Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الببتيدات المناعية: عزل الفأر والببتيدات البشرية المرتبطة بالفئران MHC من الفئتين الأولى والثانية لتحليل الطيف الكتلي

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63052
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية مجمعات الببتيد من الفئة الأولى والثانية من MHC من خطوط الفئران والخلايا البشرية التي توفر بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميكا المناعية. ويركز البروتوكول على تحضير العينات باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.

Abstract

Immunopeptidomics هو مجال ناشئ يغذي ويوجه تطوير اللقاحات والعلاجات المناعية. وبشكل أكثر تحديدا ، يشير إلى علم التحقيق في تكوين الببتيدات التي تقدمها جزيئات مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى والفئة الثانية باستخدام منصات تكنولوجيا قياس الطيف الكتلي (MS). من بين جميع الخطوات في سير عمل علم المناعة المناعي القائم على مرض التصلب العصبي المتعدد، يعد إعداد العينات أمرا بالغ الأهمية لالتقاط بيانات عالية الجودة ذات صلة علاجية. هنا ، يتم وصف التعليمات خطوة بخطوة لعزل الببتيدات المرتبطة بالفئة الأولى والثانية من MHC عن طريق تنقية الالتقاء المناعي من عينات مراقبة الجودة ، من الماوس (EL4 و A20) ، وخطوط الخلايا البشرية (JY) بشكل أكثر تحديدا. يتم وصف الكواشف المختلفة والأجسام المضادة المحددة بدقة لعزل الببتيدات المرتبطة ب MHC من خطوط الخلايا هذه ، بما في ذلك خطوات التحقق من كفاءة ربط الخرز للجسم المضاد وكفاءة إزالة مجمعات الببتيد MHC من الخرز. ويمكن استخدام البروتوكول لإنشاء سير عمل في مجال الببتيدوميكا المناعية وتوحيده، فضلا عن قياس البروتوكولات الجديدة. وعلاوة على ذلك، يمثل البروتوكول نقطة انطلاق كبيرة لأي شخص من غير الخبراء بالإضافة إلى تعزيز قابلية الاستنساخ داخل المختبرات وفيما بينها لإجراء تحضير العينات في علم المناعة.

Introduction

على مدى العقد الماضي ، تجاوز الاهتمام بالتحقيق في ذخيرة الببتيدات المرتبطة ب MHC القطاع الأكاديمي ووصل إلى التكنولوجيا الحيوية والصناعات الصيدلانية. في الواقع ، في السرطان ، يمثل اكتشاف المستضدات الجديدة القابلة للتنفيذ الخاصة بالورم تركيزا بحثيا رئيسيا في القطاع الصناعي لتطوير علاجات مناعية سريرية تؤدي إلى علم الأورام الشخصي 1،2،3. في الأساس ، يتم تقديم الببتيدات المرتبطة ب MHC في جميع أنحاء الجسم بأكمله ، وتعكس المرحلة داخل الخلايا من الخلية ، وهي مهمة في مختلف الحالات المرضية مثل المناعة الذاتية ، والزرع ، والأمراض المعدية ، والالتهابات ، والسرطان ، والحساسية1,4. وبالتالي ، فإن الببتيدات المرتبطة ب MHC ، أو روابط مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) في البشر ، ذات أهمية طبية كبيرة ويشار إليها مجتمعة باسم immunopeptidome5.

التصلب المتعدد هو نهج تحليلي قوي لتوصيف الببتيدوم المناعي6,7، بما في ذلك اكتشاف المستضدات الجديدة الخاصة بالورم8,9,10,11. يتضمن سير العمل النموذجي لإجراء تجربة الببتيدوميك المناعي ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد عينة لعزل الببتيدات المرتبطة ب MHC ، 2) الحصول على البيانات بواسطة MS ، و 3) تحليل البيانات باستخدام أدوات برمجية حسابية مختلفة12. يعد توليد عينات عالية الجودة موصوفة في هذا البروتوكول المرئي أمرا بالغ الأهمية لنجاح أي مشروع في علم المناعة المناعي القائم على التصلب المتعدد. يركز البروتوكول الموصوف أدناه على عزل الببتيدات المرتبطة بالفئة الأولى والثانية من MHC عن خطوط الخلايا الراسخة المناسبة لتوليد بيانات مناعية عالية الجودة. تظهر النتائج التمثيلية من خطوط الخلايا هذه في البروتوكول الحالي.

Protocol

تم تكييف البروتوكول المقدم هنا من البروتوكولات المعمول بها13،14،15،16،17،18،19،20. ويوضح الشكل 1 الإجراء العام لتنقية الارتقاء المناعي (IP) للببتيدات من الفئتين الأولى والثانية من MHC. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول خطوط الخلايا والأجسام المضادة المستخدمة.

1. اقتران الخرز بالأجسام المضادة (اليوم الأول): اقتران الأجسام المضادة بالخرز المنشط ب sepharose CNBr

ملاحظة: قم بإعداد حلول جديدة لكل تجربة جديدة. ارجع إلى جدول المواد والجدول التكميلي 1 للاطلاع على قائمة وصفات الكواشف والمحاليل. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة (RT). عند استخدام جسم مضاد جديد ، تحقق من كفاءة الربط عن طريق جمع الاقتباسات الرئيسية (انظر المؤشر اختياري) وإجراء تلطيخ Coomassie الأزرق SDS-PAGE (الشكل 2).

