP och andra yttre membranproteiner kan existera främst som trimerer12. För att maximera trimerbildningen i den cellfria reaktionen är det önskvärt att ha insättningshastigheten nära tre MOMP-proteiner per NLP, vilket motsvarar ett ~ 25: 1 MOMP-till-Δ49ApoA1-plasmidförhållande.
En dot blot-analys användes som en mer strömlinjeformad metod för att detektera närvaron av MOMP och tNLP. MAb40-antikroppen användes för att detektera total MOMP. MAbHIS-antikroppen riktad mot His-taggen på Δ49ApoA1-ställningen i tNLP användes för att bedöma förekomsten av tNLP. Samsignaleringen av MAb40- och MAbHIS-antikroppar indikerade MOMP-tNLP-bildning. Kontrollreaktionen gav tom tNLP, som endast visade en positiv signal från MAbHIS (figur 3C). För att testa immunogeniciteten hos MOMP-tNLP som produceras i den cellfria reaktionen adjuvanserade vi MOMP-tNLP med CpG + FSL-1 och injicerade intramuskulärt (i.m.) i möss i en prime-boost-regim som beskrivits ovan. Sera samlades in från de immuniserade mössen och MOMP-specifik IgG-antikropp mättes med hjälp av en western blot-analys (figur 4). Serumen från möss injicerade med adjuvanterad MOMP-tNLP visade stark MOMP-bindning, vilket indikerar att MOMP-tNLP kan framkalla ett immunsvar in vivo.
Figur 1: Uttryck och rening av MOMP-tNLP. (A) Bild av rör som innehåller små alikvoter av en cellfri reaktion som framgångsrikt uttryckt GFP-kontroller som lyser under UV-ljuskälla (höger) jämfört med lysat utan GFP-plasmid (vänster). (B) Proteingel färgad med SYPRO Ruby efter SDS-PAGE visar reningsprofilen för MOMP-tNLP. MOMP migrerar vid 40 kDa och 49ApoA1 migrerar vid 22 kDa. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-komplex; GFP = grön fluorescerande proteinkodande plasmid; MW = Markör för molekylvikt. T = totalt cellfritt lysat, FT = genomströmning, R1-R3 = alikvoter för cellfri reaktion, W1, W6 = tvättar 1 och 6; E1-E7 = Elutioner 1 till 7; Δ49ApoA1 = Hans-taggad mus ApoA1-derivat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantifiering av MOMP i MOMP-tNLP-prover . a) SDS-PAGE gel färgad med SYPRO Ruby för kvantifiering av MOMP. Rekombinant MOMP med känd koncentration laddades på gelen för att erhålla standardkurvan. Varje bana innehöll 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg och 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-prover som kvantifierades laddades på samma gel. (B) MOMP-koncentrationsstandardkurvan genererades med hjälp av densitometri. En ekvation som relaterar normaliserad banddensitet och mängden MOMP fastställdes. Ekvationen användes för att beräkna MOMP-innehållet i de okända proverna. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-komplex; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellfritt producerad MOMP-tNLP tillåter MOMP att bilda högre ordningsstrukturer. (A) SDS-PAGE gel av MOMP-tNLP med och utan behandling av värme och reduktionsmedel DTT, färgad med SYPRO Ruby. Med värme och DTT uppträdde MOMP främst som ett monomerband vid ~ 40 kDa, eftersom värme och reduktionsmedlet bröt ner majoriteten av MOMP-strukturen av högre ordning. I frånvaro av värme och DTT var de högre ordningens band närvarande, vilket indikerar MOMP-oligomerkonformation. (B) Western blot av MOMP-tNLP och MOMP ensam, obehandlad och behandlad med värme och DTT. Efter överföring undersöktes membranet med MAb40 (1:1 000 spädning). Ett bandmönster liknande SYPRO Ruby-färgad gel observerades, vilket bekräftade att de högre molekylviktbanden verkligen var MOMP-oligomerer. (C) Dot blot av MOMP-tNLP och tomma tNLP-prover (i duplikat) sonerade med MAb40 och MAbHIS. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-komplex; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; DTT = ditiotreitol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cellfritt producerad MOMP-tNLP är mycket immunogen. Serum från immuniserade möss visade stark anti-MOMP IgG-signal. MOMP-tNLP adjuvanterat med CpG + FSL-1 användes för att immunisera möss. Sera från sex immuniserade möss samlades in, poolades och användes för att undersöka MOMP-tNLP. Serumet kunde binda till MOMP i en western blotting-analys och visade stark IgG-signal (vänster). Den västra blotet som använde MAb40 som primär antikropp (höger) visade liknande band, vilket indikerar att serumet innehöll MOMP-specifikt IgG. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-komplex; CpG = kolesterolmodifierat CpG-adjuvans; FSL-1 = lipofilt adjuvans. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Buffertens namn | NaH2PO4 | NaCl | Imidazol | pH |
| Bindande buffert | 50 mM | 300 mM | 10 mM | 8.0 |
| Tvätta buffert | 50 mM | 300 mM | 20 mM | 8.0 |
| Elueringsbuffert 1 | 50 mM | 300 mM | 250 mM | 8.0 |
| Elueringsbuffert 2 | 50 mM | 300 mM | 500 mM | 8.0 |
Tabell 1: Förteckning över buffertar som behövs för rening av nickelaffinitet med uppgifter om koncentrationer av varje komponent och pH.
| Runtime | 50 minuter |
| Flöde | 6,0 ml/min |
| Typ av övertoning | Binär |
| Buffert A | 10 mM TEAA i H20 |
| Buffert B | MeCN |
| Gradient | % buffert B |
| 0 minuter | 25% |
| 30 minuter | 60% |
| 30.5 minuter | 100% |
| 40 minuter | 100% |
| 40,5 minuter | 25% |
| 50 minuter | 25% |
Tabell 2: Villkor för HPLC-rening med omvänd fas av kolesterolmodifierad CpG. Förkortningar: TEAA = trietylammoniumacetat; MeCN = acetonitril.
| Cellfritt lysat (ml) | DMPC-lipid (mg) | Telodendrimer (mg) | MOMP-plasmid (μg) | Renat MOMP-utbyte (mg) |
| 1 | 4 | 0.4 | 15 | 0.5 |
| 2 | 8 | 0.8 | 30 | 1.1 |
| 3 | 12 | 1.2 | 45 | 1.6 |
| 5 | 20 | 2 | 75 | 2.7 |
Tabell 3: Mängden lipider, telodendrimer och plasmider som används för cellfria reaktioner i olika skala och motsvarande utbyten. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin.
| Förhållanden för plasmidingång, MOMP : Δ49ApoA1 | 1:1 | 5:1 | 10:1 | 25:1 | 50:1 | 100:1 | |
| Förhållanden av mängden producerat protein, MOMP: Δ49ApoA1 | 0.02 | 0.32 | 0.64 | 3.46 | 6.55 | 20.04 | |
| Uppskattat antal MOMP-infogningar per tNLP | 0.03 | 0.37 | 0.75 | 4.04 | 7.65 | 23.39 | |
Tabell 4: Plasmidförhållandena i en cellfri reaktion och de resulterande MOMP-insättningshastigheterna. Förkortningar: MOMP = klamydialt större yttre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteinpartikel; Δ49ApoA1 = Hans-taggad mus ApoA1-derivat.
Discussion
Klamydia är den vanligaste sexuellt överförbara infektionen som drabbar både män och kvinnor. Även om vaccinforskning om klamydia sträcker sig över årtionden, har ett säkert och effektivt vaccin som kan skalas till massproduktion förblivit svårfångat13. Den klamydiala MOMP anses vara huvudkandidaten som ett skyddande vaccinantigen; MOMP är dock mycket hydrofob och benägen för felaktig vikning14,15. Ytterligare studier har visat att MOMP finns i oligomera tillstånd som är väsentliga för dess immunogenicitet11. Här beskrivs en validerad, cellfri samuttrycksmetod som producerar oligomera MOMP bildad inom tNLP-nanopartikel som ett vaccin, med utbyten av cirka 1,5 mg renad MOMP per 3 ml lysat. Detta fullständigt sammanställda förfarande kan skalas ytterligare för industriell produktion, vilket ökar dess utsikter som ett användbart tillvägagångssätt för att generera vacciner.
Vi har tidigare publicerat om att använda cellfritt uttryck för att producera membranproteiner inbäddade i NLP 3,16, samt uttryck i telodendrimerstabiliserade skivor. Denna senare teknik producerade emellertid membranproteinpartiklar med större heterogenitet och lägre löslighet. 4 Dessutom är immunogeniciteten hos MOMP-telodendrimerpartiklar oklar jämfört med MOMP-tNLP-partiklar6.
Denna procedur kan anpassas för att skala upp uttrycket av bakteriella membranproteiner som är lovande kandidater som antigener för användning i subenhetsvacciner. Inte bara producerar denna procedur solubiliserat bakteriellt membranprotein, men den övergripande nanopartikelstrukturen är mottaglig för ytterligare modifiering med användning av en mängd lipofila vaccinadjuvans inklusive, men inte begränsat till, CpG konjugerad till en kolesteroldel eller FSL-1. Uttryck av andra kandidatantigener från bakterier är genomförbart, även om parametrar som expressionstemperatur, lipidval och typ av expressionssystem kan behöva undersökas för att uppnå optimala utbyten.
Dessutom är plasmidval och förhållande avgörande i denna process. Båda plasmiderna som används bör konstrueras från samma ryggrad. Om insatserna är ungefär lika långa kan förhållandena baseras på massan av den tillsatta plasmiden, som beskrivs här. Kvotering baserad på mol ger dock mer reproducerbara resultat, särskilt vid skalning av reaktionerna. Förhållanden som fungerar bra i reaktioner på skärmskala (< 0,5 ml) kanske inte är tillämpliga på större reaktioner och kan kräva ytterligare optimering. Icke-membranproteiner kan fortfarande uttryckas med cellfria kit men kanske inte kräver lipidnanopartikeln (samuttryck) för att producera en löslig produkt. Dessutom, medan detta protokoll beskriver adjuvant med CpG och FSL-1, är detta system mottagligt för formulering med andra lipofila adjuvans eller blandning med lösliga adjuvans efter önskemål.
Det är viktigt att undvika kontaminering när du ställer in den cellfria uttrycksreaktionen eftersom detta kan påverka avkastningen. Eventuella tillsatser till reaktionen, inklusive plasmiderna själva, bör vara mycket rena. Dessutom bör de uttryckta proteinerna endast vara i kontakt med material och lösningar som är fria från endotoxinkontaminering. Endotoxinkontaminering i kandidatformuleringar kan leda till inkonsekventa och falska resultat av immunologiska analyser och kan vara skadliga i tillräckliga mängder. Även om det inte beskrivs här kan ytterligare rening efter nickelaffinitetskromatografi vara nödvändig om många föroreningar observeras i efterföljande analyssteg, t.ex. genom SDS-PAGE. Detta kan åstadkommas med SEC, även om förhållandena kan kräva optimering på formuleringsbasis.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kan ha tyckts påverka det arbete som rapporteras i denna uppsats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Public Health Service grant R21 AI20925 och U19 AI144184 från National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Detta arbete utfördes under överinseende av U.S. Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory enligt kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
| 1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
| 1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
| Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
| C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
| cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
| CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
| Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
| Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
| Electrophoresis Power Supply | |||
| Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
| Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
| Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
| HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
| HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
| HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
| iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
| iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
| Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
| Microcentrifuge | |||
| Microwave oven | |||
| NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
| Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Orbital Shaker | |||
| PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
| PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
| pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
| Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
| Probe sonicator | |||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
| Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
| Rainin Pipettes | Rainin | ||
| Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
| Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
| Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
| Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
| SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
| UV light source | |||
| Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
| Vortexer | |||
| VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
| VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
| XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Coleman, M. A., et al. Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles. PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- He, W., et al. Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry. Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).
- He, W., et al. Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).
- Tifrea, D. F., et al. Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles. Vaccines. 9 (7), 755 (2021).
- Cleveland, T. E., et al. Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles. Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).
- Fischer, N. O., et al. Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).
- Fischer, N. O., et al. Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).
- Fischer, N. O., et al. Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).
- Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria. Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).
- Sun, G., et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).
- Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection. Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).
- Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein. BMC Microbiology. 5, 5 (2005).
- Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein. Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).
- He, W., et al. Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases. Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).
