Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunopeptidomikk: Isolering av mus og human MHC klasse I- og II-assosierte peptider for massespektrometrianalyse

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63052
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for rensing av MHC klasse I og klasse II peptidkomplekser fra mus- og menneskecellelinjer som gir immunopeptidomiske data av høy kvalitet. Protokollen fokuserer på prøvepreparering ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer.

Abstract

Immunopeptidomikk er et fremvoksende felt som driver og styrer utviklingen av vaksiner og immunterapier. Mer spesifikt refererer det til vitenskapen om å undersøke sammensetningen av peptider presentert av store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og klasse II molekyler ved hjelp av massespektrometri (MS) teknologiplattformer. Blant alle trinnene i en MS-basert arbeidsflyt for immunopeptidomikk er prøvepreparering kritisk viktig for å fange opp data av høy kvalitet av terapeutisk relevans. Her er trinnvise instruksjoner beskrevet for å isolere MHC klasse I og II-assosierte peptider ved immunoffinitetsrensing fra kvalitetskontrollprøver, fra mus (EL4 og A20) og menneskelige (JY) cellelinjer mer spesifikt. De ulike reagensene og spesifikke antistoffene er grundig beskrevet for å isolere MHC-assosierte peptider fra disse cellelinjene, inkludert trinnene for å verifisere perlenes bindende effektivitet av antistoffet og elutioneffektiviteten til MHC-peptidkompleksene fra perlene. Protokollen kan brukes til å etablere og standardisere en immunopeptidomisk arbeidsflyt, samt til å benchmarke nye protokoller. Videre representerer protokollen et flott utgangspunkt for eventuelle ikke-eksperter i tillegg til å fremme intra- og interlaboratoriumsreroduserbarheten av prøveprepareringsprosedyren i immunopeptidomikk.

Introduction

I løpet av det siste tiåret har interessen for å undersøke repertoaret til MHC-tilknyttede peptider overskredet den akademiske sektoren og nådd bioteknologi- og farmasøytiske næringer. Faktisk, i kreft, representerer oppdagelsen av handlingsrettede tumorspesifikke neoantigener et stort forskningsfokus i industrisektoren for å utvikle kliniske immunterapier som fører til personlig onkologi1,2,3. I utgangspunktet presenteres MHC-tilknyttede peptider gjennom hele kroppen, reflekterer cellens intracellulære stadium, og er signifikante i ulike sykdomstilstander som autoimmunitet, transplantasjon, smittsomme sykdommer, betennelse, kreft og allergier1,4. Dermed er MHC-assosierte peptider, eller humane leukocyttantigen (HLA) ligander hos mennesker, av stor medisinsk interesse og blir samlet referert til som immunopeptidome5.

MS er en kraftig analytisk tilnærming for å karakterisere immunopeptidomet6,7, inkludert oppdagelsen av tumorspesifikke neoantigener8,9,10,11. En typisk arbeidsflyt for å utføre et immunopeptidomisk eksperiment inkluderer tre hovedtrinn: 1) prøvepreparering for isolering av MHC-tilknyttede peptider, 2) datainnsamling av MS og 3) dataanalyse ved hjelp av ulike beregningsbaserte programvareverktøy12. Genereringen av høykvalitetsprøver beskrevet i denne visualiserte protokollen er avgjørende for å lykkes med ethvert prosjekt innen MS-basert immunopeptidomikk. Protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på å isolere MHC klasse I- og II-tilknyttede peptider fra veletablerte cellelinjer som er egnet for å generere immunopeptidomiske data av høy kvalitet. Representative resultater fra disse cellelinjene vises i gjeldende protokoll.

Protocol

Protokollen her ble tilpasset fra etablerte protokoller13,14,15,16,17,18,19,20. Den generelle prosedyren for immunoffinitetsrensing (IP) av MHC klasse I og II peptider er illustrert i figur 1. Se Materialfortegnelser for detaljer om cellelinjene og antistoffene som brukes.

1. Perler kobling med antistoffer (dag 1): Kobling antistoffer til sepharose CNBr-aktiverte perler

MERK: Forbered nye løsninger for hvert nye eksperiment. Se Tabell over materialer og supplerende tabell 1 for liste over reagenser og løsningsoppskrifter. Alle trinnene utføres ved romtemperatur (RT). Når du bruker et nytt antistoff, må du kontrollere bindingseffektiviteten ved å samle inn viktige aliquots (se indikasjonen VALGFRITT) og utføre Coomassie blå farging SDS-PAGE (figur 2).

