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Biology

烟草基因型对 烟碱性植物 的筛选

Published: April 15, 2022 doi: 10.3791/63054
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2Institute of Rural Development, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences

Summary

在这里，提出了一种方案，用于有效和准确地筛选幼苗中 烟叶植物 抗性的烟草基因型。这是精密育种以及分子机理研究的实用方法。

Abstract

由 卵菌黑芋引起的黑柄对烟草具有破坏性，这种病原体对许多茄科作物具有高度致病性。 P. nicotianae 很好地适应高温;因此，由于全球变暖，对这种病原体的研究在全世界的农业中变得越来越重要。耐 尼古丁酸的烟草植物品种通常通过接种由 尼古丁烷定 植的燕麦粒和监测疾病症状来筛查。然而，很难量化接种强度，因为在这种情况下，准确的接种至关重要。本研究旨在开发一种有效且可靠的方法来评估烟草对 烟酸假单胞菌感染的抵抗力。该方法已成功用于鉴定抗性品种，并通过实时荧光定量PCR证实了接种效率。本研究提出的抗性评价方法对于精密育种和分子机理研究具有高效实用性。

Introduction

P. nicotianae 对许多茄科作物具有破坏性。可引起烟草“黑柄”1、马铃薯叶面和块茎腐病2、番茄和甜椒冠腐病和根腐病3、枸杞领和根腐病4。 烟粉可 攻击烟草植物的所有部位，包括任何生长阶段的根部、茎和叶片5。该疾病最常见的症状是茎的黑色基底。根部最初可见为水浸泡，然后坏死，叶子显示大的圆形病变5。这种疾病可能对温室和田间的烟草植物造成毁灭性打击6。控制 尼古丁酸对虾 最实用、最经济的方法是使用抗性品种7。然而，需要有效的筛查方案来鉴定烟草种质收集中的 耐烟酸假单胞菌种质。

已经描述了各种鉴定方法来评估烟草中的 硝酸对虾 的耐药性7，8，9，10，11，12，13，14，15，16。一般而言，已使用三种主要方法鉴定 耐烟化原虫烟草基因型。第一种包括在含有 P. nicotianae 的培养皿上混合菌丝体和琼脂培养基。然后将菌丝体在室温下在黑暗中培养2周。将1L去离子水加入菌丝体中并匀浆30秒。接种物保持在冰上，直到需要。在植物的每一侧做两个孔（直径1厘米，深4-5厘米），并将10毫升的接种物倒入每个孔中。然后用周围的土壤填充孔洞，每天监测疾病发展2周8，10。

在第二种方法中，用病原体感染的牙签接种植物。对于这种方法，植物应在移植后约6周使用，并且最小高度应为30厘米。将高压灭菌的牙签放在含有 P. nicotianae 菌丝体的培养物的表面上。然后将培养皿在室温下在光照下储存7天。然后，使用定植的牙签接种植物。将牙签插入第四和第五节点之间的烟杆中。每天监测植物5天9，15。此方法不适用于小苗。由于接种物是病原体感染的牙签，因此无法精确控制接种强度。

最常用的方法涉及燕麦粒进行接种。在这种情况下，通过将500mL燕麦和300mL去离子水在121°C下高压灭菌1小时，每天一次，持续3天来制备燕麦谷物。然后，将燕麦粒加入病原体定植培养基中。用石蜡膜密封培养皿，并在25°C的光照下孵育7-12天。在盆栽土壤上形成四个独立的5厘米深的孔，距离每株植物4厘米，每个孔中放置一个病原体感染的燕麦粒。潜伏期根据第一个地上症状发生的时间确定7，11，12，13，14，15，16。该方法高效，适用于大规模电阻筛选。然而，这种方法的一个局限性是接种物是病原体感染的燕麦粒，因此接种强度无法精确控制。

然而，这里介绍的是一种更准确的方法，适用于生长室阻力评估。与其他方法相比，接种物为游动孢子悬浮液，因此接种强度可控且可调。由于本研究中的烟草植物是在没有土壤的情况下种植的，因此结果更容易观察到。此外，从土壤中取样植物根部总是会对根部造成损害，从而诱发一系列生理反应17。在这种方法中，由于植物在没有土壤的情况下种植，因此可以消除对根系损伤的干扰。综上所述，该方法对于分子机理研究和精密育种更为实用。使用该协议，通常在5天内获得数据，在单个实验中评估200多种植物。

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Protocol

1. 材料

  1. 获得烟草品种。
    注：本实验“Beinhart1000-1”（Beinhart 1000）（BH）和“Xiaohuangjin1025”（XHJ）来自中国烟草种质资源国家中期数据库。BH 具有耐药性，而 XHJ 对 尼古丁酸疟原虫 感染敏感16。中国农业科学院烟草研究所保存的 尼古丁酸猪对 偶种0的田间分离物在整个研究过程中用于所有接种。

2. 烟草种植基因型用于 烟酸对虾 抗性评价

  1. 将烟草种子与蛭石混合，并在灭菌的盆栽土壤上轻轻地播种。将花盆放入生长室中。在16小时的光照/ 8小时的黑暗光周期下保持25°C的恒定温度。
  2. 准备带有托盘和泡沫板的水培设备。种子发芽后，从盆栽土壤中刺出幼苗，用无菌去离子水轻轻洗根，然后将其移植到水培装置中。
  3. 将设备置于25°C的气候室中，在16小时的光照/ 8小时的黑暗光周期下24小时。
  4. 事先准备霍格兰营养液（表1）。将幼苗移植到带有Hoagland营养液（每株约125 mL）的水培装置中。
  5. 将设备置于25°C的气候室中，在16小时的光照/ 8小时黑暗的光周期下放置2周。

3. 烟生孢 子悬浮液的制备

  1. 准备燕麦片琼脂培养基。
    1. 称取 33 克燕麦片，转移到玻璃器皿中，加入 1，000 mL 无菌水。在电磁炉烤箱上煮沸。
    2. 燕麦片变粘后，通过一块无菌纱布过滤液体溶液。
    3. 将液体溶液倒入1，000 mL量筒中，并用无菌水将体积调节至1，000 mL。
    4. 将液体溶液倒入玻璃试剂瓶中，加入18克琼脂。摇匀并将混合物（燕麦片琼脂培养基）在121°C下高压灭菌15分钟。在室温下放置30分钟。
    5. 将约20毫升无菌的燕麦片琼脂培养基倒入每个培养皿中。将培养皿置于室温下，在菌丝体培养之前彻底冷却。
  2. 进行菌丝体修养。
    1. 事先准备1厘米直径的冲头和牙签，方法是在121°C下高压灭菌15分钟。
    2. 在 P. nicotianae 菌丝体琼脂培养物中打孔，制成圆形菌丝体垫。
    3. 挑选出菌丝体垫，将菌丝体面朝下放在燕麦片琼脂培养基上，并将菌丝体在25°C的黑暗中孵育14天。
  3. 准备 P. nicotianae zoospore suspension。
    1. 向每个菌丝培养（15 mL /培养皿）中加入0.1%KNO3 溶液，然后在4°C下培养20分钟以诱导孢子囊。
    2. 将菜肴在25°C下保持25分钟以释放游动孢子。
    3. 将游动孢子悬浮液收集在烧杯中，并使用显微镜和血细胞计数器测量游动孢子浓度。
    4. 用无菌水将游动孢子浓度调节至1 x 104 游动孢子/ mL。

4. 抗病烟草品种的鉴定

  1. 从Hoagland营养液中取出幼苗，并将根部浸入20mL 的P. nicotianae 游动孢子悬浮液中，在25°C下在25°C下在黑暗中浸泡3小时来接种它们。
  2. 接种后，将烟草幼苗放入新的培养皿中，用10毫升无菌水浸泡根部。用两张滤纸盖住根部，保持根部湿润。将盘子保持在25°C，16小时光照/ 8小时黑暗光周期。
  3. 2-3天后，观察疾病的严重程度。
    1. 对于对照处理，将烟草幼苗直接放入培养皿中，用10 mL无菌水浸入根部，并用两张滤纸覆盖根部。
      注意：每个处理有三个重复，每个实验有8个植物。

5. 烟酸假单胞菌感染的 评估

  1. 接种疫苗后4-5天评估疾病严重程度。根据中国国家标准18，对单个植物病害严重程度进行0至9评分（表2， 图1）。
  2. 使用以下公式18计算疾病指数：
    疾病指数 = Equation 1
    其中 a、b、c、d、e 和 f 是每个疾病严重程度等级中的植物数量。
    注：疾病严重程度分为6级18 级（表3）。

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Representative Results

使用本文介绍的方法，用 尼古丁酸 对抗性品种BH和易感品种XHJ的4周龄植物进行挑战。该实验设计了三个重复，每个重复每组有8株植物。两种烟草品种BH和XHJ的 尼古丁酸对 虾感染如图 2所示。在接种后3天，对于XHJ，茎病变覆盖了茎围的约一半，并且叶子的一半略微枯萎;在耐药品种BH中，未观察到任何症状。在接种后4天，XHJ发生叶枯萎和严重的茎病变，而这些症状在BH中未出现。

接种后5 d，记录并计算个体植物病害严重程度，依据中国国家标准《烟草病虫害分级和调查方法》18 （表4）。BH的平均疾病指数为6.48，根据标准被认为是耐药性（R），XHJ的平均疾病指数为76.85，根据标准被认为是易感（S）。

为了确认接种效率，通过实时荧光定量法定量相对病原体生物量（图3）。从感染的BH和XHJ中分离出植物和病原体基因组DNA，并使用CTAB方案在感染后24小时，72小时和168小时收集19。使用引物对Pn-Fw（5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3'）/ Pn-Rev（5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'）定量相对病原体生物量，扩增P. nicotianae20和Nt-Fw（5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'）/ Nt-Rev（5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'）的40S核糖体蛋白S3A（WS21），扩增烟草参考基因26S rRNA基因21。使用2-ΔΔCT Ct方法计算病原体和烟草gDNA之间的表达折叠变化。实时荧光定量PCR的结果证实了表型观察结果。

采用游动孢子悬浮接种法和燕麦粒接种法对BH与XHJ杂交BC4F2群体的5个后代以及两个中间抗性品种K326和Yunyan87进行了评价（表5）。对小幼苗进行游动孢子悬浮法，对成株进行燕麦粒接种法。BC4F2群体的5个后代的病害指数为游动孢子悬浮法为16.49~77.60，燕麦粒法的病害指数为10.33~83.08。两种感染方法的耐药性分类大多相互一致。使用两种中间电阻品种K326和Yunyan87，评估结果显示这两种方法均为“抗性”。这些数据说明了两种接种方法之间的相关性，尽管它们在不同生长时期对烟草植物进行。

原液 比例 原液容积（毫升） 营养元素 含量（g）
第 1 层 1000× 500 氯化硫4•7 H2O 30.81
醇 2 1000× 500 钙（NO3）2•4 H2O 221.39
第3款 1000× 500 NaH2PO4•2 H2O 19.5
第 4 层 1000× 500 NH4NO3 75.04
奥尔 5 1000× 500 （NH4）阿拉伯数字二氧化硫 123.75
奥尔 6 1000× 500 氯化钙 104.06
第7号油合刊 1000× 500 铁氧四氧化硫•7 氢氧化氢 2.78
2-乙二胺四乙酸钠 3.73
奥尔 8 1000× 500 K2SO4 87.1
奥尔 9 4000× 1000 锰Cl2•4 H2O 7.24
H3BO3 11.44
锌氧化物4•7 H2O 0.88
铜溶氧四•5 H2O 0.32
（NH4）6 钼7O24•2 H2O 0.36

表1：霍格兰营养液。

年级 表型外观
等级 0 整个植物没有症状
1年级 茎病变<茎围的1/3或叶的<1/3枯萎
3年级 茎秆病变在茎围的1/3~1/2之间或叶片的1/3~1/2之间略有枯萎
5年级 茎病变>茎周长的1/2，但不完全围绕周长，或1/2至2/3的叶子枯萎
7年级 全茎周长或>2/3叶枯萎的茎病变
9年级 植物看起来已经死了

表2：黑腿病严重程度排名。 根据中国国家标准《烟草病虫害分级和调查方法》（GB/T 23222-2008），对植物病害的个别严重程度进行0至9分制评分。

疾病指数 耐药性评估
0 高抵抗力或免疫力（I）
0.1 到 20 耐受性 （R）
20，1 到 40 中度耐受性 （MR）
40，1 到 60 中度易感（MS）
60，1 到 80 易感 （S）
80，1 到 100 高度敏感 （HS）

表3：根据疾病指数评估耐药性。 根据疾病指数，疾病严重程度分为6个等级。0表示高度耐药或免疫（I），0.1至20表示耐药（R），20.1至40表示中度耐药（MR），40.1至60表示中度易感（MS），60.1至80表示易感（S），80.1至100表示高度敏感（HS）。

栽培品种 重复 1 2 3 4 5 6 7 8 疾病指数 意味 着 耐药性评估
波黑 1 0 1 0 0 1 0 1 0 4.17 6.48
2 1 0 0 0 3 1 0 1 8.33 R
3 1 0 0 0 0 0 3 1 6.94
断续器 1 7 5 7 7 9 7 7 7 77.78 76.85
2 9 7 9 7 5 9 7 5 80.56 S
3 7 5 7 9 5 9 5 5 72.22

表4：BH和XHJ的疾病指数和耐药性。 BH的平均疾病指数为6.48，根据标准显示耐药性（R），XHJ的平均疾病指数为76.85，根据标准显示易感性（S）。

基因型 游动孢子悬浮液 燕麦粒法
实验 1 实验2 意味 着 分类 实验 1 实验2 意味 着 分类
波黑 4.17 8.33 6.94 R 0 0 0 我
断续器 77.78 80.56 72.22 S 84.89 90 87.45 房 协
K325型 12.5 12.5 12.5 R 5.39 15.67 10.53 R
云岩87 19.45 8.33 13.89 R 4.7 28.89 16.8 R
C42-4型 21.28 21.89 21.59 先生 7.56 13.11 10.33 R
C13-4型 18.16 14.81 16.49 R 38.89 19.66 29.27 先生
C9-5型 77.41 77.78 77.6 S 79.83 82.86 81.34 房 协
C46-8型 55.56 51.11 53.34 女士 62.91 72.65 67.78 S
C66-9 79.88 74.07 76.98 S 93.94 72.22 83.08 房 协

表5：不同基因型的烟酸原虫感染反应，采用游动孢子悬浮接种法和燕麦粒接种法。对小幼苗进行游动孢子悬浮接种法，对成株进行燕麦粒接种法。这些数据说明了游动孢子悬浮接种法与燕麦粒接种法之间的相关性。K326和Yunyan87具有中等水平的抗性，C42-4，C13-4，C9-5，C46-8，C66-9是来自BH和XHJ杂交的BC4F2群体的后代。这些植物分为免疫，抗性，中度抗性，中度易感性，易感性或高易感性。

Figure 1
图1：每个等级的症状。 （A）0级，全株无症状。（B）1级，茎病<茎周长的1/3或<1/3叶枯萎。（C）3级，茎秆病变在茎围的1/3~1/2之间或叶片的1/3~1/2之间略有枯萎。（D）5级，茎病变>茎周长的1/2，但不完全围绕周长，或叶片的1/2至2/3之间枯萎。（E）7级，全茎周长或>2/3叶枯萎的茎病变。（F）9级，植物看起来死了。红色箭头表示茎病变。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：在两种烟草基因型中观察到的变异（A）接种后3天抗性品种BH的全植物无症状。（B）在接种后3天XHJ中，茎病变约为茎围的1/2和叶片的1/2略有枯萎。（C）接种后4天在抗性品种BH中全植物无症状。（D）茎病变>茎周长的1/2，但不能完全围绕周长，并且在接种后4天敏感品种XHJ中，1/2至2/3的叶子枯萎。红色箭头表示茎病变。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：接种后24小时，72小时和168小时感染BH和XHJ的相对 尼古丁酸对虾 生物量进行定量。 这是根据 烟 P. nicotianae WS21 基因扩增与烟草 26S rRNA 基因的比较计算得出的。 请点击此处查看此图的放大版本。

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Discussion

多种耐药性来源已被用于提高栽培烟草中的烟酸对虾的耐药性。单个显性R基因Php和Phl分别从Nicotiana plumbaginifolia和Nicotiana longiflora侵入10。雪茄烟草品种Beinhart 1000对P. nicotianae13具有最高的定量抗性水平。多个区间图谱实验表明，至少有六个数量性状位点（QTL）可能有助于该系的抗性13，22。除了上面提到的抗性来源外，还发现另一个外星基因Wz对种族0和种族123，24具有高水平的抵抗力。考虑到耐药品种的多重抗性来源和复杂的遗传背景，需要一种精确可靠的抗性评价方法：1）鉴定耐烟草属基因型，2）育种抗性品种，3）植物-病原菌相互作用的分子机制研究。以前用于评估尼古丁酸假单胞菌感染严重程度的方法非常耗时或接种强度难以控制。因此，迫切需要为尼古丁烷对虾耐药性评估制定一种新的方法。

模仿自然感染过程是我们新方法的关键点。首先，在 烟粉蚴的典型生命周期中，游动孢子是引发植物病害的主要感染因子。一旦游动孢子到达植物表面，它们就会变成不动的囊肿，随后发芽，并形成胚管。然后，在胚芽管的尖端产生沉淀物25。在我们的方案中，游动孢子悬浮液被用作接种物，模仿自然感染情况。其次，在 尼古香 叶上，囊肿在3小时26处发芽并定植表皮细胞。在 拟南芥 根部，所有虫子孢子在接种后6小时成功穿透根部27。在我们的方法中，接种过程涉及将根部浸入 黑枸 龙游动孢子悬浮液中3小时，该悬浮液模仿自然环境并促进病原体定植，从而导致稳定有效的感染。

评估烟草中 尼古丁酸对氮 磷耐药性最常用的方法，燕麦谷物法，对于接种大量植物是高效和容易的7，11，12，13，14，15，16。但是，它有一些缺点。主要缺点是不受控制的接种强度，这限制了其在精密育种中的应用。与燕麦粒法和其他两种现有方法相比，在这种新方法中，使用游动孢子悬浮液作为接种物，因此接种强度是可控和可调的。由于植物在水培环境中培养，因此消除了土壤的干扰，从而提高了评估精度。然而，这种方法存在一个局限性，即它不能用于成虫植物。另一方面，燕麦粒法适用于成株的大规模抗性筛选7，13。因此，该方法与燕麦粒法在烟草植物的不同生长期和不同情况下可以相辅相成。

这里描述的方案是一种有效且可靠的方法，用于评估烟草在幼苗阶段对 尼古丁酸假单胞 菌感染的抵抗力。该协议可用于育种和分子机制研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本研究由国家自然科学基金（31571738）和中国农业科技创新计划（ASTIP-TRIC01）资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2SO4 Sinopharm 10002917 Analytical Reagent
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O Sinopharm XW131067681 Analytical Reagent
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30120086 Used for Sample Extarction
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30120094 Used for Sample Extarction
Agar MDBio, Inc 9002-18-0 Materials of Culture Medium
Analytical Balance AOHAOSI AX2202ZH Equipment
Autoclave Yamatuo SQ510C Equipment
Autoclave YAMATUO SQ510C Equipment
Beaker Bio Best DHSB-2L Materials of Culture Medium
Biological Incubator JINGHONG SHP-250 Equipment
Ca(NO3)2•4 H2O Sinopharm 80029062 Analytical Reagent
CaCl2 Sinopharm 10005817 Analytical Reagent
CuSO4•5 H2O Sinopharm 10008218 Analytical Reagent
Electromagnetic Oven Bio Best DHDCL Equipment
FeSO4•7 H2O Sinopharm 10002918 Analytical Reagent
Filter Paper Bio Best DHLZ-9CM Material
Fluorescence Ration PCR Instrument Roche LightCycler96 Equipment
Gauze Bio Best 17071202 Materials of Culture Medium
H3BO3 Phytotechnology B210-500G Analytical Reagent
Hemocytometer Solarbio 17072801 Material for disease-resistant  identification
K2SO4 Sinopharm 10017918 Analytical Reagent
KNO3 Sinopharm 10017218 Analytical Reagent
KT Foam Sheet Bio Best DHKTB Material for Seedling
Low Constant Incubator Jinghong SHP-250 Equipment
Measuring Cylinder Bio Best DHBLLT-1000ML Materials of Culture Medium
MgSO4•7 H2O Sinopharm 10013080 Analytical Reagent
Microscope ECHO RVL-100-G Equipment
MnCl2•4 H2O Sinopharm G5468154 Analytical Reagent
Na2-EDTA Sinopharm G21410-250 Analytical Reagent
NaH2PO4•2 H2O Sinopharm 20040717 Analytical Reagent
NH4NO3 Sinopharm B64586-100g Analytical Reagent
Oatmeal Bio Best DHYMP-1.5KG Materials of Culture Medium
Petri Dish Bio Best DHPYM-9CM Material for disease-resistant  identification
Pipettor THERMO S1 Equipment
Potting Bio Best DHYCXHP-12CM Material for Seedling
Potting Soil Bio Best DHYMJZ-50L Seedling Material
Punch Bio Best DHDKW Material
qRT-PCR Plate Monad MQ50401S qRT-PCR Plate
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit Accurate Biology AG11718 PCR Reagent
Toothpick Bio Best DHYQ-900 Material
Total RNA Kit II Omega R6934-01 PCR Reagent
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Transgen AH311-02 PCR Reagent
Trays Bio Best DHYMTP-90G Material for Seedling
Vermiculite Bio Best DHZS Seedling Material
Water Purification System HEAL FORCE HSE68-2 Equipment
ZnSO4•7 H2O Sinopharm 10024018 Analytical Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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生物学， 问题 182， 烟生植物， 黑柄， 种质， 植物抗性， 易感性， 水培栽培， 游动孢子悬浮
烟草基因型对 <em>烟碱性植物</em> 的筛选
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Liu, Y., Sun, M., Jiang, Z., Wang, X., Xiao, B., Yang, A., Meng, H., Cheng, L. Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance. J. Vis. Exp. (182), e63054, doi:10.3791/63054 (2022).

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