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Biochemistry

Immunopeptidomics: माउस और मानव MHC कक्षा I का अलगाव- और द्वितीय-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए संबद्ध पेप्टाइड्स

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63052
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम माउस और मानव सेल लाइनों से एमएचसी कक्षा I और कक्षा II पेप्टाइड परिसरों के शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स डेटा प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके नमूना तैयारी पर केंद्रित है।

Abstract

Immunopeptidomics एक उभरता हुआ क्षेत्र है जो टीकों और immunotherapys के विकास को ईंधन और मार्गदर्शन करता है। अधिक विशेष रूप से, यह बड़े हिस्टोकंपैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) क्लास I और क्लास II अणुओं द्वारा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्रौद्योगिकी प्लेटफार्मों का उपयोग करके प्रस्तुत पेप्टाइड्स की संरचना की जांच करने के विज्ञान को संदर्भित करता है। एक एमएस-आधारित इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स वर्कफ़्लो में सभी चरणों में से, चिकित्सीय प्रासंगिकता के उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को कैप्चर करने के लिए नमूना तैयारी गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यहां, चरण-दर-चरण निर्देशों को एमएचसी कक्षा I और II से जुड़े पेप्टाइड्स को गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों से, माउस (EL4 और A20) से, और मानव (JY) सेल लाइनों से अधिक विशेष रूप से immunoaffinity शुद्धिकरण द्वारा अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। विभिन्न अभिकर्मकों और विशिष्ट एंटीबॉडी को इन सेल लाइनों से एमएचसी-संबद्ध पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, जिसमें एंटीबॉडी की मोती-बाध्यकारी दक्षता और मोतियों से एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों की क्षालन दक्षता को सत्यापित करने के चरण शामिल हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग एक इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स वर्कफ़्लो को स्थापित करने और मानकीकृत करने के साथ-साथ नए प्रोटोकॉल को बेंचमार्क करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल किसी भी गैर-विशेषज्ञों के लिए एक महान प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है, इसके अलावा इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स में नमूना तैयारी प्रक्रिया के इंट्रा- और इंटर-लैबोरेटरी पुनरुत्पादन को बढ़ावा देने के लिए।

Introduction

पिछले दशक में, एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स के प्रदर्शनों की सूची की जांच में रुचि अकादमिक क्षेत्र से अधिक हो गई है और बायोटेक और फार्मास्युटिकल उद्योगों तक पहुंच गई है। दरअसल, कैंसर में, कार्रवाई योग्य ट्यूमर-विशिष्ट नियोएंटीजन की खोज औद्योगिक क्षेत्र में एक प्रमुख शोध फोकस का प्रतिनिधित्व करती है ताकि नैदानिक इम्यूनोथेरेपी विकसित की जा सके जो व्यक्तिगत ऑन्कोलॉजी 1,2,3 के लिए अग्रणी है। मूल रूप से, एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स पूरे शरीर में प्रस्तुत किए जाते हैं, सेल के इंट्रासेल्युलर चरण को प्रतिबिंबित करते हैं, और ऑटोइम्यूनिटी, प्रत्यारोपण, संक्रामक रोगों, सूजन, कैंसर और एलर्जी जैसे विभिन्न रोग स्थितियों में महत्वपूर्ण हैं1,4। इस प्रकार, एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स, या मनुष्यों में मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) लिगेंड, महान चिकित्सा रुचि के हैं और सामूहिक रूप से इम्यूनोपेप्टिडोम 5 के रूप में संदर्भित किए जाते हैं।

एमएस immunopeptidome6,7 को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण है, जिसमें ट्यूमर-विशिष्ट neoantigens8,9,10,11 की खोज शामिल है। एक immunopeptidomics प्रयोग करने के लिए एक विशिष्ट वर्कफ़्लो में तीन मुख्य चरण शामिल हैं: 1) एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए नमूना तैयारी, 2) एमएस द्वारा डेटा अधिग्रहण, और 3) विभिन्न कम्प्यूटेशनल सॉफ़्टवेयर टूल्स 12 का उपयोग करके डेटा विश्लेषण। इस विज़ुअलाइज़ किए गए प्रोटोकॉल में वर्णित उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की पीढ़ी एमएस-आधारित इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स में किसी भी परियोजना की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एमएचसी वर्ग I- और II-संबद्ध पेप्टाइड्स को अच्छी तरह से स्थापित सेल लाइनों से अलग करने पर केंद्रित है जो उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त हैं। उन कक्ष रेखाओं से प्रतिनिधि परिणाम वर्तमान प्रोटोकॉल में दिखाए जाते हैं।

Protocol

यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल को स्थापित प्रोटोकॉल 13,14,15,16,17,18,19,20 से अनुकूलित किया गया था। एमएचसी वर्ग I और II पेप्टाइड्स के इम्यूनोएफिनिटी शुद्धिकरण (आईपी) के लिए समग्र प्रक्रिया को चित्र 1 में चित्रित किया गया है। उपयोग की गई सेल लाइनों और एंटीबॉडी के बारे में विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें।

1. एंटीबॉडी (दिन 1) के साथ युग्मन मोती: SEPHAROSE CNBr-सक्रिय मोतियों के लिए एंटीबॉडी युग्मन

नोट: प्रत्येक नए प्रयोग के लिए नए समाधान तैयार करें। अभिकर्मकों और समाधान व्यंजनों की सूची के लिए सामग्री की तालिका और अनुपूरक तालिका 1 देखें। सभी चरणों को कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाता है। एक नए एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, कुंजी ऐलीकोट एकत्र करके बाध्यकारी दक्षता की जांच करें (संकेत वैकल्पिक देखें) और कूमासी नीले रंग के दाग एसडीएस-पेज (चित्रा 2) का प्रदर्शन करें।

  1. Sepharose CNBr मोतियों का सक्रियण
    1. प्रति नमूना sepharose CNBr-सक्रिय मोतियों के 80 मिलीग्राम वजन और उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरित.
    2. सूखे मोतियों के पुनर्सस्पेंशन की सुविधा के लिए, सबसे पहले, 1 mM HCl के 5 mL जोड़ें और 5 बार पिपेट ऊपर और नीचे। फिर, शंक्वाकार ट्यूब को 1 mM HCl के अतिरिक्त 8.5 mL के साथ भरें।
    3. एक रोटेटर डिवाइस का उपयोग करके आरटी पर 30 मिनट के लिए 20 आरपीएम (प्रति मिनट क्रांतियों) पर घुमाएं। RT में 2 मिनट के लिए 200 x g पर मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें।
    4. मोतियों गोली के लिए युग्मन बफर के 500 μL जोड़ें और एक नए 2.0 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण और चरण 1.2.2 के लिए एक तरफ रखें।
  2. CNBr-सक्रिय मोतियों के लिए एंटीबॉडी का युग्मन
    1. एक नए 2.0 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में MHC वर्ग I या II पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए चयनित एंटीबॉडी तैयार करें, जिसमें एंटीबॉडी के 2 मिलीग्राम (निर्माता द्वारा निर्दिष्ट एकाग्रता के अनुसार) जोड़ा जाता है। 2 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए युग्मन बफर समाधान के साथ 1 एमएल तक मात्रा को पूरा करें।
    2. RT पर 2 मिनट के लिए 200 x g पर चरण 1.1.4 से मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें।
    3. सक्रिय मोतियों युक्त 2.0 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंटीबॉडी समाधान जोड़ें।
    4. (वैकल्पिक) 18 μL (INPUT) का एक ऐलीकोट लें, 4x SDS-PAGE बफर के 6 μL जोड़ें, और तुरंत फ्रीज करें।
    5. एक रोटेटर डिवाइस का उपयोग करके 120 मिनट के लिए 20 rpm पर चरण 1.2.3 से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब घुमाएं। 2 मिनट के लिए 200 x g पर मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर supernatant को हटा दें।
    6. (वैकल्पिक) supernatant (अनबाउंड एंटीबॉडी) के 18 μL का एक एलीकोट लें, 4x SDS-PAGE बफर के 6 μL जोड़ें और तुरंत फ्रीज करें।
  3. अवरुद्ध और एंटीबॉडी युग्मित-मोतियों की धुलाई
    1. चरण 1.2.5 से एंटीबॉडी-युग्मित मोतियों वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.2 एम ग्लाइसिन का 1 एमएल जोड़ें। एक रोटेटर डिवाइस का उपयोग करके आरटी पर 60 मिनट के लिए 20 आरपीएम पर घुमाएं।
    2. 2 मिनट के लिए 200 x g पर मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर supernatant को हटा दें। पीबीएस (फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा) के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए 200 x g पर मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर supernatant को हटा दें।
    4. (वैकल्पिक) supernatant (अनबाउंड एंटीबॉडी, अंतिम धोने) के 18 μL का एक ऐलीकोट ले लो, 4x SDS-पेज बफर के 6 μL जोड़ें और तुरंत फ्रीज।
    5. चरण 1.3.3 में मोतियों के लिए PBS के 1 mL जोड़ें।
    6. (वैकल्पिक) मोतियों के मिश्रण के 18 μL का एक ऐलीकोट लें (एंटीबॉडी के साथ युग्मित मोती), 4x SDS-PAGE बफर के 6 μL जोड़ें, और तुरंत फ्रीज करें।
    7. चरण 2.5 में उसी दिन का उपयोग करने तक 4 °C पर रखें।
      नोट: मोतियों को इम्यूनोकैप्चर से एक दिन पहले तैयार किया जा सकता है, लेकिन लंबे समय तक भंडारण का परीक्षण नहीं किया गया है।

2. कोशिका lysis और एंटीबॉडी युग्मित-मोती (दिन 1) के साथ immunocapture

नोट: एमएचसी अणुओं का स्तर एक सेल प्रकार से दूसरे में भिन्न होता है, और प्रति सेल एमएचसी / एचएलए अणुओं का परिमाणीकरण सुझाया जाता है21 (चित्रा 4 ए)। हम प्रत्येक आईपी के लिए न्यूनतम 1 x 108 कोशिकाओं की सिफारिश करते हैं। कोशिकाओं की यह संख्या JY, EL4, और A20 कोशिकाओं से प्रोटीन के 6-10 मिलीग्राम से मेल खाती है जो 0.5% चैप्स बफर के साथ घुलनशील है। आईपी के लिए सेल छर्रों को तैयार करने के लिए, कोशिकाओं को काटा जाना चाहिए, सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए, और पीबीएस के 5 एमएल के साथ दो बार धोया जाना चाहिए। फिर, सेल छर्रों को आईपी के समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब या 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में संग्रहीत किया जा सकता है। ध्यान दें कि आईपी ताजा काटे गए या जमे हुए सेल छर्रों पर किया जा सकता है।

  1. एमएचसी कक्षा I या II पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, हथेली के साथ ट्यूब के निचले हिस्से को गर्म करके 1 x 108 कोशिकाओं के एक जमे हुए छर्रे को पिघलाएं। पीबीएस के 500 μL को गोली और पिपेट को ऊपर और नीचे जोड़ें जब तक कि निलंबन समरूप न हो।
    नोट:: सेल प्रकार के आधार पर, सेल गोली वॉल्यूम काफी भिन्न हो सकते हैं। यदि पीबीएस का 500 μL सेल पैलेट को भंग करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो अधिक पीबीएस का उपयोग करें जब तक कि कोशिकाएं ऊपर और नीचे पिपेटिंग करते समय आसानी से अलग न हो जाएं।
  2. पीबीएस में पुन: निलंबित गोली की कुल मात्रा को मापने और एक नई ट्यूब 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण। यदि आवश्यक हो तो अधिक ट्यूबों में विभाजित करें।
  3. सेल लाइसिस बफर की एक मात्रा जोड़ें (पीबीएस में 1% चैप्स बफर जिसमें प्रोटीज इनहिबिटर होते हैं, 1 पैलेट / 10 एमएल बफर) पिछले चरण में मापा गया पीबीएस में पुन: निलंबित सेल पैलेट की मात्रा के बराबर होता है। लाइसिस बफर की अंतिम एकाग्रता 0.5% चैप्स है।
  4. एक रोटेटर डिवाइस का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 10 आरपीएम पर घुमाएं। पूर्ण ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,000 x g पर सेल लिसेट को सेंट्रीफ्यूज करें और एक नए 2.0 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में supernatant (MHC-पेप्टाइड्स कॉम्प्लेक्स युक्त) को स्थानांतरित करें।
  5. 2 मिनट के लिए 200 x g पर centrifugation द्वारा चरण 1.3.7 से एंटीबॉडी युग्मित मोतियों को पुनर्प्राप्त करें और supernatant को हटा दें।
  6. चरण 2.4 में कोशिका lysate supernatant को एंटीबॉडी-युग्मित मोतियों में स्थानांतरित करें और एक रोटेटर डिवाइस का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 14-18 घंटे (रात भर) के लिए रोटेशन (10 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट करें।

3. एमएचसी पेप्टाइड्स के क्षालन (दिन 2)

नोट: Polypropylene स्तंभ MHC-पेप्टाइड परिसरों के क्षालन की अनुमति देता है, जबकि स्तंभ में मोतियों को बनाए रखने. 1% टीएफए (ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड) के साथ अम्लीय क्षालन से पहले और बाद में मोतियों से घिरे एमएचसी-पेप्टाइड्स परिसरों के अनुपात का मूल्यांकन करने के लिए, प्रोटोकॉल के दौरान महत्वपूर्ण चरणों में लिए गए एलीकोट के साथ एक पश्चिमी धब्बा करना संभव है (संकेत वैकल्पिक देखें)। चित्रा 3 में दिखाए गए पश्चिमी ब्लोटिंग से 1% टीएफए के साथ अम्लीय क्षालन के बाद एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के संवर्धन का पता चलता है। इस अंश में संकेत की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है कि क्षालन चरण सफल नहीं था। ध्यान दें कि मोतियों के लिए अनबाउंड एमएचसी-पेप्टाइड्स कॉम्प्लेक्स के अनुपात का मूल्यांकन चरण 3.1.6 में वर्णित एलीकोट का उपयोग करके पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा समानांतर रूप से भी किया जा सकता है।

  1. एंटीबॉडी युग्मित-मोतियों से एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों का क्षालन
    1. Polypropylene स्तंभ के नीचे ढक्कन निकालें, polypropylene स्तंभ रैक पर स्तंभ जगह और के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए नीचे एक खाली कंटेनर स्थापित करें।
      नोट:: प्रति नमूना एक स्तंभ की आवश्यकता है।
    2. बफर ए के 10 मिलीलीटर के साथ पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम को कुल्ला करें और इसे गुरुत्वाकर्षण द्वारा नाली दें। यदि तरल क्षालन की प्रवाह गति बहुत धीमी है, तो पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम के निचले सिरे को और काट दें।
    3. उपाय और कदम 2.5 से मोतियों-lysate मिश्रण (~ 2 mL) इकट्ठा और इसे polypropylene स्तंभ में स्थानांतरित.
    4. (वैकल्पिक) पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए 20 μL (या कुल मात्रा में से 1/100) का एक एलीकोट लें और तुरंत फ्रीज करें। यह अंश मोतियों के साथ इनक्यूबेट किए गए कुल एमएचसी-पेप्टाइड्स परिसरों से मेल खाता है।
    5. तरल मिश्रण को गुरुत्वाकर्षण से बाहर निकलने दें।
    6. (वैकल्पिक) इकट्ठा और प्रवाह के माध्यम से उपाय और पश्चिमी blotting के लिए 20 μL (या कुल मात्रा में से 1/100) का एक ऐलीकोट ले लो और तुरंत फ्रीज. यह अंश अवशिष्ट अनबाउंड एमएचसी-पेप्टाइड्स कॉम्प्लेक्स का प्रतिनिधित्व करता है।
    7. जितना संभव हो सके मोतियों-लिसेट मिश्रण को पुनर्प्राप्त करने के लिए, बफर ए के 1 एमएल के साथ चरण 3.1.3 से ट्यूब को कुल्ला करें और इसे पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में स्थानांतरित करें।
    8. बफर ए के 10 मिलीलीटर जोड़कर polypropylene स्तंभ में बनाए रखा मोतियों धो. वाशिंग बफर गुरुत्वाकर्षण से बचने दें।
    9. बफर बी के 10 मिलीलीटर, बफर ए के 10 एमएल और फिर बफर सी के 10 एमएल के साथ धोने के चरण को दोहराएं।
    10. रैक से polypropylene स्तंभ निकालें और यह एक नई 2.0 mL microcentrifuge ट्यूब के शीर्ष पर जगह है. स्तंभ और ट्यूब को हाथ से एक साथ पकड़ो।
    11. पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में 1% टीएफए के 300 μL जोड़ें और 5 बार ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके मोतियों को मिलाएं।
      नोट: मोतियों polypropylene स्तंभ में बनाए रखा जाएगा, और MHC-बाध्य पेप्टाइड्स 2.0 mL microcentrifuge ट्यूब में elute जाएगा।
    12. एक नई 2.0 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में eluate स्थानांतरण. चरण 3.1.11 को दोहराएं और 2 eluates पूल करें (MHC-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स वाले eluates को कुल 600 μL के अनुरूप होना चाहिए और चरण 3.2.4 पर उपयोग किया जाएगा)।
    13. (वैकल्पिक) पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए 6 μL (या कुल मात्रा का 1/100) का एक एलीकोट एकत्र करें और तुरंत फ्रीज करें। यह अंश एमएचसी-पेप्टाइड्स परिसरों से मेल खाता है जो मोतियों से अलग होते हैं।
  2. MHC पेप्टाइड्स का विलवणीकरण और क्षालन
    नोट: Desalting और MHC पेप्टाइड्स चरणों के क्षालन एक 2.0 mL microcentrifuge ट्यूब पर C18 स्तंभ स्थापित करके किया जा सकता है। एक बेहतर फिट के लिए, C18 कॉलम और 2.0 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के बीच निर्माता द्वारा प्रदान किए गए एनील्स स्थापित करें। इस प्रोटोकॉल में, एक C18 स्तंभ का उपयोग 5-200 μL (6-60 μg) की मात्रा क्षमता के साथ किया जाता है। सभी चरणों को आरटी पर किया जाता है।
    1. C18 स्तंभ के शीर्ष पर मेथनॉल के 200 μL जोड़ें, फिर 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
    2. C18 कॉलम के शीर्ष पर 80% ACN (acetonitrile)/0.1% TFA का 200 μL जोड़ें, फिर 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
    3. C18 कॉलम के शीर्ष पर 0.1% TFA का 200 μL जोड़ें, फिर 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
    4. C18 स्तंभ के शीर्ष पर चरण 3.1.12 से MHC-पेप्टाइड परिसरों के 200 μL लोड करें। 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से छोड़ दें।
    5. चरण 3.2.4 को दो बार दोहराएँ जब तक कि पूर्ण वॉल्यूम लोड नहीं किया गया है। ध्यान दें कि MHC पेप्टाइड्स C18 स्तंभ में बनाए रखा जाता है।
    6. C18 कॉलम में 0.1% TFA का 200 μL जोड़ें, फिर 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
    7. C18 स्तंभ को एक नए 2.0 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 28% ACN/ 0.1% TFA के 150 μL जोड़कर C18 स्तंभ से Elute MHC पेप्टाइड्स।
    8. 3 मिनट के लिए 1546 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. एक नई 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से स्थानांतरण। सावधान रहें कि प्रवाह के माध्यम से छोड़ ना दें; इसमें पृथक एमएचसी वर्ग I या II पेप्टाइड्स शामिल हैं।
    10. 450 μL की कुल मात्रा के लिए दो बार चरण 3.2.7-3.2.9 दोहराएँ।
    11. 450 μL eluate (शुद्ध MHC वर्ग I या II पेप्टाइड्स) को -20 °C पर फ्रीज करें जब तक कि नमूनों का विश्लेषण एलसी-MSMS द्वारा नहीं किया जाता है।
    12. एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण से पहले, चरण 3.2.11 से शुद्ध एमएचसी वर्ग I या II पेप्टाइड्स को 2 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस के प्रीसेट के साथ एक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सूखापन के लिए वाष्पित किया जाता है, वैक्यूम स्तर: 100 mTorr और वैक्यूम रैंप: 5।
      नोट: जमे हुए नमूनों का वाष्पीकरण अत्यधिक कुशल है। सूखे पेप्टाइड्स को विश्लेषण तक फिर से जमे हुए किया जा सकता है।

4. एलसी-एमएस / एमएस द्वारा एमएचसी कक्षा I और II पेप्टाइड्स की पहचान

नोट: एक उच्च प्रदर्शन Orbitrap और उच्च संकल्प चतुर्भुज समय की उड़ान द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर 6 का उपयोग कर MHC वर्ग I और II immunopeptidome का विश्लेषण करें। निम्नलिखित जानकारी केवल एक संकेत के रूप में दी गई है, इस बात को ध्यान में रखते हुए कि विभिन्न मौजूदा अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण विभिन्न परिचालन मानकों के अनुसार काम करते हैं। चरणों की एक संक्षिप्त रूपरेखा नीचे चर्चा की गई है:

