Summary
이 프로토콜은 광학 현미경 검사법과 면역 세포화학 얼룩과 비교하여 크리스탈 바이올렛을 사용하여 바이러스 성도를 시각화하는 정확하고 객관적인 접근 방식을 보여줍니다.
Abstract
바이러스 성 적정은 바이러스 학 연구에 대 한 핵심 분석. TCID50 애세 및 플라크 형성 장치(PFU) 애법을 통한 세포요법 효과(CPE)의 검출은 바이러스 스톡의 티터를 계산하는 두 가지 주요 방법이며 종종 시각화를 위한 현미경 검사감지 또는 세포 염색에 기초한다. TCID50 분석의 경우, 객관적인 시각화는 일반적으로 현미경 을 통해 시각적 CPE 검출과 결합 된 티터를 계산하기 위해 세포 내 바이러스의 면역 세포 화학 (ICC) 염색에 기초한다. 그러나 ICC 염색은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 이 연구에서는, 우리는 현미경 검사법을 통해 시각적 CPE 관측을 비교, ICC 염색 및 크리스탈 보라색 얼룩 두 개의 CPE 형성 바이러스의 타이터를 결정하기 위해, 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 돼지 기원과 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV). 우리는 크리스탈 바이올렛과 ICC 염색이 모두 IAV와 PRRSV 모두에 정밀도의 거의 동일한 수준을 제시, 시각적 CPE 검출보다 더 정확하다는 것을 보여줍니다. 이러한 이유로, 여기에서 우리는 세포주에서 적정된 CPE 형성 바이러스에 대한 TCID50 분석법에 바이러스 적정을 결정하는 빠르고 더 저렴한 방법으로 크리스탈 보라색 염색을 제시합니다.
Introduction
TCID50 분석법을 통한 바이러스 적정은 전염병 연구에서 일반적으로 사용되는 기술입니다1. 이 방법의 뒤에 수학에 변이는 시간이 지남에 제안되었지만1,2,3,4, 감염 검출의 현재 적용 방법은 현미경을 사용하여 세포 요법 효과 (CPE)의 존재를 통해 시각적 확인에 의존5. TCID50 분석에서 CPE 시각화를 보다 객관적으로 확인하기 위해, 바이러스의 단백질을 표적으로 하는 면역 세포 화학(ICC) 세포내 염색은 다른 바이러스가 다양한 형태의 CPE를 생성할 수 있기 때문에 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다6. 우리의 경우에, 세포 형태학적 변화는 감염된 세포가 반올림하고 접시에서 분리하는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)와 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 모두 감염될 때 유사합니다. PRRSV의 경우, 모든 세포가 우물에서 분리되는 "총 파괴"로 알려진 CPE를 일으킵니다. 한편, IAV는 감염 후 소수의 세포가 분리되지 않는 "서브토탈 파괴"로 알려진 총 파괴 및 추가 CPE를 둘 다 제시할 수 있다7. 그러나 이 기술은 수행하는 데 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비용이 많이 드는 시약을 사용해야 합니다. ICC는 CPE에 라벨을 붙이지 않고 바이러스에 성공적으로 감염된 세포의 수를 주목하는 것이 중요합니다. 이것은 감염이 아직 CPE를 일으키지 않더라도 인큐베이션의 끝에 의해 성공적으로 감염된 세포가 긍정적으로 보일 것이라는 점을 암시하고, 따라서, CPE에 비해 ICC 양성 세포의 더 높은 비율이 예상된다. 이러한 이유로, 본 연구에서는 TCID50 분석에서 CPE의 시각적 검출의 보완적인 방법을 설명합니다, 세포막에 부착하고 신봉세포를 얼룩에 사용하는 양전전을 가진 화학 물질인 결정 보라색을 기반으로 합니다. 크리스탈 바이올렛은 종종 플라크 형성 단위를 측정하기 위해 바이러스 학 연구에서 활용8.
이 연구에서는, 우리는 높은 감도로 인해 더 객관적인 것으로 알려져 있는 바이러스성 단백질 인식에 근거를 둔 결정 보라색 염색 및 면역 세포화학 염색과 비 염색한 현미경 CPE 검출의 감도를 비교합니다. 이 연구는 크리스탈 바이올렛과 면역 세포화학 염색이 시각적 현미경 기반 CPE 검출보다 더 정확하며 TCID50 적정에서 감염된 우물을 객관적으로 식별하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 세포주에서 테스트된 세포병증 바이러스에 대한 정확도의 거의 동일한 수준에 도달하는 능력을 감안할 때, 크리스탈 바이올렛은 TCID50 분석에서 바이러스 적정을 결정하는 빠르고 저렴한 방법으로 제시됩니다. 상기 크리스탈 바이올렛 스테인링을 이용한 제안된 방법은 총 40분 동안 수행되며, 파라포름알데히드(PFA) 인큐베이션은 15분, 크리스탈 바이올렛 인큐베이션은 5분, 재료 제제, 완충 세차 및 건조를 위해 최대 15분이 소요된다. 비교에 적용된 면역세포화학 프로토콜은 평균 4시간 30분소요되며, 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다9,10. 제안 된 방법은 완성 된 바이러스 성 적정을 시각화하는 것을 목표로합니다. 감염 및 잠복기는 바이러스에 따라 다른 레이아웃으로 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 세포주에 세포병증 효력을 가진 2개의 RNA 바이러스를 시험했습니다.
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Protocol
1. 적정 프로토콜
참고: 신봉 세포를 감염시키는 세포요법 바이러스를 사용합니다. 이러한 시연을 위해 돼지 기원(A/California/07/2009/(H1N1)과 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 유형 2, 균주 NC 1-7-4의 인플루엔자 A 바이러스(IAV)가 사용되었다.
- 바이오 세이프티 레벨 2(BSL-2) 실험실에 위치한 생물안전 캐비닛에서 7일 동안 96개의 웰 플레이트에서 이러한 바이러스를 적시합니다.
- 이러한 적정을 수행하기 위해, 필요한 세포주와 잘 플레이트 96 을 시드. PRRSV의 경우 MA-104 세포주및 IAV의 경우 MDCK 세포주 사용하십시오. 세포 배양의 경우, 10% FBS, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지를 사용하고 세포를 결합으로 성장시다.
- 감염하기 전에 PBS의 200 μL을 사용하여 세포를 씻으라.
- 900 μL의 미디어와 100 μL의 바이러스를 혼합하여 10 배 희석 계열을 사용하여 바이러스 주식을 희석하십시오. 배지와 바이러스의 적절한 혼합을 보장하고 희석 오류를 피하기 위해 튜브를 제대로 소용돌이해야합니다.
- 뚜껑에 있는 플레이트의 레이아웃을 표시합니다. 1x 인산염 식염수 버퍼(PBS)로 우물을 씻으시다. 이전에 설명된 적정 방법에 따라 해당 우물에 접종의 50 μL을 추가합니다2,3.
- 7 일 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배양하십시오.
2. 현미경 검사를 통한 세포병증 효과(CPE) 평가
- 7일 간의 인큐베이션 후, 200 μL의 1x PBS로 모든 우물을 두 번 세척하십시오.
- 경현미경하에서 플레이트의 모든 우물을 평가하여 CPE를 시각적으로 감지합니다. PRRSV와 IAV 의 경우, 그들의 CPE는 단층 중단으로 이끌어 내는 판에서 세포 죽음 및 후속 분리로 이루어져 있습니다. 그러나 다른 바이러스는 다양한 유형의 CPE를 제시할 수 있습니다.
3. 스테인딩 프로토콜
참고: 세포병증 효과(CPE)는 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 평가하였다.
- 7일 인큐베이션 후, 1x PBS 200 μL을 사용하여 모든 우물을 두 번 세척하십시오.
- 1x PBS에 50 μL/well 4% 파라포름데히드(PFA)를 추가하여 세포를 수정하고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 후, 1x PBS의 200 μL로 세포를 두 번 씻으시다. 그런 다음 물에 4 %로 희석 된 크리스탈 바이올렛 50 μL / 웰을 추가하고 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
참고 : 크리스탈 보라색 화학 물질은 고정 시 플레이트에 부착 된 상태로 남아있는 세포를 얼룩지게하여 세포가 얼룩지지 않은 것으로 분리 된 우물의 섹션을 남깁니다. - 마지막으로, 우물에서 크리스탈 바이올렛을 흡기하고 선택적으로 플레이트를 RT에서 2-5분 동안 건조하게 하거나 200μL의 물로 플레이트를 세척하여 시각화 전에 과도한 얼룩을 제거합니다.
- 이전에 설명한 메서드를 사용하여 티터를 수학적으로 계산합니다. 여기서, Karber 공식 및 Muench 공식은 PRRSV와 IAV를 각각 적용2,3. 이러한 방정식의 세부 사항은 대표 결과 섹션에 표시됩니다.
4. 면역 세포화학 (ICC) 라벨
참고: 두 바이러스에 대한 면역 세포 화학 라벨링은 이전에 설명된 방법에 따라 수행되었다9,10,11.
- 7일 간의 적정 배양 후, 3.2단계에서 설명된 바와 같이 PFA를 사용하여 세포를 수정한다.
- 1M 트리스 염산염 100mL, 사포닌 1g, H2O 900mL에서 NaCl 8.5g으로 구성된 용액으로 플레이트를 세척한다. 그런 다음, 1x PBS와 5% 태아 소 세럼 (FBS)의 혼합물로 두 개의 추가 세척을 완료하고 실온 (RT)에서 Tris-Saponin-NaCl 솔루션으로 20 분 동안 배양하십시오.
- RT에서 2h에 대한 기본 항체로 모든 우물을 배양합니다.
참고: 각 바이러스에 대한 1차 항체의 부피는 100 μL이고 1x PBS에서 2%의 FBS의 1:300 희석을 사용하여 제조하였다. - 4.2단계에서 제조된 Tris, Saponin 및 NaCl 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.
- RT에서 1 h에 대한 보조 항체와 모든 우물을 배양.
참고: 이차 항체의 부피는 100 μL이고 1x PBS에서 2% FBS의 1:250 희석을 사용하여 제조하였다. - 4.2 단계에서 설명된 대로 트리스, 사포닌 및 NaCl 희석으로 세포를 세척한다.
- RT에서 30분 동안 제조업체의 지시에 따라 1:50의 최종 희석에서 200 μL/t of aminoethyl carbazole (AEC) 용액으로 플레이트를 배양하고 배양합니다.
- 인큐베이션 후 AEC 용액을 폐기하고 현미경 검사를 통해 이미징을 위해 100 μL/웰1x PBS를 추가합니다.
- 3.5 단계에서 설명된 바와 같이 수학적으로 티터를 파생시다.
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Representative Results
티터를 수학적으로 계산하는 데 사용되는 방정식은 이전에 설명되었다2,3.
간단히 말해서 PRRSV의 경우, 우리는 Karber 방법을 적용합니다.
티터 (TCID50) = 10 T + 1.3 어디에 :
이 수식 d = 완전한 양성 바이러스 반응으로 마지막 희석의 음수 로그: 5개의 양성 복제; r = 희석 범위의 로그; N = 희석에 의한 복제 수; n = 다음 희석에 긍정적 인 바이러스 반응을 가진 우물의 수입니다.
IAV의 경우, 우리는 Muench 공식을 사용합니다 :
각 수학 방법에 대한 자세한 내용은 라마크리슈난 외, (2016) 및 리드 외, (1938)2,3을 참조하십시오.
시각적 예로 도 1 에 표시된 PRRSV에 대해 얻은 티터는 다음과 같이 계산됩니다.
ICC(플레이트의 왼쪽 절반)와 크리스탈 바이올렛 염색(플레이트의 오른쪽 부분)이 PRRSV(도 1)와 IAV(도 2)와 매우 유사했을 때 얻은 양성 우물의 수는 모두 PRRSV(도 1)와 IAV(도 2)와 매우 유사하며, 두 경우 모두 현미경 검사를 통해 염색하기 전에 관찰된 CPE보다 1~2개의 양성 우물 사이에서 검출할 수 있었다. 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았음에도 불구하고(표 1). 크리스탈 바이올렛 염색에서 얻은 출력은 일반적으로 긍정적 인 음수이지만 ICC를 사용하면 바이러스가 더 희석됨에 따라 표지되는 양성 세포의 수가 점진적으로 감소합니다. 또한, ICC는 시각화를 위한 현미경의 사용을 요구하며, 크리스탈 바이올렛은 눈으로 쉽게 수행 될 수 있습니다.
도 1: PRRSV 적정에 대한 크리스탈 바이올렛 염색 및 면역 세포화학 라벨링(ICC)의 비교. (A) 눈별 적정판의 시각화, 크리스탈 바이올렛 염색및 ICC에 대응하는 오른쪽 절반에 해당하는 왼쪽 절반; (B) 결정 보라색과 ICC를 사용하여 '+' 기호로 표시된 긍정적 인 우물과 플레이트의 회로도 표현; (C) 크리스탈 바이올렛 염색의 현미경 이미지(10x 목표); (D) ICC에 의해 검출된 양성 우물의 현미경 이미지(10배 목표). -1에서 -8 로그까지 바이러스의 10배 희석이 수행되었다. -1 로그에서 -5 로그까지 양수 우물의 이미지. 감염되지 않은 세포는 부정적인 대조군(음성이라고 함)으로 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: IAV 적정을 위한 크리스탈 바이올렛 염색 및 면역 세포화학 라벨링(ICC)의 비교. (A) 눈별 적정판의 시각화, 크리스탈 바이올렛 염색및 ICC에 대응하는 오른쪽 절반에 해당하는 왼쪽 절반; (B) 결정 보라색과 ICC를 사용하여 '+' 기호로 표시된 긍정적 인 우물과 플레이트의 회로도 표현; (C) 크리스탈 바이올렛 염색의 현미경 이미지(10x 목표); (D) ICC에 의해 검출된 양성 우물의 현미경 이미지(10배 목표). 10-1에서 10-8까지 바이러스의 10 배 희석. 수행되었습니다. -1 로그에서 -5 로그까지 양수 우물의 이미지. 감염되지 않은 세포는 부정적인 대조군(음성이라고 함)으로 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 세 가지 시각화 방법을 사용하여 PRRSV와 IAV 모두에 대해 얻은 티터비교입니다. titers는 n = 5 복제에서 log10 TCID50/mL의 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 그룹(p > 0.05)사이에 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
바이러스 적 정수는 PFU 검출 및 TCID50 assays가장 일반적으로 사용되는 바이러스 학 연구에서 일상적으로 사용됩니다1,2,3,4. 두 방법 모두 감염된 세포에서 CPE의 검출에 의존하고, 현미경 검사를 통해 시각적으로 평가될 수 있더라도, 염색은 일반적으로 더 객관적인 결과를 얻거나 잠복시간을 감소시키기 위하여 적용됩니다. TCID50의 경우, 정확하고 객관적인 측정을 제공하는 시각적 CPE 검출에 가장 일반적으로 사용되는 대안 중 하나는 ICC 염색6이며, 이는 특정 항체의 사용률로 인해 시간이 많이 걸리고 종종 비용이 많이 듭니다9,10. 그러나, 분석의이 유형은 또한 시각화를 위한 결정 보라색 얼룩의 응용에서 유익하더라도, ICC와 크리스탈 보라색 얼룩 사이 감도의 차이를 평가하는 비교 연구 결과가 없습니다. 따라서, 여기서 제안된 프로토콜은 TCID50 계 바이러스 육수 적정에 적합한 옵션이며, 크리스탈 바이올렛의 적용이 특정 바이러스 단백질을 표적으로 하는 민감한 면역 세포화학 내 염색에 대한 유사한 수준의 정확도를 보였다. 이 방법은 현미경 검사를 통해 CPE 검출보다 일반적으로 실행하기 쉽고 보다 정확하며, 이 방법은 정기적으로 수행되는 바이러스 적정에 사용하는 것이 유익하다는 것을 보여줍니다.
이 크리스탈 보라색 염색에 대한 중요한 단계는 적정및 우물의 전체 표면을 커버하기에 충분한 크리스탈 바이올렛의 적용을위한 7 일 인큐베이션 기간 후 세포의 적절한 고정이다. 성공적인 염색을 달성하기 위해 감염되지 않은 세포가 크리스탈 바이올렛으로 적절하게 덮여 있는지 확인하고 모든 우물이 얼룩져 있는지 확인하십시오. 이것은 세포가 건강했다는 것을 나타내고 프로토콜은 예상대로 작동했습니다.
결론적으로, 결정 보라색 얼룩의 활용은 TCID50 분석서에 CPE의 객관적인 검출을 위한 빠르고 덜 비용이 많이 드는 대안으로 제안되며, 이러한 유형의 적정 중에 일반적으로 적용되는 특정 ICC 세포 내 라벨링과 유사한 정확도를 갖는다. 그러나, 병원체 특이적 항체가 우리의 결정 보라색 방법에 의해 검출되지 않을 양성 우물을 검출할 수 있는 경우가 있을 수 있습니다, ICC 양성은 감염이 CPE로 이끌어 오기 전에조차 성공적으로 감염된 세포를 보여줄 것이기 때문에. 따라서, 둘 사이의 상당한 차이를 찾지 못했지만, 이 염색을 일상적으로 사용하기 전에 잠재적인 차이와 후속 조정을 결정하기 위해 각 바이러스 적정에서 감도 수준을 평가하는 두 가지 방법을 테스트하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 원고에서 자신의 유용한 의견에 대한 박사 프랭크 슐레를 인정하고 싶습니다, 클로이 마리언트는 현미경 이미지와 그녀의 도움이 영어 개정에 대한 테레사 M. 티지그녀의 도움에 대한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
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