  1. تفعيل حبات سيفاروز CNBr
    1. تزن 80 ملغ من الخرز المنشط ب sepharose CNBr لكل عينة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. لتسهيل إعادة تعليق الخرز المجفف ، أولا ، أضف 5 مل من 1 ملليمتر HCl وماصة لأعلى ولأسفل 5 مرات. ثم ، املأ الأنبوب المخروطي ب 8.5 مل إضافي من 1 ملليمتر هيدروكلورايد.
    3. قم بالتدوير بسرعة 20 دورة في الدقيقة (دورات في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام جهاز دوار. جهاز الطرد المركزي الخرز في 200 × غرام لمدة 2 دقيقة في RT وإزالة supernatant عن طريق الطموح.
    4. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران إلى حبيبات الخرز وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 2.0 مل واحتفظ به جانبا للخطوة 1.2.2.
  2. اقتران الأجسام المضادة بالخرز المنشط CNBr
    1. قم بإعداد الجسم المضاد المختار لعزل الببتيدات من الفئة الأولى أو الثانية من MHC في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2.0 مل عن طريق إضافة 2 ملغ من الجسم المضاد (وفقا للتركيز المحدد من قبل الشركة المصنعة). أكمل الحجم إلى 1 مل باستخدام محلول الاقتران العازل للحصول على تركيز نهائي قدره 2 ملغم / مل.
    2. قم بطرد الخرز من الخطوة 1.1.4 عند 200 × g لمدة دقيقتين في RT ثم قم بإزالة supernatant عن طريق الطموح.
    3. أضف محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2.0 مل الذي يحتوي على الخرز المنشط.
    4. (اختياري) خذ أليكوت من 18 ميكرولتر (INPUT) ، أضف 6 ميكرولتر من 4x SDS-PAGE المخزن المؤقت ، وقم بالتجميد على الفور.
    5. قم بتدوير أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق من الخطوة 1.2.3 عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة باستخدام جهاز دوار. الطرد المركزي للخرز في 200 × غرام لمدة 2 دقيقة ثم إزالة supernatant.
    6. (اختياري) خذ أليكوت من 18 ميكرولتر من supernatant (الجسم المضاد غير المقيد) ، أضف 6 ميكرولتر من 4x SDS-PAGE العازل وتجميده على الفور.
  3. منع وغسل حبات الأجسام المضادة المقترنة
    1. أضف 1 مل من 0.2 M glycine إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الخرز المقترن بالأجسام المضادة من الخطوة 1.2.5. قم بالتدوير عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في RT باستخدام جهاز دوار.
    2. جهاز الطرد المركزي للخرز في 200 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة supernatant. أضف 1 مل من PBS (محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات).
    3. جهاز الطرد المركزي للخرز في 200 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة supernatant.
    4. (اختياري) خذ أليكوت من 18 ميكرولتر من supernatant (الجسم المضاد غير المقيد ، الغسيل الأخير) ، أضف 6 ميكرولتر من 4x SDS-PAGE buffer وقم بتجميده على الفور.
    5. أضف 1 مل من PBS إلى الخرز في الخطوة 1.3.3.
    6. (اختياري) خذ أليكوت من 18 ميكرولتر من خليط الخرز (الخرز المقترن بالأجسام المضادة) ، أضف 6 ميكرولتر من 4x SDS-PAGE المخزن المؤقت ، وقم بتجميده على الفور.
    7. يحفظ عند 4 درجات مئوية حتى يستخدم في نفس اليوم في الخطوة 2.5.
      ملاحظة: يمكن تحضير الخرز في اليوم السابق لالتقاط المناعة، ولكن لم يتم اختبار التخزين الأطول.

2. تحلل الخلايا والتقاط المناعة مع حبات الأجسام المضادة المقترنة (اليوم 1)

ملاحظة: يختلف مستوى جزيئات MHC من نوع خلية إلى آخر، ويقترح التحديد الكمي لجزيئات MHC/HLA لكل خلية21 (الشكل 4A). نوصي بحد أدنى 1 × 108 خلايا لكل عنوان IP. يتوافق هذا العدد من الخلايا مع 6-10 ملغ من البروتين من خلايا JY و EL4 و A20 القابلة للذوبان مع 0.5٪ من المخزن المؤقت Chaps. لإعداد كريات الخلايا لعناوين IP ، يجب حصاد الخلايا وطردها مركزيا وغسلها مرتين باستخدام 5 مل من PBS. بعد ذلك ، يمكن تخزين كريات الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل أو أنبوب مخروطي سعة 15 مل عند -80 درجة مئوية حتى وقت IP. لاحظ أنه يمكن إجراء عناوين IP على كريات الخلايا الطازجة المحصودة أو المجمدة.

  1. لعزل الببتيدات من الفئة الأولى أو الثانية من MHC ، قم بإذابة حبيبات مجمدة من خلايا 1 × 108 عن طريق تسخين قاع الأنبوب براحة اليد. أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى الكريات وماصة لأعلى ولأسفل حتى يصبح التعليق متجانسا.
    ملاحظة: اعتمادا على نوع الخلية، يمكن أن يختلف حجم حبيبات الخلية اختلافا كبيرا. إذا لم يكن 500 ميكرولتر من PBS كافيا لإذابة حبيبات الخلية ، فاستخدم المزيد من PBS حتى تتحلل الخلايا بسهولة أثناء السحب لأعلى ولأسفل.
  2. قم بقياس الحجم الإجمالي للحبيبات المعاد تعليقها في PBS ونقلها إلى أنبوب جديد 2 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيق. تنقسم إلى المزيد من الأنابيب إذا لزم الأمر.
  3. أضف حجما من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا (1٪ من المخزن المؤقت للفصول في PBS يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني ، 1 بيليه / 10 مل من المخزن المؤقت) أي ما يعادل حجم حبيبات الخلايا المعاد تعليقها في PBS التي تم قياسها في الخطوة السابقة. التركيز النهائي للمخزن المؤقت للتحلل هو 0.5٪ Chaps.
  4. قم بالتدوير عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز دوار. جهاز الطرد المركزي تتحلل الخلية عند 18000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام الفرامل الكاملة ونقل المادة الفائقة (التي تحتوي على مجمعات الببتيدات MHC) في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2.0 مل.
  5. استرجع الخرز المقترن بالأجسام المضادة من الخطوة 1.3.7 عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين وقم بإزالة supernatant.
  6. انقل خلية التحلل الفائق في الخطوة 2.4 إلى الخرز المقترن بالأجسام المضادة واحتضنها مع الدوران (10 دورة في الدقيقة) لمدة 14-18 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز دوار.

3. استئصال الببتيدات MHC (اليوم 2)

ملاحظة: يسمح عمود البولي بروبلين بإزالة مجمعات الببتيد MHC مع الاحتفاظ بالخرز في العمود. من أجل تقييم نسبة مجمعات الببتيدات MHC المرتبطة بالخرز قبل وبعد الإزالة الحمضية مع 1٪ TFA (حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) ، من الممكن إجراء لطخة غربية مع أليكوتات مأخوذة في خطوات رئيسية خلال البروتوكول (انظر المؤشر اختياري). يكشف النشاف الغربي الموضح في الشكل 3 عن إثراء مجمعات الببتيد MHC بعد الاستئصال الحمضي بنسبة 1٪ TFA. يشير عدم وجود إشارة في هذا الكسر إلى أن خطوة الحذف لم تكن ناجحة. لاحظ أنه يمكن أيضا تقييم نسبة مجمعات الببتيدات MHC غير المرتبطة إلى الخرز بالتوازي عن طريق النشاف الغربي باستخدام أليكوت موصوف في الخطوة 3.1.6.