  1. 4% फॉर्मिक एसिड (एफए) के 50 μL में सूखे नमूनों (चरण 3.2.12 से) को घुलनशील करें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 16 μL के तीन इंजेक्शन लोड करें और एक घर-निर्मित उलट-चरण कॉलम (150-μm i.d. 250 मिमी लंबाई तक, बृहस्पति 3 μm C18 300 Å) पर 5% -30% ACN-0.1% FA से एक ढाल के साथ अलग करें और एक एमएस से जुड़े नैनो-प्रवाह UHPLC पर 600 nL / मिनट प्रवाह दर।
  3. 120000 के एक संकल्प पर प्रत्येक पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रम प्राप्त करें, इंजेक्शन समय के लिए स्वचालित मोड के साथ 4 x 105 का एक एजीसी और स्पेक्ट्रा का उपयोग करके अग्रानुक्रम-एमएस (एमएस-एमएस) का उपयोग करके अधिकतम 3 एस के लिए सबसे प्रचुर मात्रा में गुणा चार्ज किए गए अग्रदूत आयनों पर।
    नोट: अग्रानुक्रम-एमएस प्रयोगों को 30% की टक्कर ऊर्जा पर उच्च-ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) का उपयोग करके किया जाता है, 30,000 का रिज़ॉल्यूशन, 1.5 x 105 का एजीसी, और 300 एमएस का इंजेक्शन समय।
  4. माउस और मानव डेटाबेस (UniProtKB / Swiss-Prot (2019_09)) का उपयोग करके एक प्रोटिओमिक्स एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (जैसे, PEAKS X) का उपयोग करके तीन इंजेक्शन / नमूने से डेटा फ़ाइलों को संसाधित करें।
  5. एंजाइम पैरामीटर के लिए 'अनिर्दिष्ट एंजाइम पाचन' का चयन करें, और क्रमशः अग्रदूत और टुकड़ा आयनों पर बड़े पैमाने पर सहिष्णुता के लिए 10 पीपीएम और 0.01 डीए।
    नोट: चर संशोधनों deamidation (NQ) और ऑक्सीकरण (एम) हैं। अन्य सभी खोज पैरामीटर डिफ़ॉल्ट मान हैं। अंतिम पेप्टाइड सूचियों को 80% के एएलसी का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाता है और प्रोटिओमिक्स एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 1% की झूठी खोज दर (एफडीआर) के साथ।

5. immunopeptidomics डेटा का विज़ुअलाइज़ेशन

नोट: एमएस द्वारा उत्पन्न इम्युनोपेप्टिडोमिक्स डेटा की गुणवत्ता का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही में वर्णित 22,23 है। डेटा की कल्पना करने और उनकी समग्र गुणवत्ता, संरचना और एमएचसी-विशिष्टता का आकलन करने के लिए, MhcVizPipe (MVP) सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग किया जा सकता है।

  1. Caron Lab GitHub website24 पर उपलब्ध MVP सॉफ़्टवेयर को स्थापित करने और चलाने के लिए सभी निर्देशों और संबंधित दस्तावेज़ों का पालन करें।
    नोट: MVP नमूना गुणवत्ता, संरचना, और MHC-विशिष्टता का एक तेजी से और समेकित दृश्य प्रदान करता है। MVP अच्छी तरह से स्थापित immunopeptidomics एल्गोरिदम (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26, और GibbsCluster27) के उपयोग को समानांतर करता है और HTML (HyperText Markup Language) प्रारूप में संगठित और आसानी से समझने वाली रिपोर्ट उत्पन्न करता है। रिपोर्ट पूरी तरह से पोर्टेबल हैं और एक आधुनिक वेब ब्राउज़र के साथ किसी भी कंप्यूटर पर देखा जा सकता है। HTML रिपोर्ट के उदाहरणों के लिए अनुपूरक डेटा 1-4 देखें.

Representative Results

एमएस द्वारा इम्युनोपेप्टिडोम्स के विश्लेषण के लिए एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों को अलग करने के लिए सामान्य वर्कफ़्लो को चित्र 1 में चित्रित किया गया है। एंटीबॉडी (चित्रा 2) (Y3 एंटी-H2Kb एंटीबॉडी का उपयोग करके) की मोतियों-बाध्यकारी दक्षता के सत्यापन के लिए प्रतिनिधि परिणाम और मोतियों से MHC-पेप्टाइड परिसरों की क्षालन दक्षता (चित्रा 3) (W6/32 एंटी-एचएलए-एबीसी एंटीबॉडी का उपयोग करके) दिखाए गए हैं। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण assays21 को ईएल 4 सेल (H2Kb और H2Db) और JY सेल (एचएलए-एबीसी) प्रति एमएचसी वर्ग I अणुओं की पूर्ण संख्या को मापने के लिए भी लागू किया गया था, जैसा कि चित्र 4 ए में दिखाया गया है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके परिणामों की अंतर- और अंतर-व्यक्तिगत पुनरुत्पादकता को चित्र 4B-E में दिखाया गया है। प्रतिनिधि परिणाम एमएचसी वर्ग I पेप्टाइड्स के लिए दिखाए जाते हैं जो 1 x 108 EL4 कोशिकाओं और 1 x 108 JY कोशिकाओं से पहचाने जाते हैं। परिणाम दो अलग-अलग प्रयोगशाला सदस्यों (उपयोगकर्ता 1 और उपयोगकर्ता 2) से उत्पन्न किए गए थे। उपयोगकर्ता 1 के लिए, EL4 और JY कोशिकाओं से पता लगाए गए MHCI-विशिष्ट पेप्टाइड्स की औसत संख्या क्रमशः 1341 और 6361 थी; उपयोगकर्ता 2, 1933 और 7238 के लिए, क्रमशः (चित्रा 4B, D)। तीन अलग-अलग जैविक प्रतिकृतियों /प्रयोगों में पाए गए पेप्टाइड्स की संख्या के लिए भिन्नता का औसत गुणांक (सीवी) 1.9% -11% (चित्रा 4 बी, डी) से भिन्न होता है। यद्यपि तीन अलग-अलग प्रयोगों में पाए गए पेप्टाइड्स की संख्या के लिए सीवी अपेक्षाकृत छोटे थे, पेप्टाइड्स की पहचान काफी भिन्न थी (चित्रा 4 सी, ई)। दरअसल, प्रतिनिधि वेन आरेख ों से पता चलता है कि पेप्टाइड्स का अनुपात जो तीन जैविक प्रतिकृतियों में पाया गया था, 39% (उपयोगकर्ता 2, EL4 कोशिकाओं) से लेकर 63% (उपयोगकर्ता 1, JY कोशिकाओं) (चित्रा 4C, E और पूरक तालिका 2) तक था।

एमवीपी सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न हीटमैप्स ने NetMHCpan सुइट टूल्स 25,26,28 का उपयोग करके पहचाने गए पेप्टाइड्स की MHC बाध्यकारी ताकत की भविष्यवाणी की। दो गिब्सक्लस्टर रूटीन विकल्प, जिन्हें 'अनसुरेटेड गिब्सक्लस्टर' और 'एलील-स्पेसिफिक गिब्सक्लस्टर' कहा जाता है, एमवीपी द्वारा एमएचसी पेप्टाइड-बाइंडिंग रूपांकनों को निकालने के लिए भी किया जाता है। ध्यान दें कि एमवीपी की सीमाएं हैं; इसका प्राथमिक लक्ष्य एलील-विशिष्ट रूपांकनों को निकालना और अत्यधिक सटीक तरीके से पेप्टाइड्स को एनोटेट करना नहीं है, बल्कि नमूनों की समग्र गुणवत्ता, संरचना और एमएचसी-विशिष्टता पर एक पक्षी की आंखों का दृश्य प्रदान करना है।

माउस MHC वर्ग I (H2Db और H2Kb) के लिए EL4 कोशिकाओं (चित्रा 5A; ऊपरी पैनलों और पूरक डेटा 1) में पेप्टाइड्स, एक प्रतिनिधि हीटमैप से पता चलता है कि सभी 8-12-mer पेप्टाइड्स का 89% मजबूत बाइंडर्स (SB: NetMHCpan %Rank <0.5) या कमजोर बाइंडर्स (WB: NetMHCpan %Rank <2) H2Db या H2Kb अणुओं के लिए होने की भविष्यवाणी की जाती है। 8-12-mer पेप्टाइड्स से उत्पन्न अनुक्रम क्लस्टर H2Db (P5 पर शतावरी और P9 में ल्यूसिन) और H2Kb (P5 पर फेनिलएलनिन और P8 पर ल्यूसिन) (चित्रा 5) (चित्रा 5) 29 के लिए रिपोर्ट किए गए लोगो के साथ सामंजस्य में हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि एक तीसरा प्रमुख आकृति (P7 पर हिस्टिडीन और P9 में ल्यूसीन) के साथ-साथ अतिरिक्त 'कलाकृतियों' रूपांकनों को M1 एंटीबॉडी (पूरक डेटा 1) का उपयोग करके देखा जा सकता है। वास्तव में, एम 1 एंटीबॉडी को गैर-शास्त्रीय क्यूए 2 अणु के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया करने के लिए जाना जाता है, और इसलिए, क्यूए 2-संबद्ध पेप्टाइड्स को एमएस (पूरक डेटा 1) द्वारा भी पता लगाया जाता है। यहां, सादगी के लिए, चित्रा 5 ईएल 4 कोशिकाओं में व्यक्त दो शास्त्रीय एच 2 बी एलील (यानी, एच 2 डी बी या एच 2 केबी) के लिए अच्छी तरह से स्थापित पेप्टाइड बाध्यकारी रूपांकनों को दिखाने पर केंद्रित है।

जेवाई कोशिकाओं में मानव एचएलए वर्ग I (एचएलए-एबीसी) पेप्टाइड्स के लिए (चित्रा 5 ए; निचले पैनल और पूरक डेटा 2), एक प्रतिनिधि हीटमैप से पता चलता है कि सभी 8-12-मेर पेप्टाइड्स का 97% एचएलए-ए * 0201, -बी * 0702 या -सी * 0702 के लिए एसबी या डब्ल्यूबी होने की भविष्यवाणी की जाती है। पेप्टाइड्स को एचएलए-ए * 0201 और -बी * 0702 के लिए पेप्टाइड बाइंडिंग रूपांकनों की कल्पना करने के लिए क्लस्टर किया गया था। एचएलए-सी * 0702 के लिए बाध्यकारी आकृति चित्र 5 ए में नहीं दिखाया गया है क्योंकि सी * 0702 एलील में अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति स्तर है। इसलिए बहुत कम सी * 0702 पेप्टाइड्स को अलग किया गया था और एक प्रतिनिधि सी * 0702 आकृति उत्पन्न करने के लिए पहचाना गया था। ध्यान दें कि C * 0702 आकृति को अन्य अध्ययन30,31,32 या NetMHCpan 4.1 Motif Viewer website33 से विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है।

जेवाई कोशिकाओं में मानव एचएलए वर्ग II (एचएलए-डीआर) पेप्टाइड्स के लिए (चित्रा 5 बी; ऊपरी पैनल और पूरक डेटा एस 3), एक प्रतिनिधि हीटमैप से पता चलता है कि सभी 9-22-मेर पेप्टाइड्स का 70% एचएलए-डीआरबी 1 * 0404 और -DRB1 * 1301 के लिए एसबी या डब्ल्यूबी होने की भविष्यवाणी की जाती है। इन दो एलील के लिए पेप्टाइड बाइंडिंग रूपांकनों को दिखाया गया है (चित्रा 5 बी)। ध्यान दें कि यहां दिखाए गए पेप्टाइड-बाइंडिंग रूपांकनों को हाल ही में HLA-DRB1 * 0404 और -DRB1 * 130134 के लिए रिपोर्ट किए गए लोगो के साथ पूर्ण सामंजस्य में नहीं हो सकता है। यह विसंगति MVP / NetMHCpan की वर्तमान अक्षमता को एचएलए वर्ग II एलील के लिए पेप्टाइड्स को ठीक से एनोटेट करने में असमर्थता पर प्रकाश डालती है जो कम विशेषता वाले होते हैं, जैसे कि एचएलए-DRB1 * 0404 और -DRB1 * 1301 जेवाई कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। कक्षा II पेप्टाइड बाइंडिंग रूपांकनों पर अतिरिक्त जानकारी अन्य अध्ययनों 34,35 और NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer website36 से पाई जा सकती है।

अंत में, माउस MHC वर्ग II (H2-IAD और H2-IEd) पेप्टाइड्स के लिए A20 कोशिकाओं (चित्रा 5B; निचले पैनलों और पूरक डेटा 4) में, एक प्रतिनिधि हीटमैप से पता चलता है कि सभी 9-22-mer पेप्टाइड्स का 87% H2-IAD या H2-IEd के लिए SB या WB होने की भविष्यवाणी की जाती है। इन दो एलील के लिए पेप्टाइड बाइंडिंग रूपांकनों की रिपोर्ट की गई लोगो 37 के साथ सामंजस्य में हैं।

नमूनों की समग्र गुणवत्ता और एमएचसी-विशिष्टता का आकलन करने के लिए एमवीपी सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न पूर्ण एचटीएमएल रिपोर्ट अनुपूरक डेटा 1-4 में उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एमएचसी वर्ग I और II पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए पूरी प्रक्रिया की योजनाबद्ध। (ए-बी) 100 मिलियन कोशिकाओं को 0.5% चैप्स बफर के साथ पैलेट और झूठ बोला जाता है। (C) सेल लिसेट को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और supernatant को CNBr-sepharose मोतियों में जोड़ा जाता है जो पहले से ही वांछित एंटीबॉडी के लिए युग्मित होता है और (D) 4 °C पर 14-18 h इनक्यूबेट किया जाता है(E) immunocapture के बाद, मोतियों को पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में स्थानांतरित कर दिया जाता है और धोया जाता है, और MHC-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स को 1% TFA समाधान के साथ अलग किया जाता है। (एफ) पेप्टाइड्स को एक सी 18 कॉलम का उपयोग करके डीसाल्ट और एल्यूट किया जाता है। (जी) बाद में, पेप्टाइड्स को गति वैक सुखाया जाता है और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाता है। (एच) पृथक एमएचसी कक्षा I और II पेप्टाइड्स की गुणवत्ता का मूल्यांकन स्वतंत्र रूप से उपलब्ध MhcVizPipe सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एचएलए उपप्रकारों के आधार पर किया जा सकता है। चित्र BioRender.com (NT22ZL8QSL) के साथ बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Coomassie जेल धुंधला एंटीबॉडी बाध्यकारी दक्षता को ट्रैक करने के लिए SEPHAROSE CNBr-सक्रिय मोतियों के लिए. समतुल्य मात्रा के एलीकोट को 12% एसडीएस-पेज जेल पर लोड किया गया था, जिसके बाद कूमासी ब्लू स्टेनिंग: मोतियों + एंटीबॉडी प्री-कपलिंग (1), युग्मन चरण (2) के बाद अनबाउंड एंटीबॉडी, युग्मन (3) के बाद अंतिम धोने के बाद supernatant, और एंटीबॉडी (4) के साथ युग्मित मोतियों। बाइंडिंग की दक्षता को H2Kb के प्रकाश और भारी श्रृंखलाओं की सिग्नल स्टेनिंग तीव्रता में महत्वपूर्ण कमी से सचित्र किया गया है जब मोतियों को युग्मन (लेन 1) से पहले एंटीबॉडी की तुलना में CNBr मोतियों के लिए सहसंयोजक रूप से बाध्य (लेन 4) किया जाता है। आंकड़ा पुनर्मुद्रित किया गया है और bioRxiv38 से अनुकूलित किया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एंटीबॉडी-युग्मित CNBr-सक्रिय मोतियों से अम्लीय क्षालन के बाद एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों को ट्रैक करने के लिए पश्चिमी ब्लोटिंग। प्रोटोकॉल (कुल मापा मात्रा का 1/100) में इंगित किए गए चरणों से लिए गए एलीकोट को 12% एसडीएस-पेज जेल पर लोड किया गया था और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया था: मोतियों + लिसेट के बाद इम्यूनोकैप्चर और अंतिम धोने (ए); पिछले धोने (बी) और एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के supernatant मोतियों (सी) से eluted. एंटी-एचएलए-एबीसी हेवी चेन एंटीबॉडी (Abcam, #ab 70328, 1: 5000) का उपयोग करके (सी) में एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के मजबूत पता लगाने के संकेत ने अम्लीय क्षालन के बाद एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के अलगाव की पुष्टि की। ध्यान दें कि एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के अनुपात का आकलन करना संभव है जो चरण 3.1.6 से प्रवाह-थ्रू को इकट्ठा करके एंटीबॉडी युग्मित मोतियों द्वारा कैप्चर नहीं किए गए थे। एक एलीकोट को पश्चिमी धब्बा में जोड़ा जा सकता है (इस जेल पर नहीं दिखाया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जेवाई और ईएल 4 कोशिकाओं से एमएचसी वर्ग I पेप्टाइड्स की पहचान। (ए) हिस्टोग्राम प्रति ईएल 4 सेल सेल सेल और प्रति एचएलए-एबीसी अणुओं की सेल सतह एच 2 डी बी और एच 2 केबी अणुओं की पूर्ण संख्या को दर्शाता है। परिमाणीकरण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। माध्य की माध्य और मानक त्रुटि तीन जैविक प्रतिकृतियों से प्राप्त की गई थी। (B, D) हिस्टोग्राम दो स्वतंत्र उपयोगकर्ताओं द्वारा पहचाने गए एमएचसी वर्ग I पेप्टाइड्स के माध्य की औसत संख्या और मानक विचलन दिखा रहा है (USER_1 [U1] और USER_2 [U2])। माउस EL4 कोशिकाओं (B) और मानव JY कोशिकाओं (D) से पता लगाए गए MHC वर्ग I पेप्टाइड्स के माध्य की माध्य संख्या और मानक विचलन दिखाया गया है। तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों में भिन्नता (सीवी) के गुणांक इंगित किए गए हैं। (C, E) वेन आरेख पेप्टाइड्स की संख्या को दर्शाते हैं जो तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों में दो स्वतंत्र उपयोगकर्ताओं (U1 और U2) द्वारा EL4 (C) और JY कोशिकाओं (E) में पुन: स्थापित किए गए थे। चित्रा 4A को पुनर्मुद्रित किया गया है और bioRxiv38 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमवीपी सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग करके इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स डेटा का विज़ुअलाइज़ेशन। माउस और मानव (ए) एमएचसी वर्ग I और (बी) एमएचसी वर्ग II पेप्टाइड्स का डेटा विश्लेषण। प्रतिनिधि बाध्यकारी आत्मीयता heatmaps (बाएं पैनल) और पेप्टाइड बाध्यकारी रूपांकनों (सही पैनलों) दिखाया गया है। हीटमैप रंग NetMHCpan 4.1 (%rank) द्वारा भविष्यवाणी की गई MHC बाइंडिंग आत्मीयता का प्रतिनिधित्व करते हैं। मजबूत बाइंडर लाल हैं (%rank <0.5), कमजोर बाइंडर्स नीले हैं (%rank <2) और गैर-बाइंडर पीले हैं (%Rank >2). 8-12mer पेप्टाइड्स (ए) और 9-22mer पेप्टाइड्स (बी) का अनुपात (%) जो एसबी या डब्ल्यूबी हैं, कोष्ठक में इंगित किया गया है। पेप्टाइड बाइंडिंग रूपांकनों को एमवीपी द्वारा 'एलील-विशिष्ट गिब्सक्लस्टर' विकल्प का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। इन प्रतिनिधि परिणामों को 1 x 108 कोशिकाओं से प्राप्त किया गया था और निम्नलिखित एंटीबॉडी और सेल लाइनों का उपयोग करके: माउस एमएचसी वर्ग I पेप्टाइड्स के लिए एम 1 एंटीबॉडी और ईएल 4 कोशिकाएं; मानव एमएचसी वर्ग I पेप्टाइड्स के लिए W6/32 एंटीबॉडी और जेवाई कोशिकाएं; माउस एमएचसी वर्ग द्वितीय पेप्टाइड्स के लिए एम 5 एंटीबॉडी और ए 20 कोशिकाएं; मानव एमएचसी वर्ग द्वितीय पेप्टाइड्स के लिए एल 243 एंटीबॉडी और जेवाई कोशिकाएं। MVP सॉफ़्टवेयर द्वारा जनरेट की गई पूर्ण HTML रिपोर्ट तक पहुँचने के लिए अनुपूरक डेटा 1-4 देखें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक डेटा 1-4: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक डेटा 1: पेप्टाइड्स से एमवीपी सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न HTML रिपोर्ट जो M1 एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 x 108EL4 कोशिकाओं से अलग किए गए थे। तीन जैविक प्रतिकृतियों को दिखाया गया है। यह रिपोर्ट चित्र 4 और चित्रा 5 से संबंधित है और प्रतिनिधि पेप्टाइड्स अनुपूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं।

अनुपूरक डेटा 2: पेप्टाइड्स से एमवीपी सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न HTML रिपोर्ट जो W6/32 एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 x 108JY कोशिकाओं से अलग-थलग थी। तीन जैविक replates दिखाए गए हैं। यह रिपोर्ट चित्र 4, और चित्रा 5 से संबंधित है, और प्रतिनिधि पेप्टाइड्स अनुपूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं।

अनुपूरक डेटा 3: पेप्टाइड्स से एमवीपी सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न HTML रिपोर्ट जो L243 एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 x 108JY कोशिकाओं से अलग-थलग थी। यह रिपोर्ट चित्र 5 से संबंधित है, और प्रतिनिधि पेप्टाइड्स अनुपूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं।

अनुपूरक डेटा 4: पेप्टाइड्स से एमवीपी सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न HTML रिपोर्ट जो M5 एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 x 108A20 कोशिकाओं से अलग किए गए थे। यह रिपोर्ट चित्र 5 से संबंधित है, और प्रतिनिधि पेप्टाइड्स अनुपूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं।

अनुपूरक तालिका 1: बफ़र्स की सूची। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी बफ़र्स के लिए व्यंजनों का वर्णन किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: H2Db / Kb, HLA-ABC, HLA-DR, और H2-IAD / IEd से जुड़े पेप्टाइड्स की प्रतिनिधि सूची। इस तालिका में माउस EL4 और A20 सेल लाइनों से अलग किए गए प्रतिनिधि MHC वर्ग I और II पेप्टाइड्स की सूचियां शामिल हैं, क्रमशः, और मानव JY सेल लाइन से HLA वर्ग I और II। ये डेटा ProteomeXchange (PXD028633) पर जमा किए गए हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

डेटा उपलब्धता:

इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले डेटासेट को ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633 पर जमा किया गया था।

Discussion

दो माउस सेल लाइनों (EL4 और A20), एक मानव सेल लाइन (JY), और पांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी [M1 (एंटी-H2Db / Kb), Y3 (एंटी-H2Kb), M5 (एंटी-H2-IAD / IEd), W6/32 (एंटी-एचएलए-एबीसी), और L243 (एंटी-एचएलए-डीआर)] का परीक्षण और सत्यापन इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में किया गया था और उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टोमिक्स डेटा प्रदान करते हैं। अन्य एंटी-एचएलए एंटीबॉडी उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, एंटी-एचएलए-ए 2 बीबी 7.2) लेकिन यहां परीक्षण नहीं किया गया था। ध्यान दें कि W6/32 एंटीबॉडी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और क्षेत्र में सबसे अधिक स्थापित एंटीबॉडी; यह मनुष्यों में सभी एचएलए-एबीसी अणुओं द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड्स के अलगाव को सक्षम बनाता है और पहले विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं द्वारा विभिन्न जैविक स्रोतों जैसे कि ताजा या जमे हुए ऊतकों 8,39, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल 40, बायोप्सी 41, 41, ऑटोप्सी 43 और प्लाज्मा नमूने 44,45 से काम करने के लिए सूचित किया गया था।

पूरे प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले नए समाधानों की तैयारी महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, कांच की बोतलों में ताजा अम्लीय समाधानों का उपयोग एमएस द्वारा विश्लेषण किए गए नमूनों के बाद के संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जब प्रोटोकॉल पहली बार और / या एक नए एंटीबॉडी के साथ किया जाता है, तो यह आकलन करना महत्वपूर्ण है कि एंटीबॉडी वास्तव में नीले कूमासी जेल का उपयोग करके CNBr Sepharose मोतियों के साथ युग्मित है। एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के इम्युनोकैप्चर के बाद एंटीबॉडी युग्मित मोतियों के धोने के चरण भी गैर-एमएचसी पेप्टाइड्स के संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अंत में, 1% टीएफए के साथ एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों के क्षालन और एसीएन 28% / 0.1% एफए के साथ सी 18 कॉलम से पेप्टाइड्स के क्षालन के बाद एल्यूएट्स को त्यागने के लिए विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है।

साहित्य में उपलब्ध मौजूदा प्रोटोकॉल अलगाव प्रक्रिया के अंत में पेप्टाइड्स को और शुद्ध करने के लिए अतिरिक्त चरणों का वर्णन करते हैं, उदाहरण के लिए, विभिन्न तरीकों से पेप्टाइड फ्रैक्शनेशन 14,46 या 10-30 केडीए फिल्टर 13,47 का उपयोग करके अल्ट्राफिल्ट्रेशन। वर्तमान प्रोटोकॉल उन अतिरिक्त चरणों पर विवरण प्रदान नहीं करता है और उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टिओमिक्स डेटा प्रदान करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, इस तरह के चरणों को गैर-विशेषज्ञों द्वारा पेप्टाइड अलगाव प्रक्रिया को और अधिक अनुकूलित करने के लिए संशोधित करने और समस्या निवारण करने के लिए विचार किया जा सकता है।

मोतियों के प्रकार और अम्लीय क्षालन बफर का प्रकार जो मोतियों से एमएचसी-कॉम्प्लेक्स को दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है, को समस्या निवारण के लिए भी संशोधित किया जा सकता है13,14,15,16,17,18,19। इस संबंध में, सेफ्रोज सीएनबीआर-सक्रिय मोती आम तौर पर एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु होते हैं क्योंकि वे विभिन्न प्रकार के एंटीबॉडी के साथ बंधन के मामले में लचीलापन दिखाने के अलावा अपेक्षाकृत सस्ती होती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, सेफ्रोज सीएनबीआर-सक्रिय मोतियों को पांच अलग-अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी (यानी, एम 1, वाई 3, डब्ल्यू 6 / 32, एल 243, और एम 5) का उपयोग करके अपेक्षाकृत अच्छी तरह से प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया था। Sepharose CNBr-सक्रिय मोतियों के अलावा, प्रोटीन ए या जी या ए / जी सेफ्रोज 4 फास्ट फ्लो मोतियों को संभालना भी आसान है, और हालांकि अपेक्षाकृत अधिक महंगा है, समान परिणाम उत्पन्न कर सकता है। विचार करने के लिए एक और कारक प्रोटीन ए या जी के लिए एंटीबॉडी की आत्मीयता है। इसके अलावा, सेफ्रोज चुंबकीय मोतियों का उपयोग करना भी बहुत आसान है लेकिन अपेक्षाकृत महंगा है। गैर-विशेषज्ञों द्वारा चुने गए मोतियों के प्रकार के स्वतंत्र रूप से, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में एलीकोट एकत्र करने और मोतियों के लिए एंटीबॉडी की बाध्यकारी दक्षता को ट्रैक करने के लिए नीले कूमासी-दाग वाले एसडीएस-पेज जैल करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है।

एमएचसी पेप्टाइड्स अलगाव की सफलता को प्रभावित करने वाला एक और महत्वपूर्ण कारक मोतियों से एमएचसी-पेप्टाइड परिसरों को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अम्लीय क्षालन बफर के प्रकार को संदर्भित करता है। विभिन्न बफ़र्स की सूचना दी गई है जिसमें 0.1%, 1% या 10% TFA, 0.2% FA और 10% एसिटिक एसिड शामिल हैं। 1% टीएफए परीक्षण किए गए सभी एंटीबॉडी के लिए काम करने वाला क्षालन बफर था। इस चरण को एमएचसी पेप्टाइड्स को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एमएचसी अणुओं के खिलाफ पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा भी पता लगाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

एसिटोनाइट्राइल (एसीएन) और / या ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए) वाले सभी बफर आक्रामक होते हैं और प्लास्टिक के संपर्क में आने पर प्लास्टिसाइज़र जैसे छोटे आणविक और बहुलक पदार्थों के साथ नमूने के संदूषण का कारण बन सकते हैं। इस तरह के मुद्दों से बचने के लिए, एक कार्बनिक विलायक और / या टीएफए युक्त सभी समाधान दैनिक रूप से ताजा तैयार किए जाते हैं और उपयोग तक कांच की बोतल में संग्रहीत किए जाते हैं। अधिकांश चरण प्रोटीन लोबिंद प्लास्टिक ट्यूब में किए जाते हैं। इन ट्यूबों को विशेष रूप से प्रोटिओमिक्स के लिए डिज़ाइन किया गया है और उच्चतम गुणवत्ता, कुंवारी पॉलीप्रोपाइलीन से बना है जो बायोसाइड्स, प्लास्टिसाइज़र और लेटेक्स से मुक्त है। वे पर्ची एजेंटों के उपयोग के बिना अनुकूलित, अत्यधिक पॉलिश किए गए मोल्ड्स के साथ भी उत्पादित होते हैं। उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स डेटा की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए इन सावधानियों पर विचार करना महत्वपूर्ण है।

एंटीबॉडी एमएचसी-बाउंड पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है। W6/32 एंटीबॉडी मनुष्यों में सभी एचएलए-एबीसी वर्ग I अणुओं द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड्स के अलगाव को सक्षम बनाता है और क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला और स्थापित एंटीबॉडी है। Uncharacterized मानव सेल लाइनों या biospecimens के उच्च संकल्प एचएलए टाइपिंग W6/32 एंटीबॉडी के आवेदन पर एक आवश्यकता नहीं है, लेकिन फिर भी डेटा व्याख्या की सुविधा के लिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए अनुशंसित है48. एचएलए / एमएचसी टाइपिंग जानकारी को कई सेल लाइनों और माउस मॉडल 49 के लिए सार्वजनिक संसाधनों में भी पाया जा सकता है। W6/32 एंटीबॉडी के अलावा, चार अन्य एंटीबॉडी (M1, M5, Y3, और L243) जो इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में परीक्षण और मान्य किए गए थे, सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, पिछले इम्युनोपेप्टिडोमिक्स अध्ययनों में रिपोर्ट किए गए कई अन्य एंटीबॉडी को समुदाय द्वारा बड़े पैमाने पर नहीं अपनाया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं या हाइब्रिडोमा सेल लाइनों की संस्कृति के माध्यम से उपलब्ध हैं, जो अपेक्षाकृत महंगा है।

एमएचसी-बाउंड पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए एक और महत्वपूर्ण सीमा आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा है। आवश्यक राशि कोशिका की सतह पर एमएचसी अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर के व्युत्क्रमानुपाती है, जिसे फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 4 ए) द्वारा परिमाणित किया जा सकता है। एमएचसी अणुओं के उच्च अभिव्यक्ति स्तर (जैसे, डेंड्राइटिक कोशिकाओं और सामान्य रूप से हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं) को दिखाने वाली कोशिकाएं आमतौर पर उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स डेटा उत्पन्न करती हैं। विशेषज्ञ प्रयोगशालाएं 50 मिलियन कोशिकाओं के रूप में कम से कम उपयोग करती हैं50, लेकिन गैर-विशेषज्ञों के लिए 100 मिलियन से 1 बिलियन कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है। ऊतक बायोप्सी (<13 मिलीग्राम)41, 42,43, ऑटोप्सी 44, और प्लाज्मा 45,46 नमूनों के उपयोग की भी सूचना दी गई थी, लेकिन गैर-विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं के लिए चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं। इसके अलावा, एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स की कुल संख्या की उम्मीद स्थापित सेल लाइनों के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित है (यहां, सेल लाइन और एंटीबॉडी के आधार पर ~ 2000 और ~ 10000 पेप्टाइड्स के बीच), लेकिन स्वाभाविक रूप से प्रस्तुत पेप्टाइड्स की पूर्ण मात्रा जो तकनीक द्वारा कुशलतापूर्वक नीचे खींची जाती है, बहस बनी रहती है। दरअसल, पिछले अध्ययनों का अनुमान है कि अलगाव प्रक्रिया की दक्षता पेप्टाइड-निर्भर है और 0.5% -2% 51 के रूप में कम से हो सकती है। Immunopeptidomics में अन्य सीमाओं विधियों की reproducibility और NetMHCpan सुइट उपकरण की अक्षमता को सही ढंग से एमएचसी एलील है कि कम विशेषता वाले हैं करने के लिए पेप्टाइड्स एनोटेट करने के लिए कर रहे हैं। इस संबंध में, अपेक्षाकृत नए डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण एमएस विधियों के आगे के विकास और अनुप्रयोग 7,32,52, साथ ही साथ नए पेप्टाइड क्लस्टरिंग और एमएचसी पेप्टाइड बाइंडिंग भविष्यवाणी एल्गोरिदम 31,34,53,54 reproducibility और immunopeptidomics में पेप्टाइड एनोटेशन की सटीकता में सुधार की उम्मीद कर रहे हैं. इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स एमएस अधिग्रहण और एमएचसी से जुड़े पेप्टाइड्स के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के बारे में अन्य सीमाओं का सामना कर रहा है और कहीं और कवर किया गया है1,6,55।

W6/32 एंटीबॉडी का उपयोग करके मानव नमूनों से एचएलए-एबीसी-संबद्ध पेप्टाइड्स के अलगाव को अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और कई शोध समूहों द्वारा व्यापक रूप से लागू किया गया है, माउस एमएचसी वर्ग I- और II से जुड़े पेप्टाइड्स का अलगाव अपेक्षाकृत कम स्थापित है। इसलिए, माउस एमएचसी लिगेंड के अलगाव के लिए मजबूत प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां, हम क्रमशः C57BL / 6 और BALB / c मूल की दो माउस सेल लाइनों से MHC वर्ग I पेप्टाइड्स और MHC वर्ग II पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल M1 एंटीबॉडी का उपयोग करके कक्षा I H2Kb- और H2Db-संबद्ध पेप्टाइड्स के अलगाव को सक्षम बनाता है, साथ ही साथ M5 एंटीबॉडी का उपयोग करके कक्षा II H2-IAD और H2-IEd-संबद्ध पेप्टाइड्स भी। इस प्रकार, प्रसार और वर्तमान प्रोटोकॉल के आवेदन को विभिन्न माउस मॉडलों में बुनियादी और ट्रांसलेशनल इम्युनोपेप्टिडोमिक्स अनुसंधान की सुविधा प्रदान करनी चाहिए।

प्रोटोकॉल का उपयोग एक इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स वर्कफ़्लो को स्थापित करने और मानकीकृत करने के साथ-साथ नए प्रोटोकॉल को बेंचमार्क करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसे अनुकूलित किया जा सकता है और रक्त / प्लाज्मा से लेकर ताजा या जमे हुए ऊतक से लेकर एफएफपीई (फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड) तक के विभिन्न जैविक आव्यूहों में इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स स्क्रीनिंग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल इम्यूनोपेप्टिडोमिक्स में नमूना तैयारी प्रक्रिया के इंट्रा- और इंटर-लैबोरेटरी पुनरुत्पादकता को बढ़ावा देगा और इसलिए बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान में व्यापक आवेदन खोजने की उम्मीद है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम पियरे थिबाल्ट, एरिक Bonneil, Joël Lanoix, कैरोलीन कोटे (इम्यूनोलॉजी और कैंसर में अनुसंधान के लिए संस्थान, Université de Montréal) और एंथनी Purcell (मोनाश विश्वविद्यालय) को उनकी व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), कोल फाउंडेशन, CHU Sainte-Justine, और चार्ल्स-Bruneau फाउंडेशन, नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन, राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) और कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR) (# 174924) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64

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References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

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जैव रसायन अंक 176
Immunopeptidomics: माउस और मानव MHC कक्षा I का अलगाव- और द्वितीय-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए संबद्ध पेप्टाइड्स
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Sirois, I., Isabelle, M., Duquette,… More

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).

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