Summary
Her presenteres en protokoll for effektiv og nøyaktig screening av tobakkgenotyper for Phytophthora nicotianae motstand i frøplanter. Dette er en praktisk tilnærming for presisjonsavl, samt molekylær mekanismeforskning.
Abstract
Svart skaft, forårsaket av oomycetes Phytophthora nicotianae, er ødeleggende for tobakk, og dette patogenet er svært patogent for mange solanaceous avlinger. P. nicotianae er godt tilpasset høye temperaturer; Derfor får forskning på dette patogenet betydning i landbruket over hele verden på grunn av global oppvarming. P. nicotianae-resistente varianter av tobakksplanter blir ofte screenet av inokulasjon med havrekorn kolonisert av P. nikotianae og overvåking for sykdomssymptomene. Det er imidlertid vanskelig å kvantifisere inokulasjonsintensiteten siden nøyaktig inokulasjon er avgjørende i dette tilfellet. Denne studien hadde som mål å utvikle en effektiv og pålitelig metode for å evaluere motstanden av tobakk mot infeksjon med P. nicotianae. Denne metoden har blitt brukt til å identifisere resistente varianter, og inokulasjonseffektiviteten ble bekreftet av sanntids PCR. Motstandsevalueringsmetoden som presenteres i denne studien er effektiv og praktisk for presisjonsavl, samt molekylær mekanismeforskning.
Introduction
P. nicotianae er ødeleggende for mange solanaceous avlinger. Det kan forårsake tobakk "svart skaft"1, potetfoviar og knollrot2, tomat og søt pepperkrone og rotrot3, og Goji krage og rotrot4. P. nicotianae kan angripe alle deler av tobakksplanter, inkludert røttene, stilkene og bladene i ethvert voksende stadium5. Det vanligste symptomet på sykdommen er den svarte basen av stilken. Røttene er i utgangspunktet synlige som vann-gjennomvåt og blir deretter nekrotiske, og bladene viser store sirkulære lesjoner5. Denne sykdommen kan være ødeleggende for en tobakksplante i drivhuset, så vel som i feltet6. Den mest praktiske og økonomiske metoden for å kontrollere P. nicotianae er bruken av resistente varianter7. Imidlertid er det nødvendig med en effektiv screeningprotokoll for identifisering av P. nicotianae-resistente tiltredelser fra tobakkskimplasmasamlinger.
Ulike identifikasjonsmetoder er beskrevet for å vurdere P. nicotianae motstand i tobakk7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Generelt har tre store tilnærminger blitt brukt til identifisering av P. nicotianae-resistente tobakksgenotyper. Den første inkluderer blanding av mycelia med agarmedium på Petri-plater som inneholder P. nicotianae. Mycelia blir deretter dyrket i mørket ved romtemperatur i 2 uker. 1 L deionisert vann tilsettes til mycelia og homogeniseres i 30 s. Inokulumet holdes på is til det er nødvendig. To hull (1 cm i diameter og 4-5 cm dyp) er laget på hver side av planten, og 10 ml av inokulumet helles i hvert hull. Hullene fylles deretter med den omkringliggende jorda, og sykdomsutvikling overvåkes daglig i 2 uker8,10.
I den andre metoden er plantene inokulert med patogeninfisert tannpirkere. For denne tilnærmingen bør plantene brukes ca 6 uker etter transplantasjon og bør ha en minimumshøyde på 30 cm. Autoklavede tannpirkere er plassert på overflaten av kulturer som inneholder P. nicotianae mycelia. Kulturrettene lagres deretter under lyset ved romtemperatur i 7 dager. Deretter brukes koloniserte tannpirkere til å inokulere plantene. Tannpirkere settes inn i tobakksstenglene mellom fjerde og femte node. Plantene overvåkes daglig i 5 dager9,15. Denne metoden gjelder ikke for små frøplanter. Siden inokulumet er patogeninfisert tannpirkere, kan inokulasjonsintensiteten ikke kontrolleres nøyaktig.
Den mest brukte tilnærmingen innebærer havrekorn for inokulasjon. I dette tilfellet fremstilles havrekorn ved autoklavering av 500 ml havre og 300 ml deionisert vann ved 121 °C i 1 time én gang per dag i 3 dager. Deretter legges havrekorn til det patogenkoloniserte kulturmediet. Rettene er forseglet med parafinfilm og inkubert ved 25 °C i lys i 7-12 dager. Fire separate 5 cm dype hull er laget på pottejorden, 4 cm fra hver plante, og ett patogeninfisert havrekorn plasseres i hvert hull. Inkubasjonsperioden bestemmes ut fra når det første symptomet ovenfor forekommer7,11,12,13,14,15,16. Denne metoden er effektiv og anvendelig for screening av storskala motstand. En begrensning ved denne tilnærmingen er imidlertid at inokulumet er patogeninfisert havrekorn, derfor kan inokulasjonsintensiteten ikke kontrolleres nøyaktig.
Men presentert her er en mer nøyaktig metode som gjelder for vekstkammermotstandsevaluering. Sammenlignet med de andre tilnærmingene er inokulumet zoospor suspensjon, derfor er inokulasjonsintensiteten kontrollerbar og justerbar. Ettersom tobakksplantene i denne studien dyrkes uten jord, er resultatene lettere å observere. Videre forårsaker prøvetaking av planterøtter fra jord alltid skade på røttene, noe som induserer en rekke fysiologiske responser17. I denne metoden, som planter dyrkes uten jord, kan forstyrrelsen i rotskade elimineres. Til slutt er denne metoden mer praktisk for molekylær mekanismeforskning og presisjonsavl. Ved hjelp av denne protokollen oppnås data vanligvis innen 5 dager, med mer enn 200 planter evaluert i et enkelt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialer
- Få tobakksvarianter.
MERK: For dette eksperimentet ble "Beinhart1000-1" (et utvalg av Beinhart 1000) (BH) og "Xiaohuangjin1025" (XHJ) hentet fra National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH er resistent, mens XHJ er utsatt for P. nikotianae infeksjon16. En feltisolasjon av P. nicotianae race 0, som ble bevart i Tobacco Research Institute ved Det kinesiske landbruksakademiet, ble brukt til alle inokulasjoner gjennom hele studien.
2. Plante tobakk genotyper for P. nicotianae motstand evaluering
- Bland tobakkfrø med vermikulitt og kringkast frøene forsiktig på den steriliserte pottejorden. Plasser pottene i vekstkammeret. Opprettholde en konstant temperatur på 25 °C, under en 16 timers lys/8 t mørk fotoperiod.
- Forbered hydroponiske enheter med skuffer og skumplater. Etter at frøene spiser, stikker du plantene ut fra pottejorden, vasker røttene forsiktig med sterilt deionisert vann og transplanterer dem i hydroponiske enheter.
- Plasser enhetene i klimakamre ved 25 °C under 16 timers lys/8 t mørk fotoperiod i 24 timer.
- Forbered Hoagland næringsløsning på forhånd (tabell 1). Transplanter plantene til hydroponiske enheter med Hoagland næringsløsning (ca. 125 ml per plante).
- Plasser enhetene i et klimakammer ved 25 °C under 16 timers lys/8 t mørk fotoperiod i 2 uker.
3. Forberedelse av P. nicotianae zoospore suspensjon
- Forbered havregryn agar medium.
- Vei 33 g havregryn og overfør til glass og tilsett 1000 ml sterilt vann. Kok på en elektromagnetisk komfyrtoppovn.
- Etter at havregryn blir klebrig, spenne væskeoppløsningen gjennom et stykke steril gasbind.
- Hell væskeløsningen i en 1000 ml gradert sylinder og juster volumet til 1000 ml med sterilt vann.
- Hell væskeoppløsningen i en glassreagensflaske og tilsett 18 g agar. Rist godt og autoklaver blandingen (havregryn agar medium) ved 121 °C i 15 minutter. La den stå ved romtemperatur i 30 min.
- Hell rundt 20 ml av det steriliserte havregryn agarmediet i hver Petri-tallerken. La Petri-rettene stå ved romtemperatur for å avkjøles grundig før mycelial dyrking.
- Utfør mycelial dyrking.
- Forbered 1 cm diameter slag og tannpirkere på forhånd ved å autoklavere dem ved 121 °C i 15 minutter.
- Slå hull i P. nicotianae mycelial agar kulturer for å lage runde mycelial matter.
- Plukk ut mycelial matter, plasser den myceliale siden ned på havregryn agar medium, og inkuber myceliet ved 25 °C i mørket i 14 dager.
- Forbered P. nicotianae zoospore suspensjon.
- Tilsett 0,1% KNO3-oppløsning til hver mycelial dyrking (15 ml/tallerken), etterfulgt av dyrking ved 4 °C i 20 minutter for å indusere sporangium.
- Oppbevar rettene ved 25 °C i 25 minutter for å frigjøre dyrehagespor.
- Samle zoosporfjæringen i et beger og mål zoosporkonsentrasjonen ved hjelp av et mikroskop oghemocytometer.
- Juster zoosporkonsentrasjonen til 1 x 104 zoosporer/ml med sterilt vann.
4. Identifisering av sykdomsresistente tobakksvarianter
- Ta plantene fra Hoagland næringsløsning og inokuler dem ved å nedsenke røttene i 20 ml P. nicotianae zoospore suspensjon i en Petri-tallerken (90 mm) ved 25 °C i 3 timer i mørket.
- Etter inokulering, legg tobakksplantene i nye Petri-retter med 10 ml sterilt vann som nedsenker røttene. Hold røttene fuktige ved å dekke med to stykker filterpapir. Oppbevar rettene ved 25 °C med en mørk fotoperiod på 16 timer.
- Etter 2-3 dager, observere sykdommen alvorlighetsgrad.
- For kontrollbehandling, legg tobakksplantene direkte i Petri-rettene med 10 ml sterilt vann som nedsenker røttene, og dekk røttene med to stykker filterpapir.
MERK: Hver behandling hadde tre replikasjoner, med 8 planter per eksperiment.
- For kontrollbehandling, legg tobakksplantene direkte i Petri-rettene med 10 ml sterilt vann som nedsenker røttene, og dekk røttene med to stykker filterpapir.
5. Evaluering av P. nikotianae infeksjon
- Evaluer sykdommen alvorlighetsgrad 4-5 dager etter inokulasjon. Basert på den kinesiske nasjonale standarden18, score individuelle plantesykdom alvorlighetsgrad på en skala fra 0 til 9 (Tabell 2, Figur 1).
- Beregn sykdomsindeksen ved hjelp av følgende formel18:
Sykdomsindeks =
der a, b, c, d, e og f er antall planter i hver sykdomsgrad.
MERK: Alvorlighetsgraden av sykdommen ble delt inn i 6 grader18 (tabell 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 uker gamle planter av resistent variasjon BH og mottakelig variasjon XHJ ble utfordret med P. nicotianae ved hjelp av metoden som presenteres i denne artikkelen. Eksperimentet ble designet med tre repliker, hver med 8 planter per gruppe. P. nikotianaeinfeksjon av de to tobakksvariantene, BH og XHJ, presenteres i figur 2. Ved 3 dager etter inokulering, for XHJ, dekket stammelesjoner omtrent halvparten av stammenomkretsen, og halvparten av bladene var litt visnet; i den resistente sorten BH ble det ikke observert noen symptomer. Ved 4 dager post inokulering oppstod blad visning og alvorlige stamme lesjoner i XHJ, mens disse symptomene ikke dukket opp i BH.
Etter 5 dager etter inokulering ble det registrert og beregnet alvorlighetsgrad av den enkelte plantesykdom basert på den kinesiske nasjonale standarden for "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests"18 (tabell 4). Gjennomsnittlig sykdomsindeks for BH var 6,48, som ble ansett som resistent (R) i henhold til standarden, og gjennomsnittlig sykdomsindeks for XHJ var 76,85, som ble ansett som utsatt (S) i henhold til standarden.
For å bekrefte inokulasjonseffektiviteten ble relativ patogenbiomasse kvantifisert av sanntids PCR (figur 3). Plante- og patogengenomisk DNA ble isolert fra infisert BH og XHJ og samlet inn ved 24 timer, 72 timer og 168 timer etter infeksjon ved hjelp av CTAB-protokollen19. Relativ patogenbiomasse ble kvantifisert ved hjelp av primerparene Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), som forsterker det 40S ribosomale proteinet S3A (WS21) av P. nicotianae20 og Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), som forsterker tobakksreferansegenet 26S rRNA gen21. Uttrykksfoldendringer mellom patogen og tobakk gDNA ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCT Ct-metoden. Resultatene av sanntids PCR bekreftet fenotypiske observasjoner.
Fem avkom fra BC4F2-populasjonen av en krysning mellom BH og XHJ og to mellomliggende resistensvarianter, K326 og Yunyan87, ble evaluert ved hjelp av zoospore suspensjonsinokuleringsmetoden og havrekorninokuleringsmetoden (tabell 5). Zoospore suspensjonsmetoden ble utført på små frøplanter, og havrekorninokulasjonsmetoden ble utført på voksne planter. For de fem avkomene fra BC4F2-populasjonen varierte sykdomsindeksen fra 16,49 til 77,60 for zoospore suspensjonsmetoden og fra 10,33 til 83,08 for havrekornmetoden. Resistensklassifiseringene mellom de to infeksjonsmetodene var for det meste i samsvar med hverandre. Med de to mellomliggende resistensvariantene, K326 og Yunyan87, viste evalueringen "resistent" i begge metodene. Disse dataene illustrerer sammenhengen mellom de to inokulasjonsmetodene, til tross for at de utføres på tobakksplanter i ulike vekstperioder.
| Opprinnelig brennevin | Andel | Opprinnelig brennevinsvolum (ml) | Næringselementer | Innhold (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) 2 SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabell 1: Hoagland næringsløsning.
| Trinn | Utseende av fenotype |
| Karakter 0 | Ingen symptomer på hele planten |
| Karakter 1 | Stammelesjoner < 1/3 stamme omkrets eller <1/3 av bladene som visner |
| Karakter 3 | Stammelesjoner mellom 1/3 og 1/2 stamme omkrets eller mellom 1/3 og 1/2 av bladene litt visne |
| Karakter 5 | Stammelesjoner >1/2 stamme omkrets, men ikke helt rundt omkretsen, eller mellom 1/2 og 2/3 av bladene som visner |
| Karakter 7 | Stammelesjoner rundt hele stammen omkrets eller >2/3 av blader som visner |
| Karakter 9 | Planter ser døde ut |
Tabell 2: Alvorlighetsgrad av black shank sykdom. Basert på den kinesiske nasjonale standarden for "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests" (GB / T 23222-2008), ble individuell plantesykdoms alvorlighetsgrad scoret på en skala fra 0 til 9.
| Sykdomsindeks | Evaluering av motstand |
| 0 | Svært motstandsdyktig eller immun (I) |
| 0,1 til 20 | Motstandsdyktig (R) |
| 20,1 til 40 | Moderat motstandsdyktig (MR) |
| 40,1 til 60 | Moderat mottakelig (MS) |
| 60,1 til 80 | Mottakelig (S) |
| 80,1 til 100 | Svært utsatt (HS) |
Tabell 3: Evaluering av resistens etter sykdomsindeks. Alvorlighetsgraden av sykdommen ble delt inn i 6 grader i henhold til sykdomsindeksen. 0 betyr svært motstandsdyktig eller immun (I), 0,1 til 20 midler motstandsdyktig (R), 20,1 til 40 betyr moderat motstandsdyktig (MR), 40,1 til 60 betyr moderat mottakelig (MS), 60,1 til 80 betyr mottakelig (S), 80,1 til 100 betyr svært utsatt (HS).
| Kultivaren | Gjenta | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sykdomsindeks | Bety | Evaluering av motstand | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabell 4: Sykdomsindeks og resistens i BH og XHJ. Gjennomsnittlig sykdomsindeks for BH var 6,48, som viser resistens (R) i henhold til standarden, og gjennomsnittlig sykdomsindeks for XHJ var 76,85, noe som viser følsomhet (S) i henhold til standarden.
| Genotype | Zoospore suspensjon | Havrekorn metode | ||||||
| Eksperiment 1 | Eksperiment 2 | Bety | Klassifisering | Eksperiment 1 | Eksperiment 2 | Bety | Klassifisering | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Jeg |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | HERR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | HERR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabell 5: P. nikotianae infeksjonsrespons i forskjellige genotyper med zoospore suspensjon inokuleringsmetode og havrekorn inokuleringsmetoden. Zoospore suspensjon inokulasjonsmetoden ble utført på små frøplanter, og havrekorninokuleringsmetoden ble utført på voksne planter. Disse dataene illustrerer sammenhengen mellom zoospore suspensjon inokulasjonsmetoden og havrekorn inokuleringsmetoden. K326 og Yunyan87 har mellomliggende nivåer av motstand, og C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 er avkom fra BC4F2-befolkningen i et kryss mellom BH og XHJ. Plantene ble klassifisert som immune, resistente, moderat motstandsdyktige, moderat utsatt, utsatt eller høy mottakelige.
Figur 1: Symptom på hver klasse. (A) Grad 0, hele planten symptomfri. (B) Grad 1, stamme lesjon <1/3 av stammen omkrets eller <1/3 blader visner. (C) Grad 3, stammeskader mellom 1/3 og 1/2 stamme omkrets eller mellom 1/3 og 1/2 av bladene litt visner. (D) Grad 5, stammeskader >1/2 stamme omkrets, men ikke helt rundt omkretsen, eller mellom 1/2 og 2/3 av bladene som visner. (E) Grad 7, stammeskader rundt hele stammen omkrets eller >2/3 av bladene visner. (F) Grad 9, planter ser døde ut. Røde piler indikerer stammelesjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Variasjon observert i to tobakksgenotyper. (A) Hele planten symptomfri i resistent variasjon BH 3 dager etter inokulering. (B) Stammelesjoner er rundt 1/2 stamme omkrets og 1/2 av bladene litt visner i XHJ 3 dager etter inokulering. (C) Hele planten symptomfri i resistent variasjon BH 4 dager etter inokulering. (D) Stammeskader >1/2 stamme omkrets, men ikke helt rundt omkretsen, og mellom 1/2 og 2/3 av bladene visner i mottakelig variasjon XHJ 4 dager etter inokulering. Røde piler indikerer stammelesjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Relativ P. nicotianae biomasse kvantifisering i infisert BH og XHJ ved 24 timer, 72 timer og 168 h post inokulering. Dette beregnes som forholdet mellom P. nicotianae WS21 genforsterkning i forhold til tobakk 26S rRNA genet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere motstandskilder har blitt brukt til å forbedre P. nicotianae motstand i dyrket tobakk. Enkelt dominerende R-gener, Php og Phl, har blitt introgressert fra henholdsvis Nicotiana plumbaginifolia og Nicotiana longiflora. Sigartobakken Beinhart 1000 har det høyeste rapporterte nivået av kvantitativ motstand mot P. nicotianae13. Flere intervallkartleggingsforsøk har antydet at minst seks kvantitative trekkloci (QTLer) kan bidra til motstanden i denne linjen13,22. I tillegg til de motstandsdyktige kildene nevnt ovenfor, har et annet fremmed gen, Wz, også blitt funnet å gi et høyt nivå av motstand mot løp 0 og rase 123,24. Tatt i betraktning de mange resistente kildene og den kompliserte genetiske bakgrunnen til resistente varianter, er det nødvendig med en presis og pålitelig metode for resistensevaluering for 1) identifisering av P. nicotianae-resistente tobakkgenotyper, 2) avlsresistente varianter og 3) molekylære mekanismestudier av plantepatogeninteraksjoner. De tidligere metodene som ble brukt for å vurdere P. nicotianae infeksjon alvorlighetsgrader var tidkrevende eller inokulasjonsintensitetene var vanskelig å kontrollere. Derfor er det presserende å sette en ny metode for P. nicotianae motstandsevaluering.
Å etterligne naturlige infeksjonsprosesser er hovedpoenget i vår nye metode. For det første, i løpet av den typiske livssyklusen til P. nicotianae, er zoosporer de store smittestoffene som initierer plantesykdommer. Når dyreparken når planteoverflaten, blir de immobile cyster, deretter spirer og danner bakterierør. Deretter produseres appressoria på spissen av bakterierørene25. I vår protokoll ble zoospor suspensjon brukt som inoculum, som etterligner den naturlige infeksjonssituasjonen. For det andre, på Nicotiana benthamiana blader, cyster spiret og koloniserte epidermale celler ved 3 h26. I Arabidopsis røtter trengte alle de encysted zoospores vellykket røttene ved 6 h post inokulering27. I vår tilnærming involverte inokulasjonsprosessen nedsenkende røtter i en P. nicotianae zoospore suspensjon i 3 timer i mørket, noe som etterligner det naturlige miljøet og fremmer koloniseringen av patogenet, og dermed fører til stabil og effektiv infeksjon.
Den mest brukte tilnærmingen til å vurdere P. nicotianae motstand i tobakk, havrekornmetoden, er effektiv og enkel for å inokulere et stort antall planter7,11,12,13,14,15,16. Imidlertid har den noen ulemper. Den største ulempen er den ukontrollerte inokuleringsintensiteten, som begrenser anvendelsen i presisjonsavl. Sammenlignet med havrekornmetoden og de to andre eksisterende tilnærmingene, i denne nye tilnærmingen, brukes zoospor suspensjon som inoculum, slik at inokulasjonsintensiteten er kontrollerbar og justerbar. Etter hvert som plantene dyrkes i et hydroponisk miljø, elimineres jordens forstyrrelser, noe som øker evalueringsnøyaktigheten. Det finnes imidlertid en begrensning for denne metoden, som er at den ikke kan brukespå voksne planter. Havregrynmetoden gjelder derimot for storskala resistensscreening av voksne planter7,13. Derfor kan denne metoden og havregrynmetoden utfylle hverandre for ulike vekstperioder av tobakksplanten og i forskjellige situasjoner.
Protokollen beskrevet her er en effektiv og pålitelig metode for å evaluere motstanden av tobakk til infeksjon av P. nicotianae på plantestadiet. Denne protokollen kan brukes til avl og for molekylær mekanismeforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31571738) og Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