  1. Aktivering av sepharose CNBr perler
    1. Vei 80 mg sepharose CNBr-aktiverte per prøve og overfør dem til et 15 ml konisk rør.
    2. For å lette resuspension av tørkede perler, tilsett først 5 ml 1 mM HCl og pipette opp og ned 5 ganger. Fyll deretter konisk rør med ytterligere 8,5 ml 1 mM HCl.
    3. Roter ved 20 o/min (omdreininger per minutt) i 30 minutter ved RT ved hjelp av en rotatorenhet. Sentrifuger perlene på 200 x g i 2 min ved RT og fjern supernatanten ved aspirasjon.
    4. Tilsett 500 μL koblingsbuffer til perlene pellet og overfør til en ny 2,0 ml sentrifugerør og hold til side for trinn 1.2.2.
  2. Kobling av antistoffer mot CNBr-aktiverte perler
    1. Forbered antistoffet som er valgt for isolering av MHC-klasse I- eller II-peptidene i et nytt 2,0 ml mikrosentrifugerør ved å tilsette 2 mg antistoff (i henhold til konsentrasjonen spesifisert av produsenten). Fullfør volumet til 1 ml med koblingsbufferløsningen for å få en endelig konsentrasjon på 2 mg / ml.
    2. Sentrifuger perlene fra trinn 1.1.4 ved 200 x g i 2 min ved RT og fjern deretter supernatanten ved aspirasjon.
    3. Tilsett antistoffløsningen på 2,0 ml mikrosenterrør som inneholder de aktiverte perlene.
    4. (VALGFRITT) Ta en aliquot på 18 μL (INPUT), tilsett 6 μL 4x SDS-PAGE buffer, og frys umiddelbart.
    5. Roter mikrosentrifugerøret fra trinn 1.2.3 ved 20 o/min i 120 min ved hjelp av en rotatorenhet. Sentrifuger perlene på 200 x g i 2 min og fjern deretter supernatanten.
    6. (VALGFRITT) Ta en aliquot på 18 μL av supernatanten (ubundet antistoff), tilsett 6 μL 4x SDS-PAGE buffer og frys umiddelbart.
  3. Blokkering og vasking av antistoffkoblede perler
    1. Tilsett 1 ml 0,2 M glycin til mikrocentrifugerøret som inneholder antistoffkoblede perler fra trinn 1.2.5. Roter ved 20 o/min i 60 minutter ved RT ved hjelp av en roteringsenhet.
    2. Sentrifuger perlene på 200 x g i 2 min, og fjern deretter supernatanten. Tilsett 1 ml PBS (fosfatbufret saltvann).
    3. Sentrifuger perlene på 200 x g i 2 min, og fjern deretter supernatanten.
    4. (VALGFRITT) Ta en aliquot på 18 μL av supernatanten (ubundet antistoff, siste vask), tilsett 6 μL 4x SDS-PAGE buffer og frys umiddelbart.
    5. Legg 1 ml PBS til perlene i trinn 1.3.3.
    6. (VALGFRITT) Ta en aliquot på 18 μL perler blanding (perler kombinert med antistoff), tilsett 6 μL 4x SDS-PAGE buffer, og frys umiddelbart.
    7. Oppbevars ved 4 °C til samme dag brukes i trinn 2.5.
      MERK: Perler kan tilberedes dagen før immunocapture, men lengre lagring er ikke testet.

2. Cellelys og immunocapture med antistoffkoblede perler (dag 1)

MERK: Nivået på MHC-molekyler varierer fra celletype til celletype, og kvantifiseringen av MHC/HLA-molekyler per celle foreslås21 (figur 4A). Vi anbefaler minimum 1 x 108 celler for hver IP. Dette antallet celler tilsvarer 6-10 mg protein fra JY-, EL4- og A20-celler solubilisert med 0,5% Chaps-buffer. For å forberede cellepellets for IPs, bør celler høstes, sentrifugeres og vaskes to ganger med 5 ml PBS. Deretter kan cellepellets lagres i et 1,5 ml mikrosenterrør eller et 15 ml konisk rør ved -80 °C til IP-tidspunktet. Vær oppmerksom på at IPer kan utføres på ferske høstede eller frosne cellepellets.

  1. For å isolere MHC klasse I eller II peptider, tine en frossen pellets på 1 x 108 celler ved å varme bunnen av røret med håndflaten. Tilsett 500 μL PBS i pellets og pipette opp og ned til suspensjonen er homogen.
    MERK: Avhengig av celletypen kan cellepelletsvolumet variere betydelig. Hvis 500 μL PBS ikke er nok til å oppløse cellepelleten, bruk mer PBS til cellene ikke samles lett mens de pipetter opp og ned.
  2. Mål det totale volumet av pellets resuspendert i PBS og overfør til et nytt rør 2 ml mikrosenterfugerør. Del i flere rør om nødvendig.
  3. Tilsett et volum cellelysbuffer (1% chaps buffer i PBS som inneholder proteasehemmere, 1 pellet/10 ml buffer) tilsvarende volumet av cellepellet resuspendert i PBS målt i forrige trinn. Den endelige konsentrasjonen av lysisbufferen er 0,5% Chaps.
  4. Roter ved 10 o/min i 60 min ved 4 °C ved hjelp av en rotatorenhet. Sentrifuger cellelyset ved 18 000 x g i 20 minutter ved 4 °C med full brems og overfør supernatanten (som inneholder MHC-peptidkompleksene) i et nytt mikrocentrifugerør på 2,0 ml.
  5. Gjenopprett de antistoffkoblede perlene fra trinn 1.3.7 ved sentrifugering ved 200 x g i 2 min og fjern supernatanten.
  6. Overfør cellelyset supernatant i trinn 2.4 til de antistoffkoblede perlene og inkuber med rotasjon (10 rpm) i 14-18 timer (over natten) ved 4 °C ved hjelp av en rotatorenhet.

3. Elution av MHC peptider (Dag 2)

MERK: Polypropylenkolonne tillater elution av MHC-peptidkomplekser samtidig som perlene beholdes i kolonnen. For å evaluere andelen MHC-peptider komplekser avgrenset til perlene før og etter sur elution med 1% TFA (trifluoroeddiksyre), er det mulig å utføre en vestlig blott med aliquots tatt på viktige trinn under protokollen (se indikasjonen VALGFRITT). Vestlig blotting vist i figur 3 avslører berikelse av MHC-peptidkomplekser etter sur elution med 1% TFA. Fraværet av signal i denne fraksjonen indikerer at elutiontrinnet ikke var vellykket. Vær oppmerksom på at andelen ubundne MHC-peptider komplekser til perlene også kan evalueres parallelt av vestlig blotting ved hjelp av en aliquot beskrevet i trinn 3.1.6.