  1. إزالة مجمعات الببتيد MHC من حبات الأجسام المضادة المقترنة
    1. قم بإزالة الغطاء السفلي لعمود البولي بروبيلين ، وضع العمود على رف عمود البولي بروبيلين وقم بتثبيت حاوية فارغة أسفله لجمع التدفق من خلاله.
      ملاحظة: مطلوب عمود واحد لكل عينة.
    2. اشطف عمود البولي بروبيلين ب 10 مل من المخزن المؤقت A واتركه يستنزف عن طريق الجاذبية. إذا كانت سرعة تدفق السائل بطيئة للغاية ، فقم بقطع الطرف السفلي من عمود البولي بروبيلين.
    3. قم بقياس وجمع خليط الخرز المحلل (~ 2 مل) من الخطوة 2.5 ونقله إلى عمود البولي بروبيلين.
    4. (اختياري) خذ أليكوت من 20 ميكرولتر (أو 1/100 من الحجم الكلي) للنشاف الغربي وتجميده على الفور. يتوافق هذا الكسر مع إجمالي مجمعات الببتيدات MHC المحتضنة مع الخرز.
    5. دع الخليط السائل يزول عن طريق الجاذبية.
    6. (اختياري) جمع وقياس التدفق من خلال واتخاذ aliquot من 20 ميكرولتر (أو 1/100 من الحجم الكلي) للنشاف الغربي وتجميد على الفور. يمثل هذا الكسر مجمعات الببتيدات MHC المتبقية غير المرتبطة.
    7. لاستعادة خليط الخرز المحلل قدر الإمكان ، اشطف الأنبوب من الخطوة 3.1.3 مع 1 مل من المخزن المؤقت A وانقله إلى عمود البولي بروبيلين.
    8. اغسل الخرز المحتفظ به في عمود البولي بروبيلين بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت A. دع المخزن المؤقت للغسيل يزول عن طريق الجاذبية.
    9. كرر خطوة الغسيل مع 10 مل من المخزن المؤقت B و 10 مل من المخزن المؤقت A ثم 10 مل من المخزن المؤقت C.
    10. قم بإزالة عمود البولي بروبيلين من الحامل وضعه أعلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2.0 مل. أمسك العمود والأنبوب مع اليد.
    11. أضف 300 ميكرولتر من 1٪ TFA إلى عمود البولي بروبيلين واخلط الخرز عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات.
      ملاحظة: سيتم الاحتفاظ بالخرز في عمود البولي بروبيلين ، وسوف تتسرب الببتيدات المرتبطة ب MHC في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2.0 مل.
    12. انقل الإيلوات في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2.0 مل. كرر الخطوة 3.1.11 وقم بتجميع المعالين (يجب أن تتوافق الإيلوات التي تحتوي على مجمعات الببتيد MHC مع ما مجموعه 600 ميكرولتر وسيتم استخدامها في الخطوة 3.2.4).
    13. (اختياري) جمع aliquot من 6 ميكرولتر (أو 1/100 من الحجم الكلي) للنشاف الغربي وتجميد على الفور. يتوافق هذا الكسر مع مجمعات الببتيدات MHC التي تم استبعادها من الخرز.
  2. إزالة الملح وإزالة الببتيدات MHC
    ملاحظة: يمكن إزالة الملح وإزالة خطوات ببتيدات MHC عن طريق تثبيت العمود C18 على أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. للحصول على ملاءمة أفضل ، قم بتثبيت الصلبات التي توفرها الشركة المصنعة بين عمود C18 وأنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 2.0 مل. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام عمود C18 بسعة حجم 5-200 ميكرولتر (6-60 ميكروغرام). يتم تنفيذ جميع الخطوات في RT.
    1. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول أعلى العمود C18 ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1546 × جم لمدة 3 دقائق. تجاهل التدفق.
    2. أضف 200 ميكرولتر من 80٪ ACN (أسيتونيتريل) / 0.1٪ TFA أعلى العمود C18 ، ثم جهاز طرد مركزي عند 1546 × g لمدة 3 دقائق. تجاهل التدفق.
    3. أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA أعلى العمود C18 ، ثم جهاز طرد مركزي عند 1546 × g لمدة 3 دقائق. تجاهل التدفق.
    4. قم بتحميل 200 ميكرولتر من مجمعات الببتيد MHC من الخطوة 3.1.12 أعلى العمود C18. جهاز طرد مركزي عند 1546 × جم لمدة 3 دقائق وتخلص من التدفق.
    5. كرر الخطوة 3.2.4 مرتين حتى يتم تحميل وحدة التخزين الكاملة. لاحظ أنه يتم الاحتفاظ بببتيدات MHC في العمود C18.
    6. أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA إلى العمود C18 ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1546 × g لمدة 3 دقائق. تجاهل التدفق.
    7. انقل العمود C18 إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2.0 مل. الببتيدات Elute MHC من العمود C18 بإضافة 150 ميكرولتر من 28٪ ACN / 0.1٪ TFA.
    8. جهاز طرد مركزي عند 1546 × جم لمدة 3 دقائق.
    9. انقل التدفق في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل. احرص على عدم تجاهل التدفق ؛ أنه يحتوي على الببتيدات المعزولة MHC الفئة الأولى أو الثانية.
    10. كرر الخطوات 3.2.7-3.2.9 مرتين لحجم إجمالي قدره 450 ميكرولتر.
    11. قم بتجميد 450 ميكرولتر من الإيلوات (الببتيدات المنقى من الفئة الأولى أو الثانية من MHC) عند -20 درجة مئوية حتى يتم تحليل العينات بواسطة LC-MSMS.
    12. قبل تحليل LC-MS/MS، تتبخر الببتيدات المنقاة من الفئة الأولى أو الثانية من MHC من الخطوة 3.2.11 حتى تجف باستخدام مكثف فراغ مع إعدادات مسبقة تبلغ 45 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، ومستوى الفراغ: 100 mTorr ومنحدر فراغ: 5.
      ملاحظة: تبخر العينات المجمدة عالي الكفاءة. يمكن إعادة تجميد الببتيدات المجففة حتى التحليل.

4. تحديد الببتيدات MHC من الفئتين الأولى والثانية بواسطة LC-MS / MS

ملاحظة: قم بتحليل الببتيتوم المناعي MHC من الفئتين الأولى والثانية باستخدام مطياف كتلة Orbitrap عالي الأداء ومقياس الطيف الكتلي الرباعي عالي الدقة لوقت الطيران6. وترد المعلومات التالية كمؤشر فقط، مع مراعاة أن مختلف أجهزة قياس الطيف الكتلي الترادفي القائمة تعمل وفقا لمعايير تشغيلية مختلفة. وفيما يلي موجز موجز للخطوات:

  1. قم بإذابة العينات المجففة (من الخطوة 3.2.12) في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك (FA) بنسبة 4٪.
  2. قم بتحميل ثلاث حقن من 16 ميكرولتر لكل عينة ومنفصلة على عمود الطور المعكوس محلي الصنع (150-μm i.d. بطول 250 مم ، المشتري 3 ميكرومتر C18 300 Å) مع تدرج من 5٪ -30٪ ACN-0.1٪ FA ومعدل تدفق 600 nL / min على UHPLC نانو التدفق متصل ب MS.
  3. احصل على كل طيف MS كامل بدقة 120000 ، AGC من 4 × 105 مع الوضع التلقائي لوقت الحقن والأطياف باستخدام جنبا إلى جنب MS (MS-MS) على أيونات السلائف المشحونة المتعددة الأكثر وفرة بحد أقصى 3 s.
    ملاحظة: يتم إجراء تجارب Tandem-MS باستخدام التفكك التصادمي عالي الطاقة (HCD) عند طاقة تصادم تبلغ 30٪ ، ودقة 30000 ، و AGC تبلغ 1.5 × 105 ، ووقت حقن يبلغ 300 مللي ثانية.
  4. قم بمعالجة ملفات البيانات من الحقن / العينة الثلاثة باستخدام برنامج تحليل البروتينات LC-MS / MS (على سبيل المثال ، PEAKS X) باستخدام قواعد بيانات الماوس والبشرية (UniProtKB / Swiss-Prot (2019_09)).
  5. حدد "هضم الإنزيم غير المحدد" لمعلمة الإنزيم ، و 10 جزء في المليون و 0.01 Da للتسامح الكتلي على السلائف وأيونات الشظايا ، على التوالي.
    ملاحظة: التعديلات المتغيرة هي إزالة الألغام (NQ) والأكسدة (M). جميع معلمات البحث الأخرى هي القيم الافتراضية. تتم تصفية قوائم الببتيد النهائية باستخدام ALC بنسبة 80٪ وبمعدل اكتشاف خاطئ (FDR) يبلغ 1٪ باستخدام برنامج تحليل البروتينات LC-MS / MS.

5. تصور بيانات الببتيدوميكا المناعية

ملاحظة: يمكن تقييم جودة بيانات الببتيدوميكا المناعية الناتجة عن التصلب المتعدد بطرق متعددة، كما هو موضح مؤخرا22,23. لتصور البيانات وتقييم جودتها الشاملة وتكوينها وخصوصية MHC ، يمكن استخدام أداة برنامج MhcVizPipe (MVP).

  1. اتبع جميع الإرشادات والوثائق ذات الصلة لتثبيت برنامج MVP المتوفر على موقع Caron Lab GitHub على الويب24.
    ملاحظة: يوفر MVP عرضا سريعا وموحدا لجودة العينة وتكوينها وخصوصية MHC. يوازي MVP استخدام خوارزميات immunopeptidomics الراسخة (NetMHCpan25 و NetMHCIIpan26 و GibbsCluster27) ويولد تقارير منظمة وسهلة الفهم بتنسيق HTML (لغة ترميز النص التشعبي). التقارير محمولة بالكامل ويمكن عرضها على أي جهاز كمبيوتر باستخدام متصفح ويب حديث. راجع البيانات التكميلية 1-4 للحصول على أمثلة لتقارير HTML.

Representative Results

ويوضح الشكل 1 سير العمل العام لعزل مجمعات الببتيد MHC لتحليل الببتيدوم المناعي بواسطة التصلب المتعدد. تظهر النتائج التمثيلية للتحقق من كفاءة ربط الخرز للجسم المضاد (الشكل 2) (باستخدام الجسم المضاد Y3 المضاد ل H2Kb) وكفاءة إزالة مجمعات الببتيد MHC من الخرز (الشكل 3) (باستخدام الجسم المضاد W6/32 المضاد ل HLA-ABC). كما تم تطبيق مقايسات القياس الكمي القائمة على قياس التدفق الخلوي21 لقياس العدد المطلق لجزيئات MHC من الفئة الأولى لكل خلية EL4 (H2Kb و H2Db) وخلية JY (HLA-ABC)، كما هو موضح في الشكل 4A.

ويبين الشكل 4 باء - هاء إمكانية تكرار النتائج داخل الأفراد وفيما بينهم باستخدام البروتوكول الحالي. تظهر النتائج التمثيلية للببتيدات من الفئة الأولى من MHC المحددة من 1 × 108 خلايا EL4 و 1 × 108 خلايا JY. تم إنشاء النتائج من عضوين مختلفين في المختبر (المستخدم 1 والمستخدم 2). وبالنسبة للمستخدم 1، كان متوسط عدد الببتيدات الخاصة ب MHCI المكتشفة من خلايا EL4 و JY 1341 و 6361 على التوالي؛ للمستخدم 2 و1933 و7238 على التوالي (الشكل 4 باء ودال). يتراوح متوسط معامل التباين (CV) لعدد الببتيدات المكتشفة عبر ثلاث نسخ /تجارب بيولوجية مختلفة من 1.9٪ إلى 11٪ (الشكل 4B ، D). على الرغم من أن السير الذاتية لعدد الببتيدات المكتشفة عبر التجارب الثلاث المختلفة كانت صغيرة نسبيا ، إلا أن هوية الببتيدات اختلفت اختلافا كبيرا (الشكل 4C ، E). في الواقع، تظهر مخططات فين التمثيلية أن نسبة الببتيدات التي تم اكتشافها بشكل متكرر عبر ثلاث نسخ متماثلة بيولوجية تراوحت بين 39٪ (خلايا المستخدم 2، EL4) إلى 63٪ (خلايا المستخدم 1، JY) (الشكل 4C، E والجدول التكميلي 2).

تظهر الخرائط الحرارية التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج MVP قوة ربط MHC المتوقعة للببتيدات المحددة باستخدام أدوات مجموعة NetMHCpan25,26,28. يتم أيضا تنفيذ خيارين روتينيين ل GibbsCluster ، والتي يطلق عليها "GibbsCluster غير الخاضعة للإشراف" و "GibbsCluster الخاصة بالأليل" ، بواسطة MVP لاستخراج زخارف ربط الببتيد MHC. لاحظ أن MVP لديه قيود. هدفها الأساسي ليس استخراج الزخارف الخاصة بالأليل والتعليق على الببتيدات بطريقة دقيقة للغاية ولكن بدلا من ذلك توفير وجهة نظر عين الطائر حول الجودة العامة والتكوين وخصوصية MHC للعينات.

بالنسبة لببتيدات الفأر MHC من الفئة الأولى (H2Db و H2Kb) في خلايا EL4 (الشكل 5A ؛ الألواح العلوية والبيانات التكميلية 1) ، تظهر خريطة حرارية تمثيلية أن 89٪ من جميع الببتيدات المكتشفة 8-12-mer من المتوقع أن تكون روابط قوية (SB: NetMHCpan ٪ Rank <0.5) أو روابط ضعيفة (WB: NetMHCpan ٪ Rank <2) لجزيئات H2Db أو H2Kb. وتتفق مجموعات التسلسل المتولدة من الببتيدات 8-12-mer مع الشعارات المبلغ عنها ل H2Db (الأسباراجين في P5 والليوسين في P9) وH2Kb (الفينيل ألانين في P5 والليوسين في P8) (الشكل 5)29. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن ملاحظة زخارف ثالثة مهيمنة (الهيستيدين في P7 والليوسين في P9) بالإضافة إلى زخارف "فنية" إضافية باستخدام الجسم المضاد M1 (البيانات التكميلية 1). في الواقع ، من المعروف أن الجسم المضاد M1 يتفاعل مع جزيء Qa2 غير الكلاسيكي ، وبالتالي ، يتم اكتشاف الببتيدات المرتبطة ب Qa2 أيضا بواسطة MS (البيانات التكميلية 1). هنا ، من أجل البساطة ، يركز الشكل 5 على إظهار زخارف ربط الببتيد الراسخة لأليلين H2b الكلاسيكيين (أي H2Db أو H2Kb) المعبر عنهما في خلايا EL4.

بالنسبة للببتيدات البشرية من الفئة الأولى من HLA (HLA-ABC) في خلايا JY (الشكل 5A ؛ الألواح السفلية والبيانات التكميلية 2) ، تظهر خريطة حرارية تمثيلية أن 97٪ من جميع الببتيدات المكتشفة 8-12-mer من المتوقع أن تكون SB أو WB ل HLA-A * 0201 أو -B * 0702 أو -C * 0702. تم تجميع الببتيدات لتصور زخارف ربط الببتيد ل HLA-A * 0201 و -B * 0702. لا يظهر الشكل 5A زخارف الربط ل HLA-C*0702 لأن أليل C*0702 له مستوى تعبير منخفض نسبيا. لذلك تم عزل عدد قليل جدا من الببتيدات C * 0702 وتحديدها لتوليد شكل C * 0702 تمثيلي. لاحظ أنه يمكن تصور زخارف C*0702 في دراسات أخرى30,31,32 أو من موقع NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33.

بالنسبة لببتيدات HLA البشرية من الفئة الثانية (HLA-DR) في خلايا JY (الشكل 5B ؛ الألواح العلوية والبيانات التكميلية S3) ، تظهر خريطة حرارية تمثيلية أن 70٪ من جميع الببتيدات المكتشفة 9-22-mer من المتوقع أن تكون SB أو WB ل HLA-DRB1 * 0404 و -DRB1 * 1301. تظهر زخارف ربط الببتيد لهذين الأليلين (الشكل 5B). لاحظ أن الزخارف الملزمة للببتيد الموضحة هنا قد لا تكون متوافقة تماما مع الشعارات التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا ل HLA-DRB1 * 0404 و -DRB1 * 130134. يسلط هذا التناقض الضوء على عدم القدرة الحالية ل MVP / NetMHCpan على التعليق التوضيحي الدقيق للببتيدات إلى أليلات HLA من الفئة الثانية الأقل تميزا ، مثل HLA-DRB1 * 0404 و -DRB1 * 1301 المعبر عنها في خلايا JY. يمكن العثور على معلومات إضافية حول زخارف ربط الببتيد من الفئة الثانية في دراسات أخرى34,35 ومن موقع NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36.

وأخيرا، بالنسبة لببتيدات الفأر MHC من الفئة الثانية (H2-IAD و H2-IEd) في خلايا A20 (الشكل 5B؛ الألواح السفلية والبيانات التكميلية 4)، تظهر خريطة حرارية تمثيلية أن 87٪ من جميع الببتيدات 9-22-mer المكتشفة من المتوقع أن تكون SB أو WB ل H2-IAD أو H2-IED. تتوافق زخارف ربط الببتيد لهذين الأليلين مع الشعارات المبلغ عنها37.

تتوفر تقارير HTML الكاملة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج MVP لتقييم الجودة الشاملة وخصوصية MHC للعينات في البيانات التكميلية 1-4.

Figure 1
الشكل 1: مخطط الإجراء الكامل لعزل الببتيدات من الفئتين الأولى والثانية من MHC. (A-B) يتم تكوير 100 مليون خلية وتحللها بنسبة 0.5٪ من المخزن المؤقت Chaps. (ج) يتم طرد الخلية المحللة مركزيا ، ويضاف ال supernatant إلى حبات CNBr-sepharose مقترنة بالجسم المضاد المطلوب مسبقا و (D) تحضن 14-18 ساعة عند 4 درجات مئوية. (E) بعد التقاط المناعة ، يتم نقل الخرز إلى عمود من البولي بروبيلين وغسله ، ويتم التخلص من مجمعات الببتيد MHC بمحلول TFA بنسبة 1٪. (و) يتم تحلية الببتيدات وإزالة الببتيدات باستخدام عمود C18. (ز) بعد ذلك، يتم تجفيف الببتيدات بسرعة vac وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة الترادفي. (حاء) يمكن تقييم نوعية الببتيدات المعزولة من الفئتين الأولى والثانية من MHC استنادا إلى الأنواع الفرعية ل HLA باستخدام برنامج MhcVizPipe المتاح مجانا. الشكل الذي تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com (NT22ZL8QSL). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تلطيخ هلام Coomassie لتتبع كفاءة ربط الأجسام المضادة بالخرز المنشط ب sepharose CNBr. تم تحميل Aliquots ذات الأحجام المكافئة على 12٪ من جل SDS-PAGE متبوعا بتلطيخ Coomassie الأزرق: الخرز + الاقتران المسبق للأجسام المضادة (1) ، والأجسام المضادة غير المرتبطة بعد خطوة الاقتران (2) ، و supernatant بعد الغسيل الأخير بعد الاقتران (3) ، والخرز إلى جانب الأجسام المضادة (4). تتجلى كفاءة الربط في انخفاض كبير في شدة تلطيخ الإشارة للسلاسل الخفيفة والثقيلة من H2Kb عندما تكون الخرز مرتبطة تساهميا (Lane 4) بحبات CNBr مقارنة بالجسم المضاد قبل الاقتران (Lane 1). تمت إعادة طباعة الرقم وتكييفه من bioRxiv38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: النشاف الغربي لتتبع مجمعات الببتيد MHC بعد الاستئصال الحمضي من الخرز المنشط CNBr المقترن بالأجسام المضادة. تم تحميل الاقتباسات المأخوذة من الخطوات المشار إليها في البروتوكول (1/100 من إجمالي الحجم المقاس) على هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪ ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز: الخرز + الليزات بعد التقاط المناعة والغسيل الأخير (A) ؛ supernatant من الغسيل الأخير (B) ومجمعات الببتيد MHC التي تم التخلص منها من الخرز (C). أكدت إشارة الكشف القوية لمجمعات الببتيد MHC في (C) باستخدام الأجسام المضادة للسلسلة الثقيلة HLA-ABC (Abcam ، #ab 70328 ، 1: 5000) عزل مجمعات الببتيد MHC بعد الاستئصال الحمضي. لاحظ أنه من الممكن تقييم نسبة مجمعات الببتيد MHC التي لم يتم التقاطها بواسطة حبات الأجسام المضادة المقترنة عن طريق جمع التدفق من الخطوة 3.1.6. يمكن إضافة أليكوت إلى اللطخة الغربية (غير موضحة في هذا الجل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تحديد الببتيدات من الفئة الأولى MHC من خلايا JY و EL4. (أ) رسم بياني يبين العدد المطلق لجزيئات سطح الخلية H2Db و H2Kb لكل خلية EL4 وجزيئات HLA-ABC لكل خلية JY. تم إجراء القياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم الحصول على المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط من ثلاث نسخ متماثلة بيولوجية. (ب، د) رسم بياني يوضح متوسط العدد والانحراف المعياري لمتوسط الببتيدات من الفئة الأولى من MHC التي حددها مستخدمان مستقلان (USER_1 [U1] و USER_2 [U2]). يتم عرض متوسط العدد والانحراف المعياري لمتوسط الببتيدات MHC من الفئة الأولى المكتشفة من خلايا الماوس EL4 (B) وخلايا JY البشرية (D). يشار إلى معاملات التباين (CV) عبر ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة. (ج، ه) توضح مخططات فين عدد الببتيدات التي تم اكتشافها بشكل متكرر في خلايا EL4 (C) و JY (E) من قبل اثنين من المستخدمين المستقلين (U1 و U2) عبر ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة. تمت إعادة طباعة الشكل 4A وتكييفه من bioRxiv38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تصور بيانات الببتيدوميك المناعي باستخدام أداة برنامج MVP. تحليل بيانات الفئران والبشر (A) MHC الفئة الأولى و (B) الببتيدات MHC الفئة الثانية. يتم عرض الخرائط الحرارية للتقارب التمثيلي للتقارب (الألواح اليسرى) وزخارف ربط الببتيد (الألواح اليمنى). تمثل ألوان الخرائط الحرارية تقارب ربط MHC الذي تنبأ به NetMHCpan 4.1 (٪ rank). المجلدات القوية حمراء (٪ رتبة <0.5) ، والمجلدات الضعيفة زرقاء (٪ رتبة <2) وغير الموثقات صفراء (٪ رتبة >2). يشار إلى نسبة (٪) من الببتيدات 8-12mer (A) والببتيدات 9-22mer (B) التي هي SB أو WB بين قوسين. تم إنشاء زخارف ربط الببتيد بواسطة MVP باستخدام خيار "Gibbscluster الخاص بالأليل". تم الحصول على هذه النتائج التمثيلية من خلايا 1 × 108 وباستخدام الأجسام المضادة وخطوط الخلايا التالية: الأجسام المضادة M1 وخلايا EL4 للببتيدات من الفئة الأولى من MHC. W6/32 الأجسام المضادة وخلايا JY للببتيدات البشرية MHC الفئة الأولى ؛ الأجسام المضادة M5 وخلايا A20 لببتيدات الفأر MHC من الفئة الثانية ؛ L243 الأجسام المضادة وخلايا JY للببتيدات البشرية MHC الفئة الثانية. ارجع إلى البيانات التكميلية 1-4 للوصول إلى تقارير HTML الكاملة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج MVP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البيانات التكميلية 1-4: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

البيانات التكميلية 1: تقرير HTML تم إنشاؤه بواسطة برنامج MVP من الببتيدات التي تم عزلها من خلايا 1 × 108EL4 باستخدام الجسم المضاد M1. يتم عرض ثلاثة نسخ متماثلة بيولوجية. ويرتبط هذا التقرير بالشكل 4 والشكل 5 وترد الببتيدات التمثيلية في الجدول التكميلي 2.

البيانات التكميلية 2: تقرير HTML تم إنشاؤه بواسطة برنامج MVP من الببتيدات التي تم عزلها من خلايا 1 × 108JY باستخدام الجسم المضاد W6/32. يتم عرض ثلاثة نتوءات بيولوجية. ويرتبط هذا التقرير بالشكل 4 والشكل 5، وترد الببتيدات التمثيلية في الجدول التكميلي 2.

البيانات التكميلية 3: تقرير HTML تم إنشاؤه بواسطة برنامج MVP من الببتيدات التي تم عزلها من خلايا 1 × 108JY باستخدام الجسم المضاد L243. ويرتبط هذا التقرير بالشكل 5، وترد الببتيدات التمثيلية في الجدول التكميلي 2.

البيانات التكميلية 4: تقرير HTML تم إنشاؤه بواسطة برنامج MVP من الببتيدات التي تم عزلها من خلايا 1 × 108A20 باستخدام الجسم المضاد M5. ويرتبط هذا التقرير بالشكل 5، وترد الببتيدات التمثيلية في الجدول التكميلي 2.

الجدول التكميلي 1: قائمة المخازن المؤقتة. يتم وصف وصفات لجميع المخازن المؤقتة المستخدمة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: قوائم تمثيلية للببتيدات المرتبطة ب H2Db/Kb و HLA-ABC و HLA-DR و H2-IAD/IED. يحتوي هذا الجدول على قوائم الببتيدات التمثيلية MHC من الفئة الأولى والثانية المعزولة من خطوط خلايا الماوس EL4 و A20 ، على التوالي ، والفئة الأولى والثانية من HLA من خط خلايا JY البشري. تم إيداع هذه البيانات على ProteomeXchange (PXD028633). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

توافر البيانات:

تم إيداع مجموعات البيانات المستخدمة في هذه المخطوطة على ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussion

تم اختبار خطين من خلايا الفئران (EL4 و A20) ، وخط خلية بشرية واحد (JY) ، وخمسة أجسام مضادة متاحة تجاريا [M1 (anti-H2Db / Kb) ، و Y3 (anti-H2Kb) ، و M5 (anti-H2-IAd / IEd) ، و W6/32 (anti-HLA-ABC) ، و L243 (anti-HLA-DR)] والتحقق من صحتها في سياق هذا البروتوكول وتوفر بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميتات المناعية. تتوفر أجسام مضادة أخرى مضادة ل HLA (على سبيل المثال ، مضاد HLA-A2 BB7.2) ولكن لم يتم اختبارها هنا. لاحظ أن الجسم المضاد W6/32 يستخدم على نطاق واسع والجسم المضاد الأكثر رسوخا في هذا المجال. وهو يتيح عزل الببتيدات التي تقدمها جميع جزيئات HLA-ABC في البشر ، وقد أبلغت عنها سابقا مختبرات الخبراء للعمل من مصادر بيولوجية مختلفة مثل الأنسجة الطازجة أو المجمدة8,39 ، وخلايا الدم المحيطية أحادية النواة والخلية أحادية النواة لنخاع العظم40 ، والخزعات 41 ، و xenografts41,42 ، وتشريح الجثث43 وعينات البلازما44,45.

يعد إعداد حلول جديدة يتم استخدامها في جميع أنحاء البروتوكول أمرا بالغ الأهمية. وعلى وجه الخصوص، يعد استخدام المحاليل الحمضية الطازجة في الزجاجات أمرا بالغ الأهمية لتجنب التلوث اللاحق للعينات التي تم تحليلها بواسطة التصلب المتعدد. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم البروتوكول لأول مرة و / أو مع جسم مضاد جديد ، من المهم تقييم أن الجسم المضاد مقترن بالفعل بخرز CNBr Sepharose باستخدام هلام Coomassie الأزرق. خطوات غسل حبات الجسم المضاد المقترنة بعد الالتقاط المناعي لمجمعات الببتيد MHC أمر بالغ الأهمية أيضا لتجنب تلوث الببتيدات غير MHC. وأخيرا ، هناك حاجة إلى عناية خاصة لعدم التخلص من الإلتيز بعد إزالة مجمعات الببتيد MHC مع 1٪ TFA وإزالة الببتيدات من العمود C18 مع ACN28٪ / 0.1٪ FA.

تصف البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات خطوات إضافية لزيادة تنقية الببتيدات في نهاية إجراء العزل ، على سبيل المثال ، تجزئة الببتيد بطرق مختلفة14,46 أو الترشيح الفائق باستخدام مرشحات 10-30 kDa13,47. ولا يقدم البروتوكول الحالي تفاصيل عن تلك الخطوات الإضافية وهو كاف لتوفير بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميكا المناعية. ومع ذلك ، يمكن لغير الخبراء النظر في مثل هذه الخطوات لتعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة تحسين إجراء عزل الببتيد.

يمكن أيضا تعديل نوع الخرز ونوع المخزن المؤقت الحمضي الذي يستخدم لاستخلاص مجمعات MHC من الخرز لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها13,14,15,16,17,18,19. في هذا الصدد ، تعد حبات sepharose المنشطة CNBr بشكل عام نقطة انطلاق جيدة لأنها غير مكلفة نسبيا بالإضافة إلى إظهار المرونة من حيث الارتباط بأنواع مختلفة من الأجسام المضادة. في البروتوكول الحالي ، تبين أن الخرز المنشط ب sepharose CNBr يعمل بشكل جيد نسبيا باستخدام خمسة أجسام مضادة مختلفة متاحة تجاريا (أي M1 و Y3 و W6/32 و L243 و M5). إلى جانب الخرز المنشط ب sepharose CNBr ، من السهل أيضا التعامل مع حبات البروتين A أو G أو A / G sepharose 4 Fast Flow ، وعلى الرغم من أنها أكثر تكلفة نسبيا ، إلا أنها يمكن أن تولد نتائج مماثلة. عامل آخر يجب مراعاته هو تقارب الجسم المضاد للبروتين A أو G. علاوة على ذلك ، فإن الخرز المغناطيسي sepharose سهل الاستخدام ولكنه مكلف نسبيا. بغض النظر عن نوع الخرز الذي يختاره غير الخبراء ، يتم تشجيعه على جمع الاقتباسات في الخطوات الحاسمة من البروتوكول وإجراء المواد الهلامية SDS-PAGE الزرقاء الملطخة بالكوماسي لتتبع كفاءة ربط الجسم المضاد بالخرز ، كما هو موضح في الشكل 2.

يشير عامل مهم آخر يؤثر على نجاح عزل الببتيدات MHC إلى نوع المخزن المؤقت للاستخلاص الحمضي المستخدم لعزل مجمعات الببتيد MHC من الخرز. تم الإبلاغ عن مخازن مؤقتة مختلفة بما في ذلك 0.1٪ أو 1٪ أو 10٪ TFA و 0.2٪ FA و 10٪ حمض الخليك. 1٪ TFA كان المخزن المؤقت للإزالة يعمل لجميع الأجسام المضادة التي تم اختبارها. يمكن أيضا تتبع هذه الخطوة عن طريق النشاف الغربي ضد جزيئات MHC المستخدمة لالتقاط ببتيدات MHC ، كما هو موضح في الشكل 3.

جميع المخازن المؤقتة التي تحتوي على الأسيتونيتريل (ACN) و / أو حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) عدوانية ويمكن أن تؤدي إلى تلوث العينة بمواد جزيئية وبوليمرية صغيرة مثل الملدنات إذا كانت على اتصال بالبلاستيك. لتجنب مثل هذه المشكلات ، يتم إعداد جميع المحاليل التي تحتوي على مذيب عضوي و / أو TFA طازجة يوميا وتخزينها في زجاجة زجاجية حتى الاستخدام. يتم تنفيذ غالبية الخطوات في أنبوب بلاستيكي Protein LoBind. تم تصميم هذه الأنابيب خصيصا للبروتينات وهي مصنوعة من أعلى مستويات الجودة ، والبولي بروبيلين البكر الخالي من المبيدات الحيوية والملدنات واللاتكس. كما يتم إنتاجها باستخدام قوالب محسنة ومصقولة للغاية دون استخدام عوامل الانزلاق. من المهم مراعاة هذه الاحتياطات لتمكين توليد بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميكا المناعية.

الجسم المضاد هو قيد مهم لعزل الببتيدات المرتبطة ب MHC. يتيح الجسم المضاد W6/32 عزل الببتيدات التي تقدمها جميع جزيئات الفئة الأولى من HLA-ABC في البشر وهو الجسم المضاد الأكثر استخداما وراسخا في هذا المجال. إن كتابة HLA عالية الدقة لخطوط الخلايا البشرية غير المميزة أو العينات الحيوية ليست ضرورة عند تطبيق الجسم المضاد W6/32 ولكنها مع ذلك موصى بها لبعض التطبيقات لتسهيل تفسير البيانات48. يمكن أيضا العثور على معلومات كتابة HLA /MHC في الموارد العامة لخطوط الخلايا المتعددة ونماذج الماوس49. إلى جانب الجسم المضاد W6/32 ، فإن الأجسام المضادة الأربعة الأخرى (M1 و M5 و Y3 و L243) التي تم اختبارها والتحقق من صحتها في سياق هذا البروتوكول كلها متاحة تجاريا. من ناحية أخرى ، فإن العديد من الأجسام المضادة الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في دراسات سابقة ل immunopeptidomics لم يتم تبنيها إلى حد كبير من قبل المجتمع وهي غير متوفرة تجاريا أو متوفرة من خلال زراعة خطوط الخلايا الهجينة ، وهي مكلفة نسبيا.

هناك قيد مهم آخر لعزل الببتيدات المرتبطة ب MHC وهو كمية المواد الأولية المطلوبة. تتناسب الكمية المطلوبة عكسيا مع مستوى التعبير عن جزيئات MHC على سطح الخلية ، والتي يمكن قياسها كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 4A). الخلايا التي تظهر مستويات تعبير عالية من جزيئات MHC (على سبيل المثال ، الخلايا المتغصنة والخلايا المكونة للدم بشكل عام) تنتج عموما بيانات مناعية عالية الجودة. تستخدم مختبرات الخبراء من 50 مليون خلية 50 ، ولكن يوصى باستخدام 100 مليون إلى مليار خلية لغير الخبراء. كما تم الإبلاغ عن استخدام خزعة الأنسجة (<13 ملغ)41 و xenograft42,43 و تشريح الجثة44 و البلازما 45,46 عينة ولكنها لا تزال تشكل تحديا للمختبرات غير الخبيرة. أيضا ، فإن العدد الإجمالي للببتيدات المرتبطة ب MHC المتوقع موثق جيدا لخطوط الخلايا الراسخة (هنا ، بين ~ 2000 و ~ 10000 ببتيد اعتمادا على خط الخلية والأجسام المضادة المستخدمة) ، ولكن الكميات المطلقة من الببتيدات المقدمة بشكل طبيعي والتي يتم سحبها بكفاءة بواسطة هذه التقنية لا تزال موضع نقاش. في الواقع ، قدرت الدراسات السابقة أن كفاءة إجراء العزل تعتمد على الببتيد ويمكن أن تكون من 0.5٪ -2٪ 51. القيود الأخرى في علم المناعة هي قابلية تكرار الطرق وعدم قدرة أدوات مجموعة NetMHCpan على التعليق التوضيحي الصحيح على الببتيدات إلى أليلات MHC الأقل تميزا. وفي هذا الصدد، مواصلة تطوير وتطبيق أساليب اكتساب MS جديدة نسبيا ومستقلة عن البيانات7,32,52، فضلا عن تجميع الببتيد الجديد وخوارزميات التنبؤ بربط الببتيد MHC31,34,53,54 من المتوقع أن تحسن قابلية الاستنساخ ودقة التعليق التوضيحي للببتيد في الببتيدات المناعية. تواجه Immunopeptidomics قيودا أخرى فيما يتعلق باكتساب مرض التصلب العصبي المتعدد والتحليل الحسابي للببتيدات المرتبطة ب MHC ويتم تغطيتها في أماكن أخرى1,6,55.

إن عزل الببتيدات المرتبطة ب HLA-ABC من العينات البشرية باستخدام الجسم المضاد W6/32 راسخ ويطبق على نطاق واسع من قبل العديد من مجموعات البحث ، فإن عزل الببتيدات المرتبطة بالفئران MHC من الفئة الأولى والثانية أقل رسوخا نسبيا. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكولات قوية لعزل روابط MHC الماوس. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لعزل الببتيدات من الفئة الأولى من MHC والببتيدات من الفئة الثانية MHC من خطين من خلايا الماوس من أصل C57BL / 6 و BALB / c ، على التوالي. وعلى وجه التحديد، يتيح البروتوكول عزل الببتيدات المرتبطة بالفئة الأولى H2Kb وH2Db باستخدام الجسم المضاد M1، وكذلك الببتيدات المرتبطة بالفئة الثانية H2-IAD وH2-IEd باستخدام الجسم المضاد M5. وبالتالي، فإن نشر البروتوكول الحالي وتطبيقه ينبغي أن ييسر البحوث الأساسية والانتقالية في مجال الببتيدوميكا المناعية في مختلف نماذج الفئران.

ويمكن استخدام البروتوكول لإنشاء سير عمل في مجال الببتيدوميكا المناعية وتوحيده، فضلا عن قياس البروتوكولات الجديدة. على سبيل المثال ، يمكن تكييفه وتحسينه بشكل أكبر لإجراء فحص الببتيدوم المناعي في مصفوفات بيولوجية مختلفة تتراوح من الدم / البلازما إلى الأنسجة الطازجة أو المجمدة إلى FFPE (الفورمالين الثابت البارافين المدمج). وعلاوة على ذلك، سيعزز البروتوكول إمكانية تكرار إجراء إعداد العينات داخل المختبرات وفيما بينها في مجال الببتيدوميكا المناعية، ومن المتوقع بالتالي أن يجد تطبيقا واسعا في البحوث الأساسية والسريرية.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ونشكر بيير ثيبولت، وإريك بونيل، وجويل لانوا، وكارولين كوتيه (معهد البحوث في علم المناعة والسرطان، جامعة مونتريال) وأنتوني بورسيل (جامعة موناش) على تعليقاتهم الثاقبة. تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة أبحاث كيبيك - سانتيه (FRQS) ، ومؤسسة كول ، و CHU Sainte-Justine ، ومؤسسات تشارلز برونو ، والمؤسسة الكندية للابتكار ، والمجلس الوطني لبحوث العلوم والهندسة (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) (#174924).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 176،
الببتيدات المناعية: عزل الفأر والببتيدات البشرية المرتبطة بالفئران MHC من الفئتين الأولى والثانية لتحليل الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette,… More

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter