Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de efficiënte en nauwkeurige screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae-resistentie bij zaailingen. Dit is een praktische benadering voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.
Abstract
Zwarte schacht, veroorzaakt door de oomyceten Phytophthora nicotianae, is destructief voor tabak en deze ziekteverwekker is hoogpathogeen voor veel solanaceous gewassen. P. nicotianae is goed aangepast aan hoge temperaturen; daarom wint onderzoek naar deze ziekteverwekker wereldwijd aan belang in de landbouw vanwege de opwarming van de aarde. P. nicotianae-resistente variëteiten van tabaksplanten worden vaak gescreend door inenting met haverkorrels gekoloniseerd door P. nicotianae en controle op de ziektesymptomen. Het is echter moeilijk om de inentingsintensiteit te kwantificeren, omdat nauwkeurige inenting in dit geval cruciaal is. Deze studie had tot doel een efficiënte en betrouwbare methode te ontwikkelen voor het evalueren van de resistentie van tabak tegen infectie met P. nicotianae. Deze methode is met succes gebruikt om resistente variëteiten te identificeren en de inentingsefficiëntie werd bevestigd door real-time PCR. De resistentie-evaluatiemethode die in deze studie wordt gepresenteerd, is efficiënt en praktisch voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.
Introduction
P. nicotianae is destructief voor veel solanaceous gewassen. Het kan tabak "zwarte schacht"1, aardappelblad en knolrot2, tomaat en paprika kroon en wortelrot3, en Goji kraag en wortelrot4 veroorzaken. P. nicotianae kan alle delen van tabaksplanten aanvallen, inclusief de wortels, stengels en bladeren in elk groeistadium5. Het meest voorkomende symptoom van de ziekte is de zwarte basis van de stengel. De wortels zijn aanvankelijk zichtbaar als met water doordrenkt en worden vervolgens necrotisch en de bladeren vertonen grote cirkelvormige laesies5. Deze ziekte kan verwoestend zijn voor een tabaksplant in de kas, maar ook in het veld6. De meest praktische en economische methode voor het beheersen van P. nicotianae is het gebruik van resistente variëteiten7. Er is echter een effectief screeningsprotocol vereist voor de identificatie van P. nicotianae-resistente toetredingen uit tabakskiemplasmacollecties.
Er zijn verschillende identificatiemethoden beschreven om de resistentie van P. nicotianae in tabak te beoordelen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Over het algemeen zijn drie belangrijke benaderingen gebruikt voor de identificatie van P. nicotianae-resistente tabaksgenotypes. De eerste omvat het mengen van mycelia met agar medium op petriplaten met P. nicotianae. De mycelia worden vervolgens gedurende 2 weken in het donker bij kamertemperatuur gekweekt. 1 L gedeïoniseerd water wordt toegevoegd aan de mycelia en gehomogeniseerd gedurende 30 s. Het entmateriaal wordt op ijs gehouden tot het nodig is. Twee gaten (1 cm in diameter en 4-5 cm diep) worden aan elke kant van de plant gemaakt en 10 ml van het entmateriaal wordt in elk gat gegoten. De gaten worden vervolgens opgevuld met de omringende grond en de ontwikkeling van ziekten wordt dagelijks gedurende 2 weken gemonitord8,10.
Bij de tweede methode worden de planten ingeënt met met ziekteverwekkers besmette tandenstokers. Voor deze aanpak moeten de planten ongeveer 6 weken na het verplanten worden gebruikt en een minimale hoogte van 30 cm hebben. Geautoclaveerde tandenstokers worden geplaatst op het oppervlak van culturen die P. nicotianae mycelia bevatten. De kweekschotels worden vervolgens 7 dagen onder het licht bij kamertemperatuur bewaard. Vervolgens worden gekoloniseerde tandenstokers gebruikt om de planten te enten. Tandenstokers worden in de tabaksstengels tussen de vierde en vijfde knop ingebracht. De planten worden dagelijks gedurende 5 dagen gemonitord9,15. Deze methode is niet van toepassing op kleine zaailingen. Omdat het entmateriaal met ziekteverwekkers besmet is, kan de intensiteit van de inenting niet nauwkeurig worden gecontroleerd.
De meest gebruikte aanpak omvat haverkorrels voor inenting. In dit geval worden haverkorrels bereid door 500 ml haver en 300 ml gedeïoniseerd water bij 121 ° C gedurende 1 uur eenmaal daags gedurende 3 dagen te autoclaveren. Vervolgens worden haverkorrels toegevoegd aan het pathogeen-gekoloniseerde kweekmedium. De gerechten worden afgesloten met paraffinefilm en geïncubeerd bij 25 °C in licht gedurende 7-12 dagen. Vier afzonderlijke 5 cm diepe gaten worden gemaaktop de potgrond, 4 cm van elke plant, en één met ziekteverwekkers aangetaste haverkorrel wordt in elk gat geplaatst. De incubatietijd wordt bepaald op basis van wanneer het eerste bovengrondse symptoom optreedt7,11,12,13,14,15,16. Deze methode is efficiënt en toepasbaar voor grootschalige weerstandsscreening. Een beperking van deze benadering is echter dat het entmateriaal pathogene aangetaste haverkorrels zijn, waardoor de inentingsintensiteit niet precies kan worden gecontroleerd.
Hier wordt echter een nauwkeurigere methode gepresenteerd die van toepassing is op de evaluatie van de groeikamerweerstand. In vergelijking met de andere benaderingen is het entmateriaal zoospore-suspensie, vandaar dat de inentingsintensiteit controleerbaar en instelbaar is. Omdat de tabaksplanten in deze studie zonder grond worden gekweekt, zijn de resultaten gemakkelijker waar te nemen. Bovendien veroorzaakt het bemonsteren van plantenwortels uit de grond altijd schade aan de wortels, wat een reeks fysiologische reacties veroorzaakt17. Bij deze methode, omdat planten zonder grond worden gekweekt, kan de interferentie in wortelschade worden geëlimineerd. Kortom, deze methode is praktischer voor moleculair mechanismeonderzoek en precisieveredeling. Met behulp van dit protocol worden gegevens meestal binnen 5 dagen verkregen, met meer dan 200 planten geëvalueerd in een enkel experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialen
- Verkrijg tabaksvariëteiten.
OPMERKING: Voor dit experiment werden "Beinhart1000-1" (een selectie van Beinhart 1000) (BH) en "Xiaohuangjin1025" (XHJ) verkregen van de National Medium-term Genbank van de Tobacco Germplasm Resource of China. BH is resistent, terwijl XHJ gevoelig is voor P. nicotianae-infectie16. Een veldisolaat van P. nicotianae ras 0, dat werd bewaard in het Tobacco Research Institute van de Chinese Academie voor Landbouwwetenschappen, werd gebruikt voor alle inentingen gedurende de studie.
2. Planten van tabak genotypen voor P. nicotianae resistentie evaluatie
- Meng tabakszaden met vermiculiet en stralen de zaden voorzichtig uit op de gesteriliseerde potgrond. Plaats de potten in de groeikamer. Handhaaf een constante temperatuur van 25 °C, onder een licht-/8-uurs donkere fotoperiode van 16 uur.
- Bereid hydroponische apparaten voor met trays en schuimplaten. Nadat de zaden zijn ontkiemd, prik je zaailingen uit de potgrond, was je de wortels voorzichtig met steriel gedeïoniseerd water en transplanteer je ze in de hydroponische apparaten.
- Plaats de apparaten in klimaatkamers bij 25 °C onder een 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode gedurende 24 uur.
- Bereid de Hoagland-voedingsoplossing vooraf voor (tabel 1). Transplanteer de zaailingen naar hydroponische apparaten met Hoagland-voedingsoplossing (ongeveer 125 ml per plant).
- Plaats de apparaten gedurende 2 weken in een klimaatkamer bij 25 °C onder een fotoperiode van 16 uur licht/8 uur donker.
3. Bereiding van P. nicotianae zoospore suspensie
- Bereid havermout agar medium.
- Weeg 33 g havermout en breng over op glaswerk en voeg 1.000 ml steriel water toe. Kook op een elektromagnetische kookplaat oven.
- Nadat de havermout kleverig is geworden, zeeft u de vloeibare oplossing door een stuk steriel gaas.
- Giet de vloeibare oplossing in een maatcilinder van 1.000 ml en stel het volume in op 1.000 ml met steriel water.
- Giet de vloeibare oplossing in een glazen reagensfles en voeg 18 g agar toe. Schud goed en autoclaaf het mengsel (havermout agar medium) bij 121 °C gedurende 15 min. Laat het 30 min op kamertemperatuur staan.
- Giet ongeveer 20 ml van het gesteriliseerde havermout agar medium in elke petrischaal. Laat de petrischaaltjes op kamertemperatuur goed afkoelen voor de myceliale teelt.
- Voer myceliale cultivatie uit.
- Bereid ponsen en tandenstokers met een diameter van 1 cm vooraf voor door ze gedurende 15 minuten te autoclaveren bij 121 °C.
- Prik gaten in de P. nicotianae myceliale agarculturen om ronde myceliale matten te maken.
- Kies de myceliale matten, plaats de myceliale kant naar beneden op het havermout agar medium en incubeer het mycelium bij 25 °C in het donker gedurende 14 dagen.
- Bereid P. nicotianae zoospore suspensie.
- Voeg 0,1% KNO3-oplossing toe aan elke myceliale teelt (15 ml/schaal), gevolgd door kweken bij 4 °C gedurende 20 minuten om sporangium te induceren.
- Houd de schotels 25 minuten op 25 °C om zoösporen vrij te maken.
- Verzamel de zoospore-suspensie in een bekerglas en meet de zoospore-concentratie met behulp van een microscoop enhemocytometer.
- Stel de zoosporeconcentratie in op 1 x 104 zoösporen/ml met steriel water.
4. Identificatie van ziekteresistente tabakssoorten
- Neem de zaailingen uit de Hoagland-voedingsoplossing en ent ze in door de wortels in 20 ml P. nicotianae zoospore-suspensie onder te dompelen in een petrischaal (90 mm) bij 25 °C gedurende 3 uur in het donker.
- Doe na het inenten de tabakszaailingen in nieuwe petrischalen met 10 ml steriel water dat de wortels onderdompelt. Houd de wortels vochtig door ze af te dekken met twee stukjes filtreerpapier. Houd de gerechten op 25 °C met een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode.
- Na 2-3 dagen, observeer de ernst van de ziekte.
- Voor de controlebehandeling plaatst u de tabakszaailingen direct in de petrischalen met 10 ml steriel water dat de wortels onderdompelt en bedek de wortels met twee stukken filterpapier.
OPMERKING: Elke behandeling had drie replicaties, met 8 planten per experiment.
- Voor de controlebehandeling plaatst u de tabakszaailingen direct in de petrischalen met 10 ml steriel water dat de wortels onderdompelt en bedek de wortels met twee stukken filterpapier.
5. Evaluatie van P. nicotianae infectie
- Evalueer de ernst van de ziekte 4-5 dagen na inenting. Op basis van de Chinese nationale standaard18, score individuele plantziekte ernst op een schaal van 0 tot 9 (tabel 2, figuur 1).
- Bereken de ziekte-index met behulp van de volgende formule18:
Ziekte-index =
waarbij a, b, c, d, e en f het aantal planten in elke ernstgraad van de ziekte zijn.
OPMERKING: De ernst van de ziekte was verdeeld in 6 graden18 (tabel 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 weken oude planten van het resistente ras BH en het vatbare ras XHJ werden uitgedaagd met P. nicotianae volgens de methode die in dit artikel wordt gepresenteerd. Het experiment was ontworpen met drie replicaties, elk met 8 planten per groep. P. nicotianae-infectie van de twee tabakssoorten, BH en XHJ, is weergegeven in figuur 2. 3 dagen na de inenting, voor XHJ, bedekten stengellaesies ongeveer de helft van de stengelomtrek en de helft van de bladeren was licht verwelkt; bij het resistente ras BH werden geen symptomen waargenomen. 4 dagen na inenting traden bladverwelking en ernstige stengellaesies op bij XHJ, terwijl deze symptomen niet bij BH optraden.
5 dagen na de inenting werd de ernst van de individuele plantenziekte geregistreerd en berekend op basis van de Chinese nationale norm voor de "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests"18 (tabel 4). De gemiddelde ziekte-index van BH was 6,48, die volgens de standaard als resistent (R) werd beschouwd, en de gemiddelde ziekte-index van XHJ was 76,85, wat volgens de standaard als vatbaar (S) werd beschouwd.
Om de inentingsefficiëntie te bevestigen, werd de relatieve pathogene biomassa gekwantificeerd door real-time PCR (figuur 3). Plantaardig en pathogeen genomisch DNA werden geïsoleerd uit geïnfecteerde BH en XHJ en verzameld op 24 uur, 72 uur en 168 uur na infectie met behulp van het CTAB-protocol19. Relatieve pathogene biomassa werd gekwantificeerd met behulp van de primerparen Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), waarbij het 40S ribosomale eiwit S3A (WS21) van P. nicotianae20 en Nt-Fw (5'-CAAGGACACCCCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3' werden versterkt, waarbij het tabaksreferentiegen 26S rRNA-gen21 werd versterkt. Expressievouwveranderingen tussen pathogeen en tabaksgDNA werden berekend met behulp van de 2-ΔΔCT Ct-methode. De resultaten van de real-time PCR bevestigden de fenotypische waarnemingen.
Vijf nakomelingen uit de BC4F2-populatie van een kruising tussen BH en XHJ en twee intermediaire resistentievariëteiten, K326 en Yunyan87, werden geëvalueerd met behulp van de zoospore suspensie-inentingsmethode en de haverkorrelinentingsmethode (tabel 5). De zoospore-suspensiemethode werd uitgevoerd op kleine zaailingen en de haverkorrelinentingsmethode werd uitgevoerd op volwassen planten. Voor de vijf nakomelingen uit de BC4F2-populatie varieerde de ziekte-index van 16,49 tot 77,60 voor de zoospore-suspensiemethode en van 10,33 tot 83,08 voor de haverkorrelmethode. De resistentieclassificaties tussen de twee infectiemethoden waren meestal consistent met elkaar. Bij de twee tussenliggende resistentievariëteiten, K326 en Yunyan87, toonde de evaluatie "resistent" in beide methoden. Deze gegevens illustreren de correlatie tussen de twee inentingsmethoden, ondanks dat ze in verschillende groeiperioden op tabaksplanten worden uitgevoerd.
| Originele likeur | Proportie | Oorspronkelijk vloeistofvolume (ml) | Voedingselementen | Inhoud (g) |
| 1e republiek | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| 2e | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| 3e | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| 4e | 1000× | 500 | Nh4No3 | 75.04 |
| 5e | 1000× | 500 | (NH4) Arabisch cijfer SO4 | 123.75 |
| 6e | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| 7e | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| 8e | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| Blz. 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 mo7o24•2 h2o | 0.36 |
Tabel 1: Hoagland voedingsoplossing.
| Graad | Uiterlijk van fenotype |
| Graad 0 | Geen symptomen op de hele plant |
| Graad 1 | Stengellaesies < 1/3 van de stengelomtrek of <1/3 van de bladeren die verwelken |
| Graad 3 | Stengellaesies tussen 1/3 en 1/2 van de stengelomtrek of tussen 1/3 en 1/2 van de bladeren die licht verwelken |
| Graad 5 | Stengellaesies >1/2 van de stengelomtrek, maar niet volledig rond de omtrek, of tussen 1/2 en 2/3 van de bladeren die verwelken |
| Graad 7 | Stengellaesies rond hele stengelomtrek of >2/3 van bladeren verwelken |
| Graad 9 | Planten zien er dood uit |
Tabel 2: Ernst van de zwarte schachtziekte. Op basis van de Chinese nationale standaard voor de "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests" (GB/T 23222-2008) werd de ernst van individuele plantenziekten gescoord op een schaal van 0 tot 9.
| Ziekte index | Evaluatie van resistentie |
| 0 | Zeer resistent of immuun (I) |
| 0,1 tot 20 | Resistent (R) |
| 20,1 tot 40 | Matig resistent (MR) |
| 40,1 tot 60 | Matig gevoelig (MS) |
| 60,1 tot 80 | Vatbaar (S) |
| 80,1 tot 100 | Zeer gevoelig (HS) |
Tabel 3: Evaluatie van de resistentie volgens de ziekte-index. De ernst van de ziekte werd verdeeld in 6 graden volgens de ziekte-index. 0 betekent zeer resistent of immuun (I), 0,1 tot 20 betekent resistent (R), 20,1 tot 40 betekent matig resistent (MR), 40,1 tot 60 betekent matig gevoelig (MS), 60,1 tot 80 betekent vatbaar (S), 80,1 tot 100 betekent zeer gevoelig (HS).
| Cultivar | Herhalen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Ziekte index | Bedoelen | Evaluatie van resistentie | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabel 4: Ziekte-index en resistentie bij BH en XHJ. De gemiddelde ziekte-index van BH was 6,48, wat resistentie (R) toont volgens de standaard, en de gemiddelde ziekte-index van XHJ was 76,85, wat gevoeligheid (S) volgens de standaard laat zien.
| Genotype | Zoospore suspensie | Haverkorrels methode | ||||||
| Experiment 1 | Experimenteer 2 | Bedoelen | Classificatie | Experiment 1 | Experimenteer 2 | Bedoelen | Classificatie | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Ik |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | MENEER | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | MENEER |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MEVROUW | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabel 5: P. nicotianae infectierespons bij verschillende genotypen met de zoospore suspensie-inentingsmethode en de haverkorrelinentingsmethode. De zoospore suspensie-inentingsmethode werd uitgevoerd op kleine zaailingen en de haverkorrelinentingsmethode werd uitgevoerd op volwassen planten. Deze gegevens illustreren de correlatie tussen de zoospore suspensie-inentingsmethode en de haverkorrelinentingsmethode. K326 en Yunyan87 hebben tussenliggende niveaus van resistentie, en C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 zijn nakomelingen uit de BC4F2-populatie van een kruising tussen BH en XHJ. De planten werden geclassificeerd als immuun, resistent, matig resistent, matig vatbaar, vatbaar of hoog vatbaar.
Figuur 1: Symptoom van elke graad. (A) Graad 0, hele plant symptoomvrij. (B) Graad 1, stengellaesie <1/3 van de stengelomtrek of <1/3 bladeren verwelken. (C) Graad 3, stengellaesies tussen 1/3 en 1/2 van de stengelomtrek of tussen 1/3 en 1/2 van de bladeren die licht verwelken. (D) Graad 5, stengellaesies >1/2 van de stengelomtrek, maar niet volledig rond de omtrek, of tussen 1/2 en 2/3 van de bladeren die verwelken. (E) Graad 7, stengellaesies rond de hele stengelomtrek of >2/3 van bladeren die verwelken. (F) Graad 9, planten zien er dood uit. Rode pijlen geven de stengellaesies aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Variatie waargenomen in twee tabaksgenotypes. (A) Hele plant symptoomvrij in resistente variëteit BH 3 dagen na inenting. (B) Stengellaesies zijn ongeveer 1/2 van de stengelomtrek en 1/2 van de bladeren die licht verwelken in XHJ 3 dagen na inenting. (C) Hele plant symptoomvrij in resistent ras BH 4 dagen na inenting. (D) Stengellaesies >1/2 van de stengelomtrek, maar niet volledig rond de omtrek, en tussen 1/2 en 2/3 van de bladeren die verwelken bij het vatbare ras XHJ 4 dagen na inenting. Rode pijlen geven de stengellaesies aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Relatieve P. nicotianae biomassa kwantificering in geïnfecteerde BH en XHJ op 24 h, 72 h en 168 h na inenting. Dit wordt berekend als de verhouding van P. nicotianae WS21 gen amplificatie in vergelijking met het tabak 26S rRNA gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meerdere resistentiebronnen zijn gebruikt om de P. nicotianae-resistentie in gekweekte tabak te verbeteren. Enkele dominante R-genen, Php en Phl, zijn introgressed van respectievelijk Nicotiana plumbaginifolia en Nicotiana longiflora10. De sigarentabakvariëteit Beinhart 1000 heeft het hoogste gerapporteerde niveau van kwantitatieve resistentie tegen P. nicotianae13. Meerdere interval mapping experimenten hebben gesuggereerd dat ten minste zes kwantitatieve trait loci (QTLs) kunnen bijdragen aan de resistentie in deze lijn13,22. Naast de hierboven genoemde resistente bronnen, is ook een ander buitenaards gen, Wz, gevonden om een hoog niveau van resistentie te verlenen tegen ras 0 en ras 123,24. Gezien de vele resistente bronnen en de gecompliceerde genetische achtergrond van resistente variëteiten, is een nauwkeurige en betrouwbare methode voor resistentie-evaluatie vereist voor 1) de identificatie van P. nicotianae-resistente tabaksgenotypes, 2) het fokken van resistente variëteiten en 3) moleculaire mechanismestudies van plant-pathogene interacties. De vorige methoden die werden gebruikt om de ernst van de P. nicotianae-infectie te beoordelen, waren tijdrovend of de inentingsintensiteiten waren moeilijk te beheersen. Daarom is het dringend noodzakelijk om een nieuwe methode vast te stellen voor de evaluatie van de resistentie van P. nicotianae.
Het imiteren van natuurlijke infectieprocessen is het belangrijkste punt in onze nieuwe methode. Ten eerste zijn tijdens de typische levenscyclus van P. nicotianae zoösporen de belangrijkste infectieuze agentia die plantenziekten initiëren. Zodra de zoösporen het plantenoppervlak bereiken, worden ze onbeweeglijke cysten, ontkiemen ze vervolgens en vormen ze kiembuizen. Vervolgens worden appressoria geproduceerd aan de punt van de kiembuizen25. In ons protocol werd zoospore-suspensie gebruikt als entmateriaal, dat de natuurlijke infectiesituatie imiteert. Ten tweede, op Nicotiana benthamiana bladeren, ontkiemden de cysten en koloniseerden epidermale cellen om 3 h26. In Arabidopsis-wortels drongen alle encysted zoospores met succes de wortels binnen op 6 uur na inenting27. In onze benadering omvatte het inentingsproces het onderdompelen van wortels in een P. nicotianae zoospore-suspensie gedurende 3 uur in het donker, die de natuurlijke omgeving imiteert en de kolonisatie van de ziekteverwekker bevordert, wat leidt tot een stabiele en effectieve infectie.
De meest gebruikte benadering om de resistentie van P. nicotianae in tabak te beoordelen, de haverkorrelmethode, is efficiënt en gemakkelijk voor het inenten van een groot aantal planten7,11,12,13,14,15,16. Het heeft echter enkele nadelen. Het grootste nadeel is de ongecontroleerde entintensiteit, die de toepassing ervan in precisieveredeling beperkt. In vergelijking met de haverkorrelmethode en de andere twee bestaande benaderingen, wordt in deze nieuwe benadering zoospore-suspensie gebruikt als entmateriaal, zodat de intensiteit van het entmateriaal controleerbaar en instelbaar is. Omdat de planten in een hydroponische omgeving worden gekweekt, wordt de interferentie van de bodem geëlimineerd, wat de evaluatienauwkeurigheid verhoogt. Er bestaat echter één beperking voor deze methode, namelijk dat deze niet kan worden gebruiktop volwassen planten. De haverkorrelmethode is daarentegen toepasbaar voor grootschalige resistentiescreening van volwassen planten7,13. Daarom kunnen deze methode en de haverkorrelmethode elkaar aanvullen voor verschillende groeiperioden van de tabaksplant en in verschillende situaties.
Het hier beschreven protocol is een efficiënte en betrouwbare methode voor het evalueren van de weerstand van tabak tegen infectie door P. nicotianae in het zaailingstadium. Dit protocol kan worden gebruikt voor veredeling en voor moleculair mechanismeonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31571738) en het Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
