Summary
Ici, un protocole est présenté pour le dépistage efficace et précis des génotypes de tabac pour la résistance à Phytophthora nicotianae chez les semis. Il s’agit d’une approche pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.
Abstract
Le jarret noir, causé par les oomycètes Phytophthora nicotianae, est destructeur pour le tabac, et cet agent pathogène est hautement pathogène pour de nombreuses cultures solanacées. P. nicotianae est bien adapté aux températures élevées; par conséquent, la recherche sur cet agent pathogène gagne en importance dans l’agriculture du monde entier en raison du réchauffement climatique. Les variétés de plants de tabac résistantes à P. nicotianae sont généralement dépistées par inoculation avec des grains d’avoine colonisés par P. nicotianae et par surveillance des symptômes de la maladie. Cependant, il est difficile de quantifier l’intensité de l’inoculation car une inoculation précise est cruciale dans ce cas. Cette étude visait à développer une méthode efficace et fiable pour évaluer la résistance du tabac à l’infection par P. nicotianae. Cette méthode a été utilisée avec succès pour identifier les variétés résistantes, et l’efficacité de l’inoculation a été confirmée par PCR en temps réel. La méthode d’évaluation de la résistance présentée dans cette étude est efficace et pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.
Introduction
P. nicotianae est destructeur pour de nombreuses cultures solanacées. Il peut causer la « jarret noir »1 du tabac, la pourriture foliaire et tuberculeuse de la pomme de terre2, la pourriture de la couronne et de la racine de la tomate et du poivron doux3, ainsi que la pourriture du collier et des racines de Goji4. P. nicotianae peut attaquer toutes les parties des plants de tabac, y compris les racines, les tiges et les feuilles à n’importe quel stade de croissance5. Le symptôme le plus courant de la maladie est la base noire de la tige. Les racines sont d’abord visibles comme imbibées d’eau, puis deviennent nécrotiques, et les feuilles présentent de grandes lésions circulaires5. Cette maladie peut être dévastatrice pour une plante de tabac dans la serre, ainsi que sur le terrain6. La méthode la plus pratique et la plus économique pour lutter contre P. nicotianae est l’utilisation de variétés résistantes7. Cependant, un protocole de dépistage efficace est nécessaire pour l’identification des accessions résistantes à P. nicotianae provenant des collections de matériel génétique du tabac.
Diverses méthodes d’identification ont été décrites pour évaluer la résistance à P. nicotianae dans le tabac7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En général, trois approches principales ont été utilisées pour l’identification des génotypes de tabac résistants à P. nicotianae. La première consiste à mélanger le mycélium avec un milieu agar sur des plaques de Petri contenant P. nicotianae. Les mycéliums sont ensuite cultivés dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 semaines. 1 L d’eau désionisée est ajoutée au mycélium et homogénéisée pendant 30 s. L’inoculum est conservé sur la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Deux trous (1 cm de diamètre et 4-5 cm de profondeur) sont faits de chaque côté de la plante, et 10 mL de l’inoculum sont versés dans chaque trou. Les trous sont ensuite remplis avec le sol environnant et le développement de la maladie est surveillé quotidiennement pendant 2 semaines8,10.
Dans la deuxième méthode, les plantes sont inoculées avec des cure-dents infestés d’agents pathogènes. Pour cette approche, les plantes doivent être utilisées environ 6 semaines après le repiquage et doivent avoir une hauteur minimale de 30 cm. Les cure-dents autoclavés sont placés à la surface des cultures contenant P. nicotianae mycelia. Les plats de culture sont ensuite conservés à la lumière à température ambiante pendant 7 jours. Ensuite, des cure-dents colonisés sont utilisés pour inoculer les plantes. Les cure-dents sont insérés dans les tiges de tabac entre les quatrième et cinquième nœuds. Les plantes sont surveillées quotidiennement pendant 5 jours9,15. Cette méthode ne s’applique pas aux petits semis. Comme l’inoculum est infesté de cure-dents infestés d’agents pathogènes, l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.
L’approche la plus fréquemment utilisée implique des grains d’avoine pour l’inoculation. Dans ce cas, les grains d’avoine sont préparés par autoclavage 500 mL d’avoine et 300 mL d’eau désionisée à 121 °C pendant 1 h une fois par jour pendant 3 jours. Ensuite, des grains d’avoine sont ajoutés au milieu de culture colonisé par un agent pathogène. Les plats sont scellés avec un film de paraffine et incubés à 25 ° C à la lumière pendant 7 à 12 jours. Quatre trous séparés de 5 cm de profondeur sont faits sur le terreau, à 4 cm de chaque plante, et un grain d’avoine infesté d’agents pathogènes est placé dans chaque trou. La période d’incubation est déterminée en fonction du moment où le premier symptôme en surface se produit7,11,12,13,14,15,16. Cette méthode est efficace et applicable pour le criblage de résistance à grande échelle. Cependant, l’une des limites de cette approche est que l’inoculum est constitué de grains d’avoine infestés d’agents pathogènes, de sorte que l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.
Cependant, présenté ici est une méthode plus précise qui est applicable à l’évaluation de la résistance de la chambre de croissance. Par rapport aux autres approches, l’inoculum est en suspension de zoospore, d’où l’intensité de l’inoculation est contrôlable et réglable. Comme les plants de tabac de cette étude sont cultivés sans sol, les résultats sont plus faciles à observer. De plus, l’échantillonnage des racines des plantes dans le sol endommage toujours les racines, ce qui induit une série de réponses physiologiques17. Dans cette méthode, comme les plantes sont cultivées sans sol, l’interférence dans les dommages aux racines peut être éliminée. En conclusion, cette méthode est plus pratique pour la recherche sur les mécanismes moléculaires et la sélection de précision. En utilisant ce protocole, les données sont généralement obtenues dans les 5 jours, avec plus de 200 plantes évaluées en une seule expérience.
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Protocol
1. Matériaux
- Obtenir des variétés de tabac.
NOTE: Pour cette expérience, « Beinhart1000-1 » (une sélection de Beinhart 1000) (BH) et « Xiaohuangjin1025 » (XHJ) ont été obtenus auprès de la Banque nationale de génétique à moyen terme de la ressource en matériel génétique du tabac de Chine. Bh est résistant, tandis que XHJ est sensible à l’infection à P. nicotianae16. Un isolat de champ de P. nicotianae race 0, qui a été conservé à l’Institut de recherche sur le tabac de l’Académie chinoise des sciences agricoles, a été utilisé pour toutes les inoculations tout au long de l’étude.
2. Plantation de génotypes de tabac pour l’évaluation de la résistance à P. nicotianae
- Mélanger les graines de tabac avec de la vermiculite et diffuser doucement les graines sur le terreau stérilisé. Placez les pots dans la chambre de croissance. Maintenir une température constante de 25 °C, sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité.
- Préparez des appareils hydroponiques avec des plateaux et des feuilles de mousse. Une fois les graines germées, piquez les semis du terreau, lavez doucement les racines avec de l’eau désionisée stérile et transplantez-les dans les appareils hydroponiques.
- Placer les appareils dans des chambres climatiques à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant 24 h.
- Préparer la solution nutritive Hoagland à l’avance (tableau 1). Transplantez les semis dans des dispositifs hydroponiques avec une solution nutritive Hoagland (environ 125 mL par plante).
- Placez les appareils dans une chambre climatique à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant 2 semaines.
3. Préparation de la suspension de P. nicotianae zoospore
- Préparer le milieu de la gélose à l’avoine.
- Peser 33 g de flocons d’avoine et transférer dans la verrerie et ajouter 1 000 mL d’eau stérile. Faire bouillir sur une cuisinière électromagnétique.
- Une fois que la farine d’avoine devient collante, filtrer la solution liquide à travers un morceau de gaze stérile.
- Versez la solution liquide dans un cylindre gradué de 1 000 mL et réglez le volume à 1 000 mL avec de l’eau stérile.
- Versez la solution liquide dans un flacon de réactif en verre et ajoutez 18 g de gélose. Bien agiter et autoclaver le mélange (milieu de gélose à l’avoine) à 121 °C pendant 15 min. Laissez-le à température ambiante pendant 30 min.
- Versez environ 20 ml du milieu de gélose à l’avoine stérilisé dans chaque boîte de Pétri. Laissez les boîtes de Petri à température ambiante refroidir soigneusement avant la culture mycélienne.
- Effectuer la culture mycélienne.
- Préparez au préalable les poinçons et les cure-dents de 1 cm de diamètre en les autoclavant à 121 °C pendant 15 min.
- Percer des trous dans les cultures d’agar mycélienne P. nicotianae pour faire des tapis mycéliens ronds.
- Choisissez les tapis mycéliens, placez le côté mycélien vers le bas sur le milieu de la gélose à l’avoine et incubez le mycélium à 25 ° C dans l’obscurité pendant 14 jours.
- Préparer la suspension de P. nicotianae zoospore.
- Ajouter une solution de KNO3 à 0,1 % à chaque culture mycélienne (15 mL/plat), puis cultiver à 4 °C pendant 20 min pour induire le sporange.
- Conserver les plats à 25 °C pendant 25 min pour libérer les zoospores.
- Recueillir la suspension de zoospore dans un bécher et mesurer la concentration de zoospore à l’aide d’un microscope et d’un hémocytomètre.
- Ajuster la concentration de zoospores à 1 x 104 zoospores/mL avec de l’eau stérile.
4. Identification des variétés de tabac résistantes aux maladies
- Prenez les semis de la solution nutritive Hoagland et inoculez-les en immergeant les racines dans 20 mL de suspension zoospore de P. nicotianae dans une boîte de Pétri (90 mm) à 25 °C pendant 3 h dans l’obscurité.
- Après l’inoculation, mettez les plants de tabac dans de nouvelles boîtes de Pétri avec 10 mL d’eau stérile immergeant les racines. Gardez les racines humides en les recouvrant de deux morceaux de papier filtre. Conserver la vaisselle à 25 °C avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité.
- Après 2-3 jours, observez la gravité de la maladie.
- Pour le traitement de contrôle, placez les plants de tabac directement dans les boîtes de Pétri avec 10 ml d’eau stérile immergeant les racines et recouvrez les racines de deux morceaux de papier filtre.
NOTE: Chaque traitement avait trois réplications, avec 8 plantes par expérience.
- Pour le traitement de contrôle, placez les plants de tabac directement dans les boîtes de Pétri avec 10 ml d’eau stérile immergeant les racines et recouvrez les racines de deux morceaux de papier filtre.
5. Évaluation de l’infection à P. nicotianae
- Évaluez la gravité de la maladie 4 à 5 jours après l’inoculation. Sur la base de la norme nationale chinoise18, évaluer la gravité de chaque maladie des plantes sur une échelle de 0 à 9 (tableau 2, figure 1).
- Calculez l’indice de maladie à l’aide de la formule suivante18 :
Indice de maladie =
où a, b, c, d, e et f sont le nombre de plantes dans chaque grade de gravité de la maladie.
REMARQUE : La gravité de la maladie a été divisée en 6 grades18 (tableau 3).
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Representative Results
Les plantes âgées de 4 semaines de la variété résistante BH et de la variété sensible XHJ ont été confrontées à P. nicotianae en utilisant la méthode présentée dans cet article. L’expérience a été conçue avec trois répliques, chacune avec 8 plantes par groupe. L’infection à P. nicotianae des deux variétés de tabac, BH et XHJ, est présentée à la figure 2. 3 jours après l’inoculation, pour XHJ, les lésions de la tige couvraient environ la moitié de la circonférence de la tige et la moitié des feuilles étaient légèrement fanées; dans la variété résistante BH, aucun symptôme n’a été observé. 4 jours après l’inoculation, un flétrissement des feuilles et des lésions graves de la tige sont survenus dans XHJ, alors que ces symptômes n’apparaissaient pas dans BH.
5 jours après l’inoculation, la gravité individuelle des maladies des plantes a été enregistrée et calculée sur la base de la norme nationale chinoise pour la « Méthode de qualité et d’investigation des maladies du tabac et des insectes nuisibles»18 (tableau 4). L’indice moyen de maladie de BH était de 6,48, ce qui a été considéré comme résistant (R) selon la norme, et l’indice moyen de maladie de XHJ était de 76,85, ce qui a été considéré comme sensible (S) selon la norme.
Pour confirmer l’efficacité de l’inoculation, la biomasse pathogène relative a été quantifiée par PCR en temps réel (Figure 3). L’ADN génomique des plantes et des agents pathogènes a été isolé à partir de BH et de XHJ infectés et prélevé 24 h, 72 h et 168 h après l’infection à l’aide du protocole CTAB19. La biomasse pathogène relative a été quantifiée à l’aide des paires d’amorces Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), amplifiant la protéine ribosomique 40S S3A (WS21) de P. nicotianae20, et Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), amplifiant le gène de référence du tabac 26S gène de l’ARNr21. Les changements du pli d’expression entre l’agent pathogène et l’ADNg du tabac ont été calculés à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT Ct. Les résultats de la PCR en temps réel ont confirmé les observations phénotypiques.
Cinq descendants de la population BC4F2 d’un croisement entre BH et XHJ et deux variétés à résistance intermédiaire, K326 et Yunyan87, ont été évalués à l’aide de la méthode d’inoculation en suspension de zoospore et de la méthode d’inoculation des grains d’avoine (tableau 5). La méthode de suspension de zoospore a été réalisée sur de petits semis, et la méthode d’inoculation de grains d’avoine a été effectuée sur des plantes adultes. Pour les cinq descendants de la population BC4F2, l’indice de maladie variait de 16,49 à 77,60 pour la méthode de suspension de zoospore et de 10,33 à 83,08 pour la méthode des grains d’avoine. Les classifications de résistance entre les deux méthodes d’infection étaient pour la plupart cohérentes l’une avec l’autre. Avec les deux variétés de résistance intermédiaire, K326 et Yunyan87, l’évaluation a montré une « résistance » dans les deux méthodes. Ces données illustrent la corrélation entre les deux méthodes d’inoculation, bien qu’elles soient effectuées sur des plants de tabac à des périodes de croissance différentes.
| Liqueur originale | Proportion | Volume de liqueur d’origine (mL) | Éléments nutritifs | Contenu (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) deux SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tableau 1 : Solution nutritive pour Hoagland.
| Grade | Apparition du phénotype |
| 0re année | Aucun symptôme sur l’ensemble de la plante |
| 1re année | Lésions de la tige < 1/3 de la circonférence de la tige ou <1/3 du flétrissement des feuilles |
| 3e année | Lésions de la tige entre 1/3 et 1/2 de la circonférence de la tige ou entre 1/3 et 1/2 des feuilles légèrement flétrissantes |
| 5e année | Lésions de la tige >1/2 de la circonférence de la tige, mais pas complètement autour de la circonférence, ou entre 1/2 et 2/3 des feuilles flétrissantes |
| 7e année | Lésions de la tige autour de la circonférence de la tige entière ou >2/3 des feuilles flétrissantes |
| 9e année | Les plantes ont l’air mortes |
Tableau 2 : Classement de la gravité de la maladie du jarret noir. Sur la base de la norme nationale chinoise pour la « Méthode de qualité et d’investigation des maladies du tabac et des insectes nuisibles » (GB / T 23222-2008), la gravité des maladies des plantes individuelles a été notée sur une échelle de 0 à 9.
| Indice de maladie | Évaluation de la résistance |
| 0 | Très résistant ou immunitaire (I) |
| 0,1 à 20 | Résistant (R) |
| 20,1 à 40 | Modérément résistant (MR) |
| 40,1 à 60 | Modérément sensible (SEP) |
| 60,1 à 80 | Sensible (S) |
| 80,1 à 100 | Très sensible (SH) |
Tableau 3 : Évaluation de la résistance selon l’indice de la maladie. La gravité de la maladie a été divisée en 6 grades selon l’indice de la maladie. 0 signifie très résistant ou immunisé (I), 0,1 à 20 signifie résistant (R), 20,1 à 40 signifie modérément résistant (MR), 40,1 à 60 signifie modérément sensible (SEP), 60,1 à 80 signifie sensible (S), 80,1 à 100 signifie très sensible (SH).
| Cultivar | Répéter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Indice de maladie | Méchant | Évaluation de la résistance | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tableau 4 : Indice de maladie et résistance en BH et XHJ. L’indice moyen de maladie de BH était de 6,48, ce qui montre une résistance (R) selon la norme, et l’indice moyen de maladie de XHJ était de 76,85, ce qui montre une susceptibilité (S) selon la norme.
| Génotype | Suspension zoospore | Méthode des grains d’avoine | ||||||
| Expérience 1 | Expérience 2 | Méchant | Classification | Expérience 1 | Expérience 2 | Méchant | Classification | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Je |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | MONSIEUR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | MONSIEUR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tableau 5 : Réponse à l’infection à P. nicotianae dans différents génotypes avec la méthode d’inoculation en suspension de zoospore et la méthode d’inoculation des grains d’avoine. La méthode d’inoculation en suspension de zoospore a été réalisée sur de petits plants, et la méthode d’inoculation de grains d’avoine a été effectuée sur des plantes adultes. Ces données illustrent la corrélation entre la méthode d’inoculation en suspension de zoospore et la méthode d’inoculation des grains d’avoine. K326 et Yunyan87 ont des niveaux intermédiaires de résistance, et C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 sont des descendants de la population BC4F2 d’un croisement entre BH et XHJ. Les plantes ont été classées comme immunisées, résistantes, modérément résistantes, modérément sensibles, sensibles ou très sensibles.
Figure 1: Symptôme de chaque grade. (A) Grade 0, plante entière sans symptôme. (B) Grade 1, lésion de la tige <1/3 de la circonférence de la tige ou flétrissement des feuilles <1/3. (C) Grade 3, lésions de la tige entre 1/3 et 1/2 de la circonférence de la tige ou entre 1/3 et 1/2 des feuilles légèrement flétrissantes. (D) Grade 5, lésions de la tige >1/2 de la circonférence de la tige, mais pas complètement autour de la circonférence, ou entre 1/2 et 2/3 des feuilles flétrissantes. (E) Grade 7, lésions de la tige autour de la circonférence entière de la tige ou >2/3 du flétrissement des feuilles. (F) Grade 9, les plantes ont l’air mortes. Des flèches rouges indiquent les lésions de la tige. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Variation observée dans deux génotypes de tabac. (A) Plante entière sans symptômes dans la variété résistante BH 3 jours après l’inoculation. (B) Les lésions de la tige sont d’environ 1/2 de la circonférence de la tige et 1/2 des feuilles légèrement flétrissantes dans XHJ 3 jours après l’inoculation. (C) Plante entière sans symptômes dans la variété résistante BH 4 jours après l’inoculation. (D) Lésions de la tige >1/2 de la circonférence de la tige, mais pas complètement autour de la circonférence, et entre 1/2 et 2/3 des feuilles flétrissantes dans la variété sensible XHJ 4 jours après l’inoculation. Des flèches rouges indiquent les lésions de la tige. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification relative de la biomasse de P. nicotianae dans les BH et XHJ infectés à 24 h, 72 h et 168 h après l’inoculation. Ceci est calculé comme le rapport de l’amplification du gène P. nicotianae WS21 par rapport au gène de l’ARNr 26S du tabac. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
De multiples sources de résistance ont été utilisées pour améliorer la résistance à P. nicotianae dans le tabac cultivé. Les gènes R dominants uniques, Php et Phl, ont été introduits à partir de Nicotiana plumbaginifolia et Nicotiana longiflora, respectivement10. La variété de tabac à cigares Beinhart 1000 a le plus haut niveau de résistance quantitative signalé à P. nicotianae13. De multiples expériences de cartographie d’intervalles ont suggéré qu’au moins six loci de caractères quantitatifs (QTL) pourraient contribuer à la résistance dans cette lignée13,22. En plus des sources résistantes mentionnées ci-dessus, un autre gène étranger, Wz, s’est également avéré conférer un niveau élevé de résistance à la race 0 et à la race 123,24. Compte tenu des multiples sources résistantes et du contexte génétique complexe des variétés résistantes, une méthode précise et fiable d’évaluation de la résistance est nécessaire pour 1) l’identification des génotypes de tabac résistants à P. nicotianae, 2) la sélection de variétés résistantes et 3) l’étude des mécanismes moléculaires des interactions plantes-pathogènes. Les méthodes précédentes utilisées pour évaluer la gravité de l’infection à P. nicotianae prenaient beaucoup de temps ou les intensités d’inoculation étaient difficiles à contrôler. Par conséquent, il est urgent de mettre en place une nouvelle méthode d’évaluation de la résistance à P. nicotianae.
Imiter les processus naturels d’infection est le point clé de notre nouvelle méthode. Tout d’abord, au cours du cycle de vie typique de P. nicotianae, les zoospores sont les principaux agents infectieux qui initient les maladies des plantes. Une fois que les zoospores atteignent la surface de la plante, elles deviennent des kystes immobiles, germent ensuite et forment des tubes germinaux. Ensuite, des appressoria sont produites à l’extrémité des tubes germinaux25. Dans notre protocole, la suspension de zoospore a été utilisée comme inoculum, ce qui imite la situation d’infection naturelle. Deuxièmement, sur les feuilles de Nicotiana benthamiana, les kystes ont germé et colonisé les cellules épidermiques à 3 h26. Dans les racines d’Arabidopsis, toutes les zoospores enkystées ont réussi à pénétrer les racines 6 h après l’inoculation27. Dans notre approche, le processus d’inoculation impliquait l’immersion des racines dans une suspension de zoospore de P. nicotianae pendant 3 h dans l’obscurité, ce qui imite l’environnement naturel et favorise la colonisation de l’agent pathogène, conduisant ainsi à une infection stable et efficace.
L’approche la plus fréquemment utilisée pour évaluer la résistance de P. nicotianae dans le tabac, la méthode des grains d’avoine, est efficace et facile pour inoculer un grand nombre de plantes7,11,12,13,14,15,16. Cependant, il présente certains inconvénients. Le principal inconvénient est l’intensité inoculée incontrôlée, ce qui limite son application dans la sélection de précision. Par rapport à la méthode des grains d’avoine et aux deux autres approches existantes, dans cette nouvelle approche, la suspension de zoospore est utilisée comme inoculum, de sorte que l’intensité inoculée est contrôlable et réglable. Comme les plantes sont cultivées dans un environnement hydroponique, l’interférence du sol est éliminée, ce qui augmente la précision de l’évaluation. Cependant, une limite existe pour cette méthode, qui est qu’elle ne peut pas être utilisée sur les plantes adultes. La méthode du grain d’avoine, d’autre part, est applicable pour le dépistage de la résistance à grande échelle des plantes adultes7,13. Par conséquent, cette méthode et la méthode du grain d’avoine peuvent se compléter pour différentes périodes de croissance du plant de tabac et dans différentes situations.
Le protocole décrit ici est une méthode efficace et fiable pour évaluer la résistance du tabac à l’infection par P. nicotianae au stade du semis. Ce protocole peut être utilisé pour la sélection et pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31571738) et le Programme d’innovation en sciences et technologies agricoles de Chine (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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