Summary
Dit protocol toont een nauwkeurige en objectieve benadering om virale titraties te visualiseren met behulp van kristalviolet, door het te vergelijken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
Abstract
Virale titratie is een belangrijke test voor virologisch onderzoek. De detectie van cytopathisch effect (CPE) via TCID50-assays en plaquevormende eenheden (PFU) -assays zijn de twee belangrijkste methoden om de titer van een virusvoorraad te berekenen en zijn vaak gebaseerd op microscopiedetectie of celkleuring voor visualisatie. In het geval van de TCID50-test is objectieve visualisatie gewoonlijk gebaseerd op immunocytochemische (ICC) kleuring van intracellulair virus om titers te berekenen in combinatie met visuele CPE-detectie via microscopie. ICC-kleuring is echter kostbaar en tijdrovend. In deze studie vergeleken we visuele CPE-observatie via microscopie, ICC-kleuring en kristalvioletkleuring om de titers van twee CPE-vormende virussen te bepalen, Influenza A-virus (IAV) van varkensoorsprong en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-virus (PRRSV). We laten zien dat zowel kristalviolet- als ICC-kleuring nauwkeuriger zijn dan visuele CPE-detectie, met bijna identieke precisieniveaus op zowel IAV als PRRSV. Om deze reden presenteren we hier kristalvioletkleuring als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test voor CPE-vormende virussen getitreerd in cellijnen.
Introduction
Virale titratie via TCID50-test is een veelgebruikte techniek in onderzoek naar infectieziekten1. Hoewel variaties op de wiskunde achter deze methode in de loop van de tijd zijn voorgesteld1,2,3,4, zijn de momenteel toegepaste methoden voor infectiedetectie afhankelijk van visuele bevestiging door de aanwezigheid van cytopathisch effect (CPE) met behulp van microscopie5. Om CPE-visualisatie objectiever te bevestigen op TCID50-assays, is immunocytochemische (ICC) intracellulaire kleuring gericht op de eiwitten van het virus een van de meest gebruikte methoden6, omdat verschillende virussen verschillende vormen van CPE kunnen produceren. In ons geval zijn de celmorfologische veranderingen vergelijkbaar wanneer ze zijn geïnfecteerd met zowel influenza A-virus (IAV) als porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), waarbij geïnfecteerde cellen worden afgerond en loskomen van de plaat. In het geval van PRRSV veroorzaakt het een CPE die bekend staat als "totale vernietiging", waarbij alle cellen uiteindelijk loskomen van de put. IAV daarentegen kan zowel totale vernietiging als een extra CPE presenteren die bekend staat als "subtotale vernietiging" waarbij een klein aantal cellen niet loskomt na infectie7. Deze techniek is echter tijdrovend om uit te voeren en vereist het gebruik van relatief dure reagentia. Het is belangrijk op te merken dat ICC cpe niet labelt, maar eerder het aantal cellen dat met succes door het virus is geïnfecteerd. Dit impliceert dat de cellen die aan het einde van de incubatie met succes zijn geïnfecteerd, als positief worden beschouwd, zelfs als de infectie nog geen CPE heeft veroorzaakt, en dus wordt een hoger percentage ICC-positieve cellen in vergelijking met CPE verwacht. Om die reden beschrijven we in deze studie een complementaire methode van visuele detectie van CPE in een TCID50-assay op basis van kristalviolet, een chemische stof met een positieve lading die zich hecht aan celmembranen en wordt gebruikt om aanhangende cellen te kleuren. Kristalviolet wordt vaak gebruikt in virologisch onderzoek om plaquevormende eenheden te meten, onder andere8.
In deze studie vergelijken we de gevoeligheid van niet-gekleurde microscopie CPE-detectie met kristalviolette kleuring en immunocytochemische kleuring op basis van virale eiwitherkenning, waarvan bekend is dat deze objectiever is vanwege de hoge gevoeligheid. Deze studie toont aan dat zowel kristalviolet als immunocytochemische kleuring nauwkeuriger zijn dan op visuele microscopie gebaseerde CPE-detectie en kan worden gebruikt om geïnfecteerde putten objectief te identificeren in een TCID50-titratie. Gezien hun vermogen om bijna identiek niveau van nauwkeurigheid te bereiken op de cytopathische virussen die in cellijnen zijn getest, wordt kristalviolet gepresenteerd als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test. De voorgestelde methode met kristalvioletkleuring duurt een totale tijd van 40 minuten om uit te voeren, met 15 minuten voor paraformaldehyde (PFA) incubatie, 5 minuten voor kristalviolette incubatie en maximaal 15 minuten voor materiaalvoorbereiding, bufferwassingen en drogen. Het immunocytochemische protocol dat wordt toegepast voor vergelijking duurt een gemiddelde tijd van 4 h 30 min en werd uitgevoerd zoals eerder beschreven9,10. De voorgestelde methode is bedoeld om een voltooide virale titratie te helpen visualiseren. Infectie- en incubatietijden kunnen worden uitgevoerd met verschillende lay-outs, afhankelijk van het virus. Hier testten we twee RNA-virussen met cytopathisch effect op cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Titratieprotocol
OPMERKING: Gebruik een cytopathisch virus dat hechtende cellen infecteert. Voor deze demonstratie werden Influenza A Virus (IAV) van varkensoorsprong (A/California/07/2009/(H1N1)) en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stam NC 1-7-4 gebruikt.
- Titreer deze virussen in 96 putplaten gedurende 7 dagen in een bioveiligheidskast in een Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.
- Om deze titraties uit te voeren, zaait u 96 putplaten met de vereiste cellijn. Gebruik voor PRRSV de MA-104-cellijn en voor IAV mdck-cellijn. Gebruik voor de celkweek DMEM-medium aangevuld met 10% FBS, L-Glutamine en Penicilline-Streptomycine en laat de cellen samenvloeien.
- Was de cellen vóór infectie met 200 μL PBS.
- Verdun de virusvoorraden met behulp van 10-voudige verdunningenreeksen door 900 μL media en 100 μL virus te mengen. Zorg ervoor dat u de buis goed vortext om een goede menging van het medium en het virus te garanderen en om verdunningsfouten te voorkomen.
- Markeer de lay-out van de plaat op het deksel. Was de putjes met 1x fosfaat zoutoplossing buffer (PBS). Voeg 50 μL van het entmateriaal toe in de overeenkomstige putjes volgens eerder beschreven titratiemethoden2,3.
- Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 7 dagen.
2. Cytopathische effect (CPE) beoordeling via microscopie
- Was na de incubatie van 7 dagen alle putjes tweemaal met 200 μL 1x PBS.
- Beoordeel alle putten van de plaat onder een lichtmicroscoop om CPE visueel te detecteren. In het geval van zowel PRRSV als IAV bestaat hun CPE uit celdood en daaropvolgende loslating van de plaat, wat leidt tot monolaagverstoring. Andere virussen kunnen echter verschillende soorten CPE vertonen.
3. Kleuringsprotocol
OPMERKING: Cytopathisch effect (CPE) werd beoordeeld via kristalviolette kleuring.
- Was na de incubatie van 7 dagen alle putjes tweemaal met 200 μL 1x PBS.
- Fixeer de cellen door 50 μL/putje van 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen in 1x PBS en incubaleer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Was de cellen na incubatie tweemaal met 200 μL 1x PBS. Voeg vervolgens 50 μL /put kristalviolet verdund tot 4% toe in water en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
OPMERKING: Kristalviolette chemische kleurt de cellen die op het moment van fixatie aan de plaat blijven vastzitten, waardoor de delen van de put waar de cellen loskomen als onbevlekt blijven. - Zuig ten slotte kristalviolet uit de putten en laat de platen eventueel 2-5 minuten aan de lucht drogen bij RT of was de plaat met 200 μL water om overtollige vlekken te verwijderen voorafgaand aan visualisatie.
- Gebruik eerder beschreven methoden om de titer wiskundig te berekenen. Hier werden karberformule en muench-formule toegepast voor respectievelijk PRRSV en IAV2,3. Details van deze vergelijkingen worden gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten.
4. Immunocytochemische (ICC) etikettering
OPMERKING: Immunocytochemische etikettering voor beide virussen werd uitgevoerd volgens eerder beschreven methoden9,10,11.
- Na de 7-daagse incubatie van de titratie, fixeert u de cellen met behulp van PFA zoals beschreven in stap 3.2.
- Was de platen met een oplossing bestaande uit 100 ml 1 M Tris-hydrochloride, 1 g saponine en 8,5 g NaCl in 900 ml H2O. Voltooi vervolgens twee extra wasbeurten met een mengsel van 1x PBS en 5% Foetaal Runderserum (FBS) en incubeer met die Tris-Saponin-NaCl-oplossing bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.
- Incubeer alle putjes met het primaire antilichaam gedurende 2 uur bij RT.
OPMERKING: Het volume primaire antilichamen voor elk virus was 100 μL en werd bereid met een verdunning van 1:300 van 2% FBS in 1x PBS. - Was de cellen tweemaal met de Tris-, Saponine- en NaCl-oplossing die in stap 4.2 is bereid.
- Incubeer alle putjes met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij RT.
OPMERKING: Het volume secundair antilichaam was 100 μL en werd bereid met een 1:250 verdunning van 2% FBS in 1x PBS. - Was de cellen met de Verdunning van Tris, Saponine en NaCl zoals beschreven in stap 4.2.
- Zuig de vorige verdunning op en incubeer de platen met 200 μL/put aminoethylcarbide (AEC)-oplossing bij een eindverdunning van 1:50 in water volgens de aanwijzingen van de fabrikant gedurende 30 minuten bij RT.
- Gooi na incubatie de AEC-oplossing weg en voeg 100 μL/putje van 1x PBS toe voor beeldvorming via microscopie.
- Leid de titer wiskundig af zoals beschreven in stap 3.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vergelijkingen die worden gebruikt voor het wiskundig berekenen van de titer werden eerder beschreven2,3.
Kortom, voor PRRSV passen we de Karber-methode toe:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 waarbij:
In deze formule d = negatief logboek van de laatste verdunning met volledige positieve virusrespons: vijf positieve replicaties; r = log van het verdunningsbereik; N = aantal duplo's door verdunning; n = aantal putjes met een positieve virusrespons bij de volgende verdunningen.
In het geval van IAV gebruiken we de Muench-formule:
Voor details over elke wiskundige methode, zie Ramakrishnan et al., (2016) en Reed et al., (1938)2,3.
Als visueel voorbeeld zou de in figuur 1 verkregen titer voor PRRSV als volgt worden berekend:
Het aantal positieve putten verkregen wanneer ICC (linkerhelft van de plaat) en Kristalviolette kleuring (rechterdeel van de plaat) werden vergeleken, was zeer vergelijkbaar voor zowel PRRSV (figuur 1) als IAV (figuur 2) en was in beide gevallen in staat om tussen één en twee positieve putten meer te detecteren dan de CPE waargenomen voorafgaand aan kleuring door middel van microscopie, ook al waren deze verschillen niet statistisch significant (tabel 1). Hoewel de output verkregen uit kristalvioletkleuring meestal een positief-negatieve put is, is er met behulp van ICC een geleidelijke afname van het aantal positieve cellen dat wordt gelabeld naarmate het virus meer verdund raakt. Bovendien vereist ICC het gebruik van een microscoop voor visualisatie, terwijl kristalviolet gemakkelijk met het oog kan worden uitgevoerd.
Figuur 1: Vergelijking van kristalviolette kleuring en immunocytochemische etikettering (ICC) voor PRRSV-titratie. (A) Visualisatie van de titratieplaat met het oog, waarbij de linkerhelft overeenkomt met kristalviolette kleuring en de rechterhelft overeenkomt met ICC; (B) Schematische weergave van de plaat met positieve putjes aangegeven met een '+'-teken met kristalviolet en ICC; (C) Microscopie beeld (10x objectief) van kristalviolette kleuring; (D) Microscopiebeeld (10x objectief) van positieve putten gedetecteerd door ICC. Tienvoudige verdunningen van het virus van -1 tot -8 log. werden uitgevoerd. Afbeeldingen van positieve putten van -1 log tot -5 log. Niet-geïnfecteerde cellen werden gebruikt als negatieve controle (aangeduid als negatief). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van kristalviolette kleuring en immunocytochemische etikettering (ICC) voor IAV-titratie. (A) Visualisatie van de titratieplaat met het oog, waarbij de linkerhelft overeenkomt met kristalviolette kleuring en rechterhelft overeenkomt met ICC; (B) Schematische weergave van de plaat met positieve putjes aangegeven met een '+'-teken met kristalviolet en ICC; (C) Microscopie beeld (10x objectief) van kristalviolette kleuring; (D) Microscopiebeeld (10x objectief) van positieve putten gedetecteerd door ICC. Tienvoudige verdunningen van het virus van 10-1 tot 10-8. werden uitgevoerd. Afbeeldingen van positieve putten van -1 log tot -5 log. Niet-geïnfecteerde cellen werden gebruikt als negatieve controle (aangeduid als negatief). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vergelijking van de titers verkregen voor zowel PRRSV als IAV met behulp van de drie visualisatiebenaderingen. Titers uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van de log10 TCID50/ml in n = 5 replicaties. Er werden geen statistisch significante verschillen gevonden tussen de groepen (p > 0,05). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virale titraties worden routinematig gebruikt in virologisch onderzoek, met PFU-detectie en TCID50-assays die het meest worden gebruikt1,2,3,4. Beide methoden zijn gebaseerd op de detectie van CPE in geïnfecteerde cellen, en hoewel ze visueel kunnen worden beoordeeld via microscopie, wordt een kleuring meestal toegepast om een objectiever resultaat te verkrijgen of zelfs de incubatietijd te verkorten. In het geval van TCID50 is icc-kleuring6 een van de meest gebruikte alternatieven voor visuele CPE-detectie die een nauwkeurige en objectieve meting biedt, wat tijdrovend en vaak duur is vanwege het gebruik van specifieke antilichamen9,10. Hoewel dit type test ook profiteert van de toepassing van kristalvioletkleuring voor visualisatie, zijn er geen vergelijkende studies die de verschillen in gevoeligheid tussen ICC en kristalvioletkleuring beoordelen. Het hier voorgestelde protocol is dus een geschikte optie voor op TCID50 gebaseerde virale voorraadtitraties, omdat de toepassing van kristalviolet een vergelijkbaar niveau van nauwkeurigheid vertoonde als de gevoelige immunocytochemische intracellulaire kleuring gericht op specifiek viruseiwit. Deze methode is minder tijdrovend, over het algemeen gemakkelijker uit te voeren en nauwkeuriger dan CPE-detectie via microscopie, wat aantoont dat deze aanpak gunstig is om te gebruiken voor virustitraties die regelmatig worden uitgevoerd.
De kritieke stappen voor deze kristalviolette kleuring zijn een goede fixatie van de cellen na de incubatietijd van 7 dagen voor de titratie en het aanbrengen van voldoende kristalviolet om het hele oppervlak van de putten te bedekken. Om een succesvolle kleuring te bereiken, moet u ervoor zorgen dat niet-geïnfecteerde cellen goed bedekt zijn met kristalviolet en dat alle putten zijn gekleurd. Dit geeft aan dat de cellen gezond waren en dat het protocol werkte zoals verwacht.
Concluderend wordt het gebruik van kristalviolette kleuring voorgesteld als een sneller en goedkoper alternatief voor de objectieve detectie van CPE op TCID50-assays, met een vergelijkbare nauwkeurigheid als de specifieke ICC intracellulaire etikettering die gewoonlijk wordt toegepast tijdens dit type titratie. Er kunnen echter gevallen zijn waarin de pathogeenspecifieke antilichamen in staat zijn om positieve putten te detecteren die onopgemerkt zouden blijven door onze kristalvioletmethode, omdat ICC-positieven met succes geïnfecteerde cellen zullen laten zien, zelfs voordat de infectie tot CPE leidt. Daarom, hoewel we geen significante verschillen tussen de twee hebben gevonden, wordt het sterk aanbevolen om beide methoden te testen om het gevoeligheidsniveau in elke virustitratie te beoordelen om potentiële verschillen en daaropvolgende aanpassingen te bepalen voordat deze kleuring routinematig wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs willen graag Dr. Frank Scholle bedanken voor zijn nuttige opmerkingen in het manuscript, Chloe Mariant voor haar hulp bij de microscopiebeelden en Teresa M. Tiedge voor haar behulpzame Engelse revisie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