  1. Elution av MHC-peptidkomplekser fra antistoffet koblet perler
    1. Fjern bunnlokket på polypropylenkolonnen, plasser kolonnen på polypropylenkolonnestativet og installer en tom beholder under for å samle gjennom strømmen.
      MERK: Det kreves én kolonne per prøve.
    2. Skyll polypropylenkolonnen med 10 ml buffer A og la den renne ut av tyngdekraften. Hvis strømningshastigheten til flytende elution er for langsom, kutt den nederste spissen av polypropylenkolonnen ytterligere.
    3. Mål og samle beads-lysate blandingen (~ 2 ml) fra trinn 2.5 og overfør den til polypropylenkolonnen.
    4. (VALGFRITT) Ta en aliquot på 20 μL (eller 1/100 ut av det totale volumet) for vestlig blotting og frys umiddelbart. Denne fraksjonen tilsvarer de totale MHC-peptidkompleksene inkubert med perlene.
    5. La den flytende blandingen unnslippe av tyngdekraften.
    6. (VALGFRITT) Samle og mål gjennomstrømningen og ta en aliquot på 20 μL (eller 1/100 ut av det totale volumet) for vestlig blotting og frys umiddelbart. Denne fraksjonen representerer de resterende ubundne MHC-peptidkompleksene.
    7. For å gjenopprette perlene-lysatblandingen så mye som mulig, skyll røret fra trinn 3.1.3 med 1 ml buffer A og overfør det til polypropylenkolonnen.
    8. Vask perlene som beholdes i polypropylenkolonnen ved å legge til 10 ml buffer A. La vaskebufferen unnslippe av tyngdekraften.
    9. Gjenta vasketrinnet med 10 ml buffer B, 10 ml buffer A og deretter 10 ml buffer C.
    10. Fjern polypropylenkolonnen fra stativet og plasser den på toppen av et nytt 2,0 ml mikrosenterrør. Hold søylen og røret sammen med hånden.
    11. Tilsett 300 μL 1% TFA i polypropylenkolonnen og bland perlene ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
      MERK: Perlene beholdes i polypropylenkolonnen, og de MHC-bundne peptidene vil elute i 2,0 ml mikrocentrifugerøret.
    12. Overfør eluate i et nytt 2,0 ml mikrosenterrør. Gjenta trinn 3.1.11 og slå sammen de 2 eluates (eluates som inneholder MHC-peptidkompleksene skal tilsvare totalt 600 μL og vil bli brukt i trinn 3.2.4).
    13. (VALGFRITT) Samle en aliquot på 6 μL (eller 1/100 av det totale volumet) for vestlig blotting og frys umiddelbart. Denne fraksjonen tilsvarer MHC-peptidkompleksene som er utfridd fra perlene.
  2. Avsalting og elution av MHC peptider
    MERK: Avsalting og elution av MHC peptider trinn kan gjøres ved å installere C18 kolonnen på en 2.0 ml microcentrifuge rør. For en bedre passform, installer annealene fra produsenten mellom C18-kolonnen og 2,0 ml mikrocentrifugerøret. I denne protokollen brukes en C18-kolonne med en volumkapasitet på 5-200 μL (6-60 μg). Alle trinnene utføres på RT.
    1. Tilsett 200 μL metanol på toppen av C18-kolonnen, og sentrifuger deretter ved 1546 x g i 3 minutter. Kast gjennomstrømningen.
    2. Tilsett 200 μL 80 % ACN (acetonitril)/0,1 %TFA over C18-kolonnen, og sentrifuger deretter ved 1546 x g i 3 minutter. Kast gjennomstrømningen.
    3. Tilsett 200 μL 0,1%TFA over C18-kolonnen, og sentrifuger deretter ved 1546 x g i 3 minutter. Kast gjennomstrømningen.
    4. Last 200 μL av MHC-peptidkompleksene fra trinn 3.1.12 på toppen av C18-kolonnen. Sentrifuge ved 1546 x g i 3 min og kast gjennomstrømningen.
    5. Gjenta trinn 3.2.4 to ganger til hele volumet er lastet inn. Vær oppmerksom på at MHC-peptider beholdes i C18-kolonnen.
    6. Tilsett 200 μL 0,1%TFA i C18-kolonnen, og sentrifuger deretter ved 1546 x g i 3 minutter. Kast gjennomstrømningen.
    7. Overfør C18-kolonnen til et nytt 2,0 ml mikrosenterrør. Elute MHC-peptider fra C18-kolonnen ved å legge til 150 μL 28 %ACN/0,1 %TFA.
    8. Sentrifuge ved 1546 x g i 3 min.
    9. Overfør gjennomstrømningen i et nytt 1,5 ml mikrosenterrør. Vær forsiktig så du ikke kaster gjennomstrømningen; den inneholder de isolerte MHC klasse I eller II peptider.
    10. Gjenta trinn 3.2.7-3.2.9 to ganger for et totalt volum på 450 μL.
    11. Frys 450 μL eluate (renset MHC klasse I eller II peptider) ved -20 °C til prøver analyseres av LC-MSMS.
    12. Før LC-MS/MS-analyse fordampes de rensede MHC-klasse I- eller II-peptidene fra trinn 3.2.11 til tørrhet ved hjelp av en vakuumkonsentrator med forhåndsinnstillinger på 45 °C i 2 timer, vakuumnivå: 100 mTorr og vakuumrampe: 5.
      MERK: Fordampning av frosne prøver er svært effektiv. Tørkede peptider kan fryses på nytt til analyse.

