Summary
Здесь представлен протокол эффективного и точного скрининга генотипов табака на устойчивость Phytophthora nicotianae у саженцев. Это практический подход к точному разведению, а также исследованию молекулярного механизма.
Abstract
Черная голяшка, вызванная оомицетами Phytophthora nicotianae, губительна для табака, и этот патоген высокопатогенен для многих пасленовых культур. P. nicotianae хорошо приспособлен к высоким температурам; поэтому исследования этого патогена приобретают все большее значение в сельском хозяйстве во всем мире из-за глобального потепления. Устойчивые к P. nicotianae сорта табачных растений обычно проверяются путем инокуляции овсяными зернами, колонизированными P. nicotianae , и мониторинга симптомов заболевания. Тем не менее, трудно количественно оценить интенсивность прививки, поскольку точная инокуляция имеет решающее значение в этом случае. Данное исследование было направлено на разработку эффективного и надежного метода оценки устойчивости табака к инфекции P. nicotianae. Этот метод был успешно использован для идентификации резистентных сортов, а эффективность инокуляции была подтверждена ПЦР в режиме реального времени. Метод оценки резистентности, представленный в этом исследовании, является эффективным и практичным для точного разведения, а также исследования молекулярного механизма.
Introduction
P. nicotianae губителен для многих пасленовых культур. Он может вызвать табачную «черную голяшку»1, картофельную лиственную и клубневую гниль2, корону томата и сладкого перца и корневую гниль3, а также ошейник годжи и корневую гниль4. P. nicotianae может атаковать все части табачных растений, включая корни, стебли и листья на любой стадии роста5. Наиболее распространенным симптомом заболевания является черное основание стебля. Корни первоначально видны как пропитанные водой, а затем становятся некротическими, а листья показывают большие круговые поражения5. Это заболевание может быть разрушительным для табачного растения в теплице, а также в поле6. Наиболее практичным и экономичным методом борьбы с P. nicotianae является использование устойчивых сортов7. Однако для идентификации устойчивых к P. nicotianae соединений из коллекций зародышевой плазмы табака требуется эффективный протокол скрининга.
Были описаны различные методы идентификации для оценки устойчивости P. nicotianae у табака7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. В целом для идентификации генотипов табака, устойчивых к P. nicotianae, использовались три основных подхода. Первый включает смешивание мицелия с агаровой средой на пластинах Петри, содержащих P. nicotianae. Затем мицелий культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2 недель. 1 л деионизированной воды добавляют в мицелий и гомогенизируют в течение 30 с. Инокулят держат на льду до тех пор, пока это не понадобится. С каждой стороны растения делают по два отверстия (диаметром 1 см и глубиной 4-5 см), и в каждое отверстие заливается 10 мл инокулята. Затем отверстия заполняются окружающей почвой, а развитие болезни контролируется ежедневно в течение 2 недель8,10.
Во втором способе растения прививают зараженными патогенами зубочистками. Для такого подхода растения следует использовать примерно через 6 недель после пересадки и должны иметь минимальную высоту 30 см. Автоклавные зубочистки размещают на поверхности культур, содержащих мицелий P. nicotianae. Затем блюда для культуры хранят при свете при комнатной температуре в течение 7 дней. Затем колонизированные зубочистки используются для вакцинации растений. Зубочистки вставляются в стебли табака между четвертым и пятым узлами. Растения контролируются ежедневно в течение 5 дней9,15. Этот метод не применим для мелких саженцев. Поскольку инокулятив является зараженным патогенами зубочистками, интенсивность прививки не может точно контролироваться.
Наиболее часто используемый подход включает в себя зерна овса для прививки. В этом случае зерна овса готовят путем автоклавирования 500 мл овса и 300 мл деионизированной воды при 121 °С в течение 1 ч один раз в сутки в течение 3 дней. Затем зерна овса добавляют в колонизированную патогенами культуральную среду. Посуду запечатывают парафиновой пленкой и инкубируют при 25 °C при свете в течение 7-12 дней. На почве для горшков делаются четыре отдельных отверстия глубиной 5 см, по 4 см от каждого растения, и в каждое отверстие помещается одно зараженное патогенами зерно овса. Инкубационный период определяется исходя из того, когда возникает первый надземный симптом7,11,12,13,14,15,16. Этот метод эффективен и применим для крупномасштабного скрининга сопротивления. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что инокулят является зараженным патогенами зернами овса, поэтому интенсивность прививки не может точно контролироваться.
Однако здесь представлен более точный метод, который применим к оценке сопротивления камеры роста. По сравнению с другими подходами, инокулятум представляет собой зооспоровую суспензию, поэтому интенсивность прививки контролируется и регулируется. Поскольку растения табака в этом исследовании культивируются без почвы, результаты легче наблюдать. Кроме того, отбор проб корней растений из почвы всегда приводит к повреждению корней, что вызывает ряд физиологических реакций17. В этом методе, поскольку растения культивируются без почвы, вмешательство в повреждение корней может быть устранено. В заключение, этот метод более практичен для исследования молекулярных механизмов и точного разведения. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 5 дней, при этом более 200 растений оцениваются в одном эксперименте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Материалы
- Получают сорта табака.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента "Beinhart1000-1" (выборка Beinhart 1000) (BH) и "Xiaohuangjin1025" (XHJ) были получены из Национального среднесрочного генбанка ресурса зародышевой плазмы табака Китая. BH устойчив, тогда как XHJ восприимчив к инфекции P. nicotianae16. Полевой изолят расы P. nicotianae 0, который сохранился в Научно-исследовательском институте табака Китайской академии сельскохозяйственных наук, использовался для всех прививок на протяжении всего исследования.
2. Посадка генотипов табака для оценки устойчивости к P. nicotianae
- Смешайте семена табака с вермикулитом и аккуратно распределите семена на стерилизованную почву для горшков. Поместите горшки в камеру роста. Поддерживайте постоянную температуру 25 °C, при 16 ч света/8 ч темного фотопериода.
- Подготовьте гидропонные устройства с лотками и пенопластовыми листами. После того, как семена прорастут, выколите рассаду из горшечной почвы, осторожно промойте корни стерильной деионизированной водой и пересадите их в гидропонные устройства.
- Поместите приборы в климатические камеры при температуре 25 °C при 16-часовом свете/8 ч темного фотопериода в течение 24 ч.
- Заранее приготовьте питательный раствор Hoagland (таблица 1). Пересадите рассаду на гидропонные устройства питательным раствором Hoagland (примерно 125 мл на растение).
- Поместите приборы в климатическую камеру при температуре 25 °C при 16-часовом свете/8 ч темного фотопериода на 2 недели.
3. Приготовление суспензии зооспоры P. nicotianae
- Приготовить овсяный агар средней.
- Взвесьте 33 г овсянки и переложите на стеклянную посуду и добавьте 1000 мл стерильной воды. Варить на электромагнитной плите духовке.
- После того, как овсянка станет липкой, процедите жидкий раствор через кусочек стерильной марли.
- Налейте жидкий раствор в градуированный цилиндр объемом 1000 мл и отрегулируйте объем до 1000 мл стерильной водой.
- Налейте жидкий раствор в стеклянный флакон с реагентом и добавьте 18 г агара. Хорошо встряхните и автоклавируйте смесь (овсяную агаровую среду) при 121 °C в течение 15 мин. Оставьте при комнатной температуре на 30 мин.
- Налейте около 20 мл стерилизованной овсяной агаровой среды в каждую чашку Петри. Оставьте чашку Петри при комнатной температуре тщательно остыть перед культивированием мицелиальности.
- Проводят мицелиальную культивацию.
- Заранее подготовьте перфораторы и зубочистки диаметром 1 см, автоклавировав их при 121 °C в течение 15 мин.
- Проделайте отверстия в культурах мицелиального агара P. nicotianae , чтобы сделать круглые мицелиальные маты.
- Выделите мицелиальные маты, поместите мицелиальную сторону вниз на овсяную агаровую среду и инкубируйте мицелий при 25 °C в темноте в течение 14 дней.
- Приготовить суспензию зооспоры P. nicotianae .
- Добавляйте 0,1% раствор KNO3 к каждой культивации мицелиала (15 мл/блюдо) с последующим культивированием при 4 °C в течение 20 мин для индуцирования спорангия.
- Держите блюда при температуре 25 °C в течение 25 минут, чтобы освободить зооспоры.
- Соберите суспензию зооспоры в стакан и измерьте концентрацию зооспоры с помощью микроскопа и гемоцитометра.
- Отрегулируйте концентрацию зооспоры до 1 x 104 зооспор/мл со стерильной водой.
4. Идентификация устойчивых к болезням сортов табака
- Возьмите рассаду из питательного раствора Hoagland и привите их, погружая корни в 20 мл суспензии зооспоры P. nicotianae в чашку Петри (90 мм) при 25 °C в течение 3 ч в темноте.
- После прививки поместите саженцы табака в новые чашки Петри с 10 мл стерильной воды, погружающей корни. Держите корни влажными, покрыв двумя кусочками фильтровальной бумаги. Держите посуду при температуре 25 °C с 16-часовым светлым/ 8-часовым темным фотопериодом.
- Через 2-3 дня наблюдают тяжесть заболевания.
- Для контрольной обработки поместите саженцы табака непосредственно в чашку Петри со 10 мл стерильной воды, погружающей корни, и накройте корни двумя кусочками фильтровальной бумаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая обработка имела три репликации, с 8 растениями в эксперименте.
- Для контрольной обработки поместите саженцы табака непосредственно в чашку Петри со 10 мл стерильной воды, погружающей корни, и накройте корни двумя кусочками фильтровальной бумаги.
5. Оценка инфекции P. nicotianae
- Оценить тяжесть заболевания через 4-5 дней после прививки. Основываясь на китайском национальном стандарте18, оценивайте тяжесть отдельных заболеваний растений по шкале от 0 до 9 (таблица 2, рисунок 1).
- Рассчитайте индекс заболеваемости по следующей формуле18:
Индекс заболевания =
где a, b, c, d, e и f — количество растений в каждой степени тяжести заболевания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжесть заболевания была разделена на 6 степеней18 (табл. 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4-недельным растениям резистентного сорта BH и восприимчивого сорта XHJ был брошен вызов P. nicotianae с использованием метода, представленного в этой статье. Эксперимент был разработан с тремя репликами, каждая с 8 растениями на группу. Инфекция P. nicotianae двух разновидностей табака, BH и XHJ, представлена на рисунке 2. Через 3 дня после прививки для XHJ поражения стебля покрывали примерно половину обхвата стебля, а половина листьев была слегка увядшей; у резистентной разновидности BH никаких симптомов не наблюдалось. Через 4 дня после прививки увядание листьев и тяжелые поражения стеблей происходили в XHJ, тогда как эти симптомы не появлялись в BH.
Через 5 дней после прививки регистрировалась и рассчитывалась индивидуальная тяжесть заболевания растений на основе китайского национального стандарта «Сорт и метод исследования табачных заболеваний и насекомых-вредителей»18 (таблица 4). Средний индекс заболевания BH составил 6,48, который считался устойчивым (R) в соответствии со стандартом, а средний индекс заболевания XHJ составил 76,85, который считался восприимчивым (S) в соответствии со стандартом.
Чтобы подтвердить эффективность прививки, относительная биомасса патогена была количественно определена с помощью ПЦР в режиме реального времени (рисунок 3). Геномная ДНК растений и патогенов была выделена из инфицированных BH и XHJ и собрана через 24 ч, 72 ч и 168 ч после заражения с использованием протокола CTAB19. Относительная биомасса патогена была количественно определена с использованием пар праймеров Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), усиливающих 40S рибосомный белок S3A (WS21) P. nicotianae20 и Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), усиливая референтный ген табака 26S rRNA gene21. Изменения складки экспрессии между патогеном и табачной гДНК рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCT Ct. Результаты ПЦР в режиме реального времени подтвердили фенотипические наблюдения.
Пять потомков из популяции BC4F2 скрещивания между BH и XHJ и двух разновидностей промежуточной резистентности, K326 и Yunyan87, были оценены с использованием метода инокуляции суспензии зооспоры и метода посева овсяных зерен (таблица 5). Метод зооспоровой суспензии выполняли на мелких саженцах, а метод прививки овсяных зерен выполняли на взрослых растениях. Для пяти потомков из популяции BC4F2 индекс заболеваемости варьировался от 16,49 до 77,60 для метода суспензии зооспоры и от 10,33 до 83,08 для метода овсяных зерен. Классификации резистентности между двумя методами заражения в основном соответствовали друг другу. С двумя промежуточными разновидностями сопротивления, K326 и Yunyan87, оценка показала «устойчивость» в обоих методах. Эти данные иллюстрируют корреляцию между двумя методами вакцинации, несмотря на то, что они выполняются на табачных растениях в разные периоды роста.
| Оригинальный ликер | Пропорция | Объем оригинального ликера (мл) | Питательные элементы | Содержание (g) |
| ПР 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| ПР 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| ПР 3 | 1000× | 500 | НаН2ПО4•2 Н2О | 19.5 |
| ПР 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| ПР 5 | 1000× | 500 | (NH4) 2 См. СО4 | 123.75 |
| ПР 6 | 1000× | 500 | КаCl2 | 104.06 |
| ПР 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-ЭДТА | 3.73 | |||
| ОЛ 8 | 1000× | 500 | К2СО4 | 87.1 |
| ПР 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Таблица 1: Питательный раствор Хоугланда.
| Степень | Появление фенотипа |
| Класс 0 | Нет симптомов на всем растении |
| 1 класс | Поражения стеблей < 1/3 обхвата стебля или <1/3 увядания листьев |
| Класс 3 | Поражения стеблей между 1/3 и 1/2 обхвата стебля или между 1/3 и 1/2 листьев, слегка увядающих |
| 5 класс | Поражения стебля >1/2 обхвата стебля, но не полностью вокруг обхвата или между 1/2 и 2/3 увядания листьев |
| 7 класс | Поражения стеблей вокруг всего обхвата стебля или >2/3 увядания листьев |
| 9 класс | Растения выглядят мертвыми |
Таблица 2: Рейтинг тяжести заболевания черной голяшкой. На основе китайского национального стандарта «Сорт и метод исследования табачных болезней и насекомых-вредителей» (GB/T 23222-2008) индивидуальная тяжесть заболевания растений оценивалась по шкале от 0 до 9.
| Индекс заболеваемости | Оценка сопротивления |
| 0 | Высокая устойчивость или иммунитет (I) |
| 0.1 до 20 | Стойкий (R) |
| 20.1 до 40 | Умеренно устойчивый (MR) |
| 40.1 до 60 | Умеренно восприимчивый (РС) |
| 60.1 до 80 | Восприимчивый (S) |
| 80.1 до 100 | Высокая восприимчивость (HS) |
Таблица 3: Оценка резистентности по индексу заболевания. Тяжесть заболевания была разделена на 6 степеней по индексу заболевания. 0 означает высокую резистентность или иммунитет (I), 0,1-20 означает резистентность (R), 20,1-40 означает умеренно резистентную (MR), 40,1-60 означает умеренно восприимчивую (MS), 60,1-80 означает восприимчивую (S), 80,1-100 означает высокую восприимчивость (HS).
| Сорт | Повторять | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Индекс заболеваемости | Значить | Оценка сопротивления | |
| БГ | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Таблица 4: Индекс заболеваемости и резистентность в BH и XHJ. Средний индекс заболевания BH составил 6,48, что показывает резистентность (R) в соответствии со стандартом, а средний индекс заболевания XHJ составил 76,85, что показывает восприимчивость (S) в соответствии со стандартом.
| Генотип | Зооспоровая подвеска | Метод овсяных зерен | ||||||
| Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Значить | Классификация | Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Значить | Классификация | |
| БГ | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Я |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | ТН ВЭД |
| К326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Юнян87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| С42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | МИСТЕР | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| С13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | МИСТЕР |
| С9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | ТН ВЭД |
| С46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | ГОСПОЖА | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| С66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | ТН ВЭД |
Таблица 5: Реакция на инфекцию P. nicotianae в различных генотипах методом инокуляции зооспоровой суспензии и методом инокуляции овсяных зерен. Метод инокуляции зооспоровой суспензии проводили на мелких саженцах, а метод посева овсяных зерен проводили на взрослых растениях. Эти данные иллюстрируют корреляцию между методом инокуляции зооспоровой суспензии и методом инокуляции овсяных зерен. K326 и Yunyan87 имеют промежуточные уровни резистентности, а C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 являются потомками из популяции BC4F2 скрещивания между BH и XHJ. Растения были классифицированы как иммунные, устойчивые, умеренно устойчивые, умеренно восприимчивые, восприимчивые или высокочувствительные.
Рисунок 1: Симптом каждого сорта. (А) Степень 0, все растение без симптомов. (B) Степень 1, поражение стебля <1/3 обхвата стебля или <1/3 увядания листьев. (C) Степень 3, поражения стебля между 1/3 и 1/2 обхвата стебля или между 1/3 и 1/2 листьев, слегка увядающих. (D) Степень 5, поражения стебля >1/2 обхвата стебля, но не полностью вокруг обхвата или между 1/2 и 2/3 увядания листьев. (E) Степень 7, поражения стебля вокруг всего обхвата стебля или >2/3 увядания листьев. (F) 9 класс, растения выглядят мертвыми. Красные стрелки указывают на поражения стебля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Вариации, наблюдаемые в двух генотипах табака. (А) Цельное растение без симптомов у резистентного сорта BH через 3 дня после посева. (B) Поражения стеблей составляют около 1/2 обхвата стебля и 1/2 листьев, слегка увядающих в XHJ через 3 дня после прививки. (C) Цельное растение без симптомов у резистентного сорта BH через 4 дня после прививки. (D) Поражения стебля >1/2 обхвата стебля, но не полностью вокруг обхвата, и от 1/2 до 2/3 листьев, увядающих у восприимчивой разновидности XHJ через 4 дня после посева. Красные стрелки указывают на поражения стебля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Относительная количественная оценка биомассы P. nicotianae в инфицированных BH и XHJ через 24 ч, 72 ч и 168 ч после посева. Это рассчитывается как отношение амплификации гена P. nicotianae WS21 по сравнению с геном 26S рРНК табака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многочисленные источники резистентности были использованы для улучшения устойчивости P. nicotianae в культивируемом табаке. Одиночные доминантные гены R, Php и Phl, были интрогрессированы из Nicotiana plumbaginifolia и Nicotiana longiflora, соответственно10. Сорт сигарного табака Beinhart 1000 имеет самый высокий зарегистрированный уровень количественной устойчивости к P. nicotianae13. Многочисленные эксперименты по интервальному отображению показали, что по меньшей мере шесть количественных локусов признаков (QTL) могут способствовать сопротивлению в этой линии13,22. В дополнение к резистентным источникам, упомянутым выше, было также обнаружено, что другой чужеродный ген, Wz, придает высокий уровень устойчивости к расе 0 и расе 123,24. Учитывая множественные устойчивые источники и сложный генетический фон резистентных сортов, требуется точный и надежный метод оценки резистентности для 1) идентификации генотипов табака, устойчивых к P. nicotianae, 2) селекции устойчивых сортов и 3) исследования молекулярного механизма взаимодействия растений и патогенов. Предыдущие методы, используемые для оценки тяжести инфекции P. nicotianae, были трудоемкими или интенсивность прививок было трудно контролировать. Следовательно, необходимо срочно установить новый метод оценки резистентности P. nicotianae.
Имитация естественных инфекционных процессов является ключевым моментом в нашем новом методе. Во-первых, во время типичного жизненного цикла P. nicotianae зооспоры являются основными инфекционными агентами, которые инициируют болезни растений. Как только зооспоры достигают поверхности растения, они становятся неподвижными цистами, впоследствии прорастают и образуют зародышевые трубки. Затем аппрессории образуются на кончике зародышевых трубок25. В нашем протоколе в качестве инокулята использовалась суспензия зооспоры, которая имитирует естественную инфекционную ситуацию. Во-вторых, на листьях Nicotiana benthamiana цисты прорастали и колонизировали эпидермальные клетки при 3 h26. В корнях Арабидопсиса все энцистские зооспоры успешно проникали в корни через 6 ч после прививки27. В нашем подходе процесс прививки включал погружение корней в суспензию зооспоры P. nicotianae на 3 ч в темноте, которая имитирует природную среду и способствует колонизации патогена, что приводит к стабильной и эффективной инфекции.
Наиболее часто используемый подход к оценке устойчивости P. nicotianae в табаке, метод овсяных зерен, эффективен и прост для инокуляции большого количества растений7,11,12,13,14,15,16. Однако у него есть и некоторые недостатки. Основным недостатком является неконтролируемая интенсивность прививки, что ограничивает ее применение в точном разведении. По сравнению с методом овсяных зерен и двумя другими существующими подходами, в этом новом подходе суспензия зооспоры используется в качестве инокулята, поэтому интенсивность прививки контролируется и регулируется. Поскольку растения культивируются в гидропонной среде, вмешательство почвы устраняется, что повышает точность оценки. Однако для этого метода существует одно ограничение, которое заключается в том, что он не может быть использован на взрослых растениях. Метод овсяного зерна, с другой стороны, применим для крупномасштабного скрининга резистентности взрослых растений7,13. Поэтому этот способ и метод овсяного зерна могут дополнять друг друга в разные периоды роста табачного растения и в разных ситуациях.
Описанный здесь протокол является эффективным и надежным методом оценки устойчивости табака к инфекции P. nicotianae на стадии рассады. Этот протокол может быть использован для селекции и для исследования молекулярного механизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31571738) и Инновационной программой сельскохозяйственной науки и техники Китая (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