4. Identifisering av MHC klasse I og II peptider av LC-MS/MS

MERK: Analyser MHC klasse I og II immunopeptidom ved hjelp av en høyytelses Orbitrap og høyoppløselig quadrupole tid-av-fly massespektrometre6. Følgende informasjon er kun gitt som en indikasjon, med tanke på at de ulike eksisterende tandemmassespektrometriinstrumentene opererer i henhold til forskjellige driftsstandarder. En kort oversikt over trinnene beskrives nedenfor :

  1. Solubiliser de tørkede prøvene (fra trinn 3.2.12) i 50 μL 4% maursyre (FA).
  2. Legg tre injeksjoner på 16 μL for hver prøve og separer på en hjemmelaget omvendt fasekolonne (150-μm dvs. med en lengde på 250 mm, Jupiter 3 μm C18 300 Å) med en gradient fra 5%-30% ACN-0,1% FA og en 600 nL / min strømningshastighet på en nanostrøm UHPLC koblet til en MS.
  3. Skaff hvert fulle MS-spektrum med en oppløsning på 120000, en AGC på 4 x 105 med automatisk modus for injeksjonstid og spektra ved hjelp av tandem-MS (MS-MS) på de mest tallrike multipliser ladede forløperionene i maksimalt 3 s.
    MERK: Tandem-MS-eksperimenter utføres ved hjelp av kollisjonsmessig dissosiasjon med høyere energi (HCD) ved en kollisjonsenergi på 30 %, en oppløsning på 30 000, en AGC på 1,5 x 105 og en injeksjonstid på 300 ms.
  4. Behandle datafilene fra de tre injeksjonene/prøven ved hjelp av en proteomikk LC-MS/MS-analyseprogramvare (f.eks. PEAKS X) ved hjelp av musen og menneskelige databaser (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Velg 'Uspesifisert enzym fordøyelse' for enzymparameteren, og 10 ppm og 0,01 Da for massetoleranser på henholdsvis forløper og fragmentioner.
    MERK: Variable modifikasjoner er deamidasjon (NQ) og oksidasjon (M). Alle andre søkeparametere er standardverdiene. Endelige peptidlister filtreres ved hjelp av ALC på 80 % og med en falsk oppdagelsesrate (FDR) på 1 % ved hjelp av programvaren for proteomikk LC-MS/MS-analyse.

5. Visualisering av immunopeptidomiske data

MERK: Kvaliteten på immunopeptidomikadata generert av MS kan vurderes på flere måter, som nylig beskrevet22,23. For å visualisere dataene og vurdere deres generelle kvalitet, sammensetning og MHC-spesifisitet, kan MhcVizPipe (MVP) programvareverktøy brukes.

  1. Følg alle instruksjonene og relatert dokumentasjon for å installere og kjøre MVP-programvaren som er tilgjengelig på Caron Lab GitHub-nettstedet24.
    MERK: MVP gir en rask og konsolidert visning av prøvekvalitet, sammensetning og MHC-spesifisitet. MVP parallelliserer bruken av veletablerte immunopeptidomiske algoritmer (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 og GibbsCluster27) og genererer organiserte og lettfattelige rapporter i HTML-format (HyperText Markup Language). Rapportene er fullt bærbare og kan vises på hvilken som helst datamaskin med en moderne nettleser. Se Tilleggsdata 1-4 hvis du vil se eksempler på HTML-rapporter.

Representative Results

Den generelle arbeidsflyten for å isolere MHC-peptidkomplekser for analyse av immunopeptidomer ved MS er illustrert i figur 1. Representative resultater for verifisering av antistoffets beads-bindende effektivitet (figur 2) (ved bruk av Y3 anti-H2Kb-antistoffet) og elutioneffektiviteten til MHC-peptidkompleksene fra perlene (figur 3) (ved hjelp av W6/32 anti-HLA-ABC-antistoffet) vises. Flow cytometribaserte kvantifiseringsanalyser21 ble også brukt til å måle det absolutte antallet MHC klasse I-molekyler per EL4-celle (H2Kb og H2Db) og JY-cellen (HLA-ABC), som vist i figur 4A.

Resultatenes intra- og mellom individuelle reproduserbarhet ved hjelp av gjeldende protokoll er vist i figur 4B-E. Representative resultater vises for MHC klasse I peptider identifisert fra 1 x 108 EL4 celler og 1 x 108 JY celler. Resultatene ble generert fra to forskjellige laboratoriemedlemmer (bruker 1 og bruker 2). For bruker 1 var gjennomsnittlig antall MHCI-spesifikke peptider som ble oppdaget fra EL4- og JY-celler henholdsvis 1341 og 6361; for henholdsvis bruker 2, 1933 og 7238 (figur 4B;D). Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten (CV) for antall peptider som oppdages på tvers av tre forskjellige biologiske replikeringer/eksperimenter, varierer fra 1,9%-11% (figur 4B,D). Selv om CV-ene for antall peptider som ble oppdaget på tvers av de tre ulike eksperimentene var relativt små, varierte peptidenes identitet betydelig (figur 4C,E). Faktisk viser representative Venn-diagrammer at andelen peptider som ble reprodusert på tvers av tre biologiske replikeringer varierte fra 39% (Bruker 2, EL4-celler) til 63% (Bruker 1, JY-celler) (Figur 4C, E og Supplerende tabell 2).

Varmekart generert av MVP-programvaren viser forventet MHC-bindingsstyrke for de identifiserte peptidene ved hjelp av NetMHCpan-pakkeverktøyene25,26,28. To GibbsCluster-rutinealternativer, som kalles 'Unsupervised GibbsCluster' og 'Allele-Specific GibbsCluster', utføres også av MVP for å trekke ut MHC peptidbindende motiver. Vær oppmerksom på at MVP har begrensninger; Hovedmålet er ikke å trekke ut allelspesifikke motiver og kommentere peptider på en svært nøyaktig måte, men heller gi et fugleperspektiv på prøvenes generelle kvalitet, sammensetning og MHC-spesifisitet.

For mus MHC klasse I (H2Db og H2Kb) peptider i EL4 celler (Figur 5A; øvre paneler og supplerende data 1), viser et representativt varmekart at 89% av alle påviste 8-12-mer peptider er spådd å være sterke bindemidler (SB: NetMHCpan %Rank <0,5) eller Weak Binders (WB: NetMHCpan %Rank <2) for H2Db- eller H2Kb-molekyler. Sekvensklynger generert fra 8-12-mer peptider er i samsvar med rapporterte logoer for H2Db (asparagin ved P5 og Leucine ved P9) og H2Kb (fenylalanin ved P5 og leucin ved P8) (figur 5)29. Det er verdt å nevne at et tredje dominerende motiv (histidin ved P7 og leucin ved P9) samt ytterligere 'artefaktuelle' motiver kan observeres ved hjelp av M1-antistoffet (Supplementary Data 1). Faktisk er M1-antistoffet kjent for å kryss-reagere med det ikke-klassiske Qa2-molekylet, og derfor oppdages Qa2-assosierte peptider også av MS (Supplementary Data 1). Her fokuserer figur 5 på å vise de veletablerte peptidbindende motivene for de to klassiske H2b-allelene (dvs. H2Db eller H2Kb) uttrykt i EL4-celler.

For humane HLA klasse I (HLA-ABC) peptider i JY-celler (figur 5A, lavere paneler og supplerende data 2), viser et representativt varmekart at 97% av alle oppdagede 8-12-mer peptider er spådd å være SB eller WB for HLA-A * 0201, -B * 0702 eller -C * 0702. Peptider ble gruppert for å visualisere peptidbindingsmotiver for HLA-A * 0201 og -B * 0702. Bindingsmotiv for HLA-C*0702 vises ikke i figur 5A fordi C*0702-allelen har et relativt lavt uttrykksnivå. Derfor ble for få C * 0702 peptider isolert og identifisert for å generere et representativt C * 0702 motiv. Merk at C*0702-motivet kan visualiseres i andre studier30,31,32 eller fra NetMHCpan 4.1 Motif Viewer nettsted33.

For humane HLA klasse II (HLA-DR) peptider i JY-celler (figur 5B, øvre paneler og supplerende data S3), viser et representativt varmekart at 70% av alle påviste 9-22-mer peptider er spådd å være SB eller WB for HLA-DRB1 * 0404 og -DRB1 * 1301. Peptidbindende motiver for disse to allelene er vist (figur 5B). Merk at peptidbindende motiver som vises her kanskje ikke er i fullstendig samsvar med de nylig rapporterte logoene for HLA-DRB1 * 0404 og -DRB1 * 130134. Dette avviket fremhever den nåværende manglende evne til MVP / NetMHCpan å nøyaktig kommentere peptider til HLA klasse II alleler som er mindre karakterisert, for eksempel HLA-DRB1 * 0404 og -DRB1 * 1301 uttrykt i JY celler. Ytterligere informasjon om klasse II peptidbindende motiver finnes i andre studier34,35 og fra NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer nettsted36.

Til slutt, for mus MHC klasse II (H2-IAd og H2-IEd) peptider i A20 celler (Figur 5B; lavere paneler og Supplerende Data 4), viser et representativt varmekart at 87% av alle oppdagede 9-22-mer peptider er spådd å være SB eller WB for H2-IAd eller H2-IEd. Peptidbindende motiver for disse to allelene er i samsvar med rapporterte logoer37.

Komplette HTML-rapporter generert av MVP-programvaren for å vurdere den generelle kvaliteten og MHC-spesifisiteten til prøvene er tilgjengelige i Supplementary Data 1-4.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for hele prosedyren for isolering av MHC klasse I og II peptider. (A-B)100 millioner celler er pelleted og lysed med 0,5% Chaps buffer. (C) Cellelyset er sentrifugert, og supernatanten legges til CNBr-sepharose perler koblet til ønsket antistoff på forhånd og (D) inkuberes 14-18 h ved 4 °C. (E) Etter immunocapture overføres perlene til en polypropylenkolonne og vaskes, og MHC-peptidkompleksene elutes med en 1% TFA-løsning. (F) Peptidene er avsaltet og eluted ved hjelp av en C18 kolonne. (G) Deretter blir peptider hastighetstørket og analysert av tandemmassespektrometri. (H) Kvaliteten på de isolerte MHC klasse I- og II-peptidene kan vurderes basert på HLA-undertypene ved hjelp av den fritt tilgjengelige MhcVizPipe-programvaren. Figur opprettet med BioRender.com (NT22ZL8QSL). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Coomassie gelfarging for å spore antistoffbindingseffektivitet til sepharose CNBr-aktiverte perler. Aliquots av tilsvarende volumer ble lastet på 12% SDS-PAGE gel etterfulgt av Coomassie blå farging: perler + antistoff pre-kobling (1), ubundet antistoff etter kobling trinn (2), supernatant etter siste vask etter kobling (3), og perler kombinert med antistoff (4). Effektiviteten av bindingen er illustrert ved en betydelig reduksjon i signalfargingsintensiteten til de lette og tunge kjedene til H2Kb når perler er kovalent bundet (Lane 4) til CNBr-perlene sammenlignet med antistoffet før kobling (Lane 1). Figuren er trykket på nytt og tilpasset fra bioRxiv38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vestlig blotting for sporing av MHC-peptidkomplekser etter sur elution fra antistoff-koblede CNBr-aktiverte perler. Aliquots tatt fra trinnene som er angitt i protokollen (1/100 av det totale målte volumet) ble lastet på en 12% SDS-PAGE gel og overført til nitrocellulosemembran: Perler + lysat etter immunocapture og siste vask (A); supernatant av siste vask (B) og MHC-peptidkomplekser som er utrømt fra perlene (C). Det sterke deteksjonssignalet til MHC-peptidkompleksene i (C) ved hjelp av anti-HLA-ABC tungt kjedeantistoff (Abcam, #ab 70328, 1:5000) bekreftet isolering av MHC-peptidkomplekser etter sur elution. Merk at det er mulig å vurdere andelen MHC-peptidkomplekser som ikke ble fanget opp av antistoffkoblingsperlene ved å samle gjennomstrømningen fra trinn 3.1.6. En aliquot kan legges til den vestlige blotten (ikke vist på denne gelen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Identifisering av MHC klasse I peptider fra JY- og EL4-celler. (A) Histogram som viser absolutt antall celleoverflate H2Db- og H2Kb-molekyler per EL4-celle og HLA-ABC-molekyler per JY-celle. Kvantifisering ble utført ved strømningscytometri. Gjennomsnittlig og standard feil i gjennomsnittet ble hentet fra tre biologiske replikeringer. (B, D) Histogram som viser gjennomsnittstallet og standardavviket for gjennomsnittet av MHC klasse I peptider identifisert av to uavhengige brukere (USER_1 [U1] og USER_2 [U2]). Gjennomsnittlig tall og standardavvik for gjennomsnittet av MHC klasse I peptider oppdaget fra musen EL4 celler (B) og menneskelige JY celler (D) vises. Variasjonskoeffisienter (CV) på tvers av tre uavhengige biologiske replikeringer er indikert. (C, E) Venn-diagrammer som viser antall peptider som ble reprodusert i EL4 (C) og JY-celler (E) av to uavhengige brukere (U1 og U2) over tre uavhengige biologiske replikeringer. Figur 4A er trykket på nytt og tilpasset fra bioRxiv38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av immunopeptidomikadata ved hjelp av MVP-programvareverktøyet. Dataanalyse av mus og humane (A) MHC klasse I og (B) MHC klasse II peptider. Representative bindingsaffinitetsvarmekart (venstre paneler) og peptidbindingsmotiver (høyre paneler) vises. Varmekartfarger representerer MHC-bindingsaffiniteten som forutses av NetMHCpan 4.1 (%rank). Sterke dokumentordnere er røde (%rank <0,5), svake dokumentordnere er blå (%rank <2) og ikke-dokumentordnere er gule (%Rank >2). Andel (%) av 8-12mer peptider (A) og 9-22mer peptider (B) som er SB eller WB er angitt i parentes. Peptidbindingsmotiver ble generert av MVP ved hjelp av alternativet 'Allele-spesifikk Gibbscluster'. Disse representative resultatene ble oppnådd fra 1 x 108 celler og ved å bruke følgende antistoffer og cellelinjer: M1 antistoff og EL4 celler for mus MHC klasse I peptider; W6/32 antistoff og JY celler for humane MHC klasse I peptider; M5 antistoff og A20 celler for mus MHC klasse II peptider; L243 antistoff og JY celler for humane MHC klasse II peptider. Se Tilleggsdata 1-4 for å få tilgang til de fullstendige HTML-rapportene som genereres av MVP-programvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsdata 1-4: Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsdata 1: HTML-rapport generert av MVP-programvaren fra peptider som ble isolert fra 1 x 108EL4 celler ved hjelp av M1-antistoffet. Tre biologiske repliker vises. Denne rapporten er knyttet til figur 4 og figur 5 og representative peptider er oppført i supplerende tabell 2.

Tilleggsdata 2: HTML-rapport generert av MVP-programvaren fra peptider som ble isolert fra 1 x 108JY-celler ved hjelp av W6/32-antistoffet. Tre biologiske replater er vist. Denne rapporten er knyttet til figur 4, og figur 5, og representative peptider er oppført i supplerende tabell 2.

Tilleggsdata 3: HTML-rapport generert av MVP-programvaren fra peptider som ble isolert fra 1 x 108JY-celler ved hjelp av L243-antistoffet. Denne rapporten er knyttet til figur 5, og representative peptider er oppført i supplerende tabell 2.

Tilleggsdata 4: HTML-rapport generert av MVP-programvaren fra peptider som ble isolert fra 1 x 108A20 celler ved hjelp av M5-antistoffet. Denne rapporten er knyttet til figur 5, og representative peptider er oppført i supplerende tabell 2.

Supplerende tabell 1: Liste over buffere. Oppskrifter for alle bufferne som brukes i protokollen er beskrevet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Representative lister over peptider knyttet til H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR og H2-IAd/IEd. Denne tabellen inneholder listene over representative MHC klasse I- og II-peptider isolert fra henholdsvis mus EL4- og A20-cellelinjer, og HLA klasse I og II fra human JY-cellelinje. Disse dataene er deponert på ProteomeXchange (PXD028633). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

DATATILGJENGELIGHET:

Datasett som ble brukt i dette manuskriptet ble deponert på ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussion

To musecellelinjer (EL4 og A20), en human cellelinje (JY) og fem kommersielt tilgjengelige antistoffer [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-I Ad/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) og L243 (anti-HLA-DR)] ble testet og validert i sammenheng med denne protokollen og gir immunopeptidomiske data av høy kvalitet. Andre anti-HLA antistoffer er tilgjengelige (f.eks. anti-HLA-A2 BB7.2), men ble ikke testet her. Merk at W6/32 antistoffet er mye brukt og det mest etablerte antistoffet i feltet; Det muliggjør isolering av peptider presentert av alle HLA-ABC molekyler hos mennesker og ble tidligere rapportert av ekspertlaboratorier å jobbe fra ulike biologiske kilder som ferskt eller frossent vev8,39, perifere blodmonnukleære celler og benmargsmonnukleære celle40, biopsier41, xenografts41,42, obduksjoner43 og plasmaprøver44,45.

Utarbeidelse av nye løsninger som brukes i hele protokollen er kritisk. Spesielt er bruk av friske sure løsninger i glassflasker avgjørende for å unngå etterfølgende forurensning av prøvene analysert av MS. I tillegg, når protokollen er gjort for første gang og / eller med et nytt antistoff, er det viktig å vurdere at antistoffet faktisk er koblet til CNBr Sepharose perler ved hjelp av en blå Coomassie gel. Vasketrinnene til antistoffkoblede perler etter immunocapture av MHC-peptidkompleksene er også avgjørende for å unngå forurensning av ikke-MHC-peptider. Til slutt er det nødvendig med spesiell forsiktighet for ikke å kaste eluates etter elution av MHC-peptidkompleksene med 1% TFA og elution av peptidene fra C18-kolonnen med ACN28% / 0,1% FA.

Eksisterende protokoller som er tilgjengelige i litteraturen beskriver ytterligere trinn for å rense peptidene ytterligere på slutten av isolasjonsprosedyren, for eksempel peptidfraksjonering ved hjelp av forskjellige metoder14,46 eller ultrafiltrering ved hjelp av 10-30 kDa filtre13,47. Den gjeldende protokollen gir ikke detaljer om disse tilleggstrinnene og er tilstrekkelig til å gi immunopeptidomiske data av høy kvalitet. Imidlertid kan slike trinn vurderes av ikke-eksperter for å endre og feilsøke for å optimalisere peptidisolasjonsprosedyren ytterligere.

Typen perler og typen sur elutionbuffer som brukes til å unngå MHC-komplekser fra perlene, kan også endres for feilsøking13,14,15,16,17,18,19. I denne forbindelse er sepharose CNBr-aktiverte perler generelt et godt utgangspunkt siden de er relativt billige i tillegg til å vise fleksibilitet når det gjelder binding med ulike typer antistoffer. I den nåværende protokollen ble sepharose CNBr-aktiverte perler vist å fungere relativt bra ved hjelp av fem forskjellige kommersielt tilgjengelige antistoffer (dvs. M1, Y3, W6/32, L243 og M5). Foruten sepharose CNBr-aktiverte perler, protein A eller G eller A / G sepharose 4 Fast Flow perler er også enkle å håndtere, og selv om relativt dyrere, kan generere lignende resultater. En annen faktor å vurdere er affiniteten av antistoffet for protein A eller G. Videre er sepharose magnetiske perler også veldig enkle å bruke, men er relativt dyre. Uavhengig av typen perler valgt av ikke-eksperter, oppfordres det til å samle aliquots på kritiske trinn i protokollen og utføre blå Coomassie-fargede SDS-PAGE geler for å spore bindingseffektiviteten til antistoffet mot perlene, som vist i figur 2.

En annen viktig faktor som påvirker vellykket MHC-peptider isolasjon refererer til typen sur elutionbuffer som brukes til å isolere MHC-peptidkompleksene fra perlene. Ulike buffere er rapportert inkludert 0,1%, 1% eller 10% TFA, 0,2% FA og 10% eddiksyre. 1% TFA var elutionbufferen som fungerte for alle antistoffene som ble testet. Dette trinnet kan også spores av vestlig blotting mot MHC-molekylene som brukes til å fange MHC-peptider, som vist i figur 3.

Alle buffere som inneholder acetonitril (ACN) og/eller trifluoroeddiksyre (TFA) er aggressive og kan føre til kontaminering av prøven med små molekylære og polymere stoffer som myknere hvis de kommer i kontakt med plast. For å unngå slike problemer tilberedes alle løsninger som inneholder et organisk løsningsmiddel og/eller TFA fersk daglig og lagres i en glassflaske til bruk. De fleste trinnene utføres i Protein LoBind plastrør. Disse rørene er spesielt designet for proteomikk og er laget av høyeste kvalitet, jomfru polypropylen fri for biocider, myknere og latex. De er også produsert med optimaliserte, svært polerte former uten bruk av glidemidler. Disse forholdsreglene er viktige å vurdere for å muliggjøre generering av immunopeptidomiske data av høy kvalitet.

Antistoffet er en viktig begrensning for isolering av MHC-bundne peptider. W6/32-antistoffet muliggjør isolering av peptider presentert av alle HLA-ABC klasse I-molekyler hos mennesker og er det mest brukte og etablerte antistoffet i feltet. Høyoppløselig HLA-skriving av ukarakteriserte menneskelige cellelinjer eller biospecimens er ikke en nødvendighet ved påføring av W6/32-antistoffet, men anbefales likevel for visse applikasjoner for å lette datatolkning48. HLA/MHC skriveinformasjon finnes også i offentlige ressurser for flere cellelinjer og musemodeller49. Foruten W6/32-antistoffet er de fire andre antistoffene (M1, M5, Y3 og L243) som ble testet og validert i sammenheng med denne protokollen alle kommersielt tilgjengelige. På den annen side har mange andre antistoffer som ble rapportert i tidligere immunopeptidomikastudier ikke i stor grad blitt vedtatt av samfunnet og ikke er kommersielt tilgjengelige eller er tilgjengelige gjennom kulturen av hybridomcellelinjer, noe som er relativt dyrt.

En annen viktig begrensning for isolering av MHC-bundet peptider er mengden startmateriale som kreves. Mengden som kreves er omvendt proporsjonal med uttrykksnivået til MHC-molekyler på celleoverflaten, som kan kvantifiseres ved strømningscytometri (figur 4A). Celler som viser høye uttrykksnivåer av MHC-molekyler (f.eks. dendrittiske celler og hematopoietiske celler generelt) gir generelt immunopeptidomiske data av høy kvalitet. Ekspertlaboratorier bruker fra så lite som 50 millioner celler50, men 100 millioner til 1 milliard celler anbefales for ikke-eksperter. Bruk av vevsbiopsi (<13 mg)41, xenograft42,43, obduksjon44 og plasma45,46 prøver ble også rapportert, men fortsatt utfordrende for ikke-ekspertlaboratorier. Også det totale antallet MHC-tilknyttede peptider som forventes er godt dokumentert for etablerte cellelinjer (her, mellom ~ 2000 og ~ 10000 peptider avhengig av cellelinjen og antistoffet som brukes), men de absolutte mengdene naturlig presenterte peptider som effektivt trekkes ned av teknikken forblir debattert. Faktisk anslo tidligere studier at effektiviteten av isolasjonsprosedyren er peptidavhengig og kan være fra så lite som 0,5% -2%51. Andre begrensninger i immunopeptidomics er reproduserbarheten av metodene og manglende evne til NetMHCpan suite verktøy for å riktig kommentere peptider til MHC-alleler som er mindre karakterisert. I denne forbindelse, videreutvikling og anvendelse av relativt nye datauavhengige oppkjøp MS-metoder7,32,52, samt nye peptid klynger og MHC peptid bindende prediksjon algoritmer31,34,53,54 forventes å forbedre reproduserbarheten og nøyaktigheten av peptidmerknader i immunopeptidomikk. Immunopeptidomikk står overfor andre begrensninger når det gjelder MS-anskaffelse og beregningsanalyse av MHC-tilknyttede peptider og dekkes andre steder1,6,55.

While isolering av HLA-ABC-assosierte peptider fra menneskelige prøver ved hjelp av W6/32 antistoffet er godt etablert og mye anvendt av mange forskningsgrupper, er isolering av mus MHC klasse I- og II-assosierte peptider relativt mindre etablert. Derfor er det nødvendig med robuste protokoller for isolering av mus MHC-ligander. Her tilbyr vi en protokoll optimalisert for isolering av MHC klasse I peptider og MHC klasse II peptider fra to musecellelinjer av henholdsvis C57BL / 6 og BALB / c opprinnelse. Spesielt muliggjør protokollen isolering av klasse I H2Kb- og H2Db-tilknyttede peptider ved hjelp av M1-antistoffet, samt klasse II H2-IAd og H2-IEd-tilknyttede peptider ved hjelp av M5-antistoffet. Formidling og anvendelse av dagens protokoll bør derfor legge til rette for grunnleggende og translasjonell immunopeptidomisk forskning i ulike musemodeller.

Protokollen kan brukes til å etablere og standardisere en immunopeptidomisk arbeidsflyt, samt til å benchmarke nye protokoller. For eksempel kan den tilpasses og optimaliseres ytterligere for å utføre immunopeptidomisk screening i ulike biologiske matriser som spenner fra blod / plasma til friskt eller frossent vev til FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Videre vil protokollen fremme intra- og interlaboratoriets reproduserbarhet av prøveprepareringsprosedyren i immunopeptidomikk og forventes derfor å finne bred anvendelse i grunnleggende og klinisk forskning.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal) og Anthony Purcell (Monash University) for deres innsiktsfulle kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Cole Foundation, CHU Sainte-Justine og Charles-Bruneau Foundations, Canada Foundation for Innovation, National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) og Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

Tags

Biokjemi utgave 176
Immunopeptidomikk: Isolering av mus og human MHC klasse I- og II-assosierte peptider for massespektrometrianalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette,… More

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter