Summary
Detta protokoll visar en exakt och objektiv metod för att visualisera viral titrering med hjälp av kristallviolett, genom att jämföra den med optisk mikroskopi och immunocytochemical färgning.
Abstract
Viral titrering är en viktig analys för virologiforskning. Detektion av cytopatisk effekt (CPE) via TCID50-analyser och plackbildande enheter (PFU) analyser är de två huvudmetoderna för att beräkna titer av ett viruslager och baseras ofta på mikroskopidetektering eller cellfärgning för visualisering. När det gäller TCID50-analys baseras objektiv visualisering vanligtvis på immunocytokemisk (ICC) färgning av intracellulärt virus för att beräkna titrar i kombination med visuell CPE-detektion via mikroskopi. ICC-färgning är dock kostsam och tidskrävande. I denna studie jämförde vi visuell HLE-observation via mikroskopi, ICC-färgning och kristallviolett färgning för att bestämma titers av två HLE-formande virus, Influensa A-virus (IAV) av svin ursprung och Svin reproduktiva och respiratoriska syndrom virus (PRRSV). Vi visar att både kristallviolett och ICC färgning är mer exakta än visuella HLE detektering, presenterar nästan identiska nivåer av precision på både IAV och PRRSV. Av denna anledning presenterar vi här kristallviolett färgning som ett snabbare och mer överkomligt sätt att bestämma virala titreringar på en TCID50-analys för CPE-formande virus titrerade i cellinjer.
Introduction
Viral titrering via TCID50-analys är en vanlig teknik inom infektionssjukdomsforskning1. Även om variationer på matematiken bakom denna metod har föreslagits över tid1,2,3,4, förlitar sig de för närvarande tillämpade metoderna för infektionsdetektering på visuell bekräftelse genom förekomsten av cytopatisk effekt (CPE) med hjälp av mikroskopi5. För att bekräfta CPE visualisering mer objektivt på TCID50 analyser, immunocytochemical (ICC) intracellulär färgning som riktar sig till proteinerna i viruset är en av de vanligaste metoderna6 som olika virus kan producera olika former av CPE. I vårt fall är cellmorfologiska förändringar likartade när de infekteras med både Influensa A-virus (IAV) och Svin reproduktivt och respiratoriskt syndrom virus (PRRSV), där infekterade celler samlas upp och lossnar från plattan. När det gäller PRRSV orsakar det en HLE som kallas "total förstörelse", där alla celler hamnar från brunnen. IAV å andra sidan, kan presentera både total förstörelse och en ytterligare CPE känd som "subtotal förstörelse" där ett litet antal celler inte lossnar efter infektion7. Denna teknik är dock tidskrävande att utföra och kräver användning av relativt kostsamma reagenser. Det är viktigt att notera att ICC inte märker CPE, utan snarare antalet celler som har smittats av viruset. Detta innebär att de celler som framgångsrikt smittades i slutet av inkubationen kommer att ses som positiva även om infektionen inte har orsakat CPE ännu, och därmed förväntas en högre andel ICC-positiva celler jämfört med CPE. Av den anledningen beskriver vi i denna studie en kompletterande metod för visuell detektion av CPE i en TCID50-analys baserad på kristallviolett, en kemikalie med en positiv laddning som fäster vid cellmembran och används för att fläcka vidhäftande celler. Kristallviolett används ofta i virologiforskning för att mäta plackbildande enheter, bland annat8.
I denna studie jämför vi känsligheten hos icke-färgade mikroskopi CPE upptäckt med kristallviolett färgning och immunocytochemical färgning baserat på viral protein erkännande, som är känt för att vara mer objektiv på grund av dess höga känslighet. Denna studie visar att både kristallviolett och immunocytochemical färgning är mer exakta än visuella mikroskopi-baserade CPE upptäckt och kan användas för att objektivt identifiera infekterade brunnar i en TCID50 titrering. Med tanke på deras förmåga att nå nästan identisk nivå av noggrannhet på de cytopatiska virus som testas i cellinjer, presenteras kristallviolett som ett snabbare och mer överkomligt sätt att bestämma viral titrationer på en TCID50-analys. Den föreslagna metoden med kristallviolettfärgning tar totalt 40 min att utföra, med 15 min för inkubation av paraformaldehyd (PFA), 5 min för kristallviolettinkubation och högst 15 minuter för materialberedning, bufferttvättar och torkning. Det immunocytochemistry protokoll som tillämpas för jämförelse tar en genomsnittlig tid på 4 h 30 min och utfördes som tidigare beskrivit9,10. Den föreslagna metoden syftar till att hjälpa till att visualisera en avslutad viral titrering. Infektions- och inkubationstider kan utföras med olika layout beroende på viruset. Här testade vi två RNA-virus med cytopatisk effekt på cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Titreringsprotokoll
OBS: Använd ett cytopatiskt virus som infekterar vidhäftande celler. För denna demonstration användes influensa A Virus (IAV) av svin ursprung (A/California/07/2009/(H1N1)) och Svin reproduktiva och respiratoriska syndrom virus (PRRSV) typ 2, stam NC 1-7-4.
- Titrera dessa virus i 96 brunnsplattor i 7 dagar i ett biosäkerhetsskåp beläget i ett BSL-2-laboratorium (Biosafety Level 2).
- För att utföra dessa titreringar, frö 96 brunnsplattor med önskad cellinje. För PRRSV använder du MA-104-cellinjen och för IAV använd MDCK-cellinje. För cellkulturen, använd DMEM medium kompletterat med 10% FBS, L-glutamin och Penicillin-Streptomycin och växa cellerna till sammanflöde.
- Tvätta cellerna med 200 μL PBS före infektion.
- Späd ut viruslagren med 10 fällningsserier genom att blanda 900 μL media och 100 μL virus. Se till att virvla på röret ordentligt för att säkerställa korrekt blandning av medium och virus och för att undvika utspädningsfel.
- Markera plattans layout på locket. Tvätta brunnarna med 1x fosfatsaltlösningsbuffert (PBS). Tillsätt 50 μL av inokulat i motsvarande brunnar efter tidigare beskrivna titreringsmetoder2,3.
- Inkubera vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 7 dagar.
2. Cytopatisk effekt (CPE) bedömning via mikroskopi
- Efter 7-dagars inkubation, tvätta alla brunnar med 200 μL 1x PBS två gånger.
- Utvärdera alla brunnar på plattan under ett ljusmikroskop för att visuellt detektera CPE. När det gäller både PRRSV och IAV består deras HLE av celldöd och efterföljande avlossning från plattan, vilket leder till störningar i monolayer. Andra virus kan dock presentera olika typer av CPE.
3. Färgningsprotokoll
OBS: Cytopatisk effekt (CPE) bedömdes via kristallviolett färgning.
- Efter 7-dagars inkubation, tvätta alla brunnar med 200 μL 1x PBS två gånger.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 50 μL/brunn på 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta cellerna två gånger med 200 μL 1x PBS efter inkubation. Tillsätt sedan 50 μL/brunn kristallviolett utspädd till 4% i vatten och inkubera i 5 min vid RT.
OBS: Kristallviolett kemisk fläckar cellerna som förblir fästa på plattan vid tidpunkten för fixeringen, vilket lämnar de delar av brunnen där cellerna lossnar som oförstådda. - Slutligen aspirera kristallviolett från brunnarna och lämna eventuellt plattorna att lufttorka i 2-5 min vid RT eller tvätta plattan med 200 μL vatten för att avlägsna överflödig fläck före visualisering.
- Använd tidigare beskrivna metoder för att matematiskt beräkna titer. Här tillämpades Karberformel och Muench-formeln för PRRSV respektive IAV, respektive2,3. Detaljer om dessa ekvationer presenteras i avsnittet representativt resultat.
4. Immunocytokemisk (ICC) märkning
OBS: Immunocytochemistry märkning för båda virus utfördes enligt tidigare beskrivna metoder9,10,11.
- Efter 7-dagars inkubation av titreringen, fixera cellerna med PFA enligt beskrivningen i steg 3.2.
- Tvätta plattorna med en lösning som består av 100 ml 1 M Tris-hydroklorid, 1 g Saponin och 8,5 g NaCl i 900 ml H2O. Slutför sedan två ytterligare tvättar med en blandning av 1x PBS och 5% Fetal Bovine Serum (FBS) och inkubera med det Tris-Saponin-NaCl-lösning vid rumstemperatur (RT) i 20 min.
- Inkubera alla brunnar med den primära antikroppen i 2 timmar vid RT.
OBS: Volymen av primära antikroppar för varje virus var 100 μL och bereddes med en utspädning på 1:300 av 2% FBS i 1x PBS. - Tvätta cellerna två gånger med Tris-, Saponin- och NaCl-lösningen som beretts i steg 4.2.
- Inkubera alla brunnar med den sekundära antikroppen i 1 h vid RT.
OBS: Volymen av sekundär antikropp var 100 μL och förbereddes med en utspädning på 1:250 på 2% FBS i 1x PBS. - Tvätta cellerna med utspädningen Tris, Saponin och NaCl enligt beskrivningen i steg 4.2.
- Aspirera den tidigare utspädningen och inkubera plattorna med 200 μL/brunn av aminoetylkarazollösning (AEC) vid en slutlig utspädning på 1:50 i vatten enligt tillverkarens anvisningar i 30 minuter vid RT.
- Efter inkubation kasserar du AEC-lösningen och tillsätt 100 μL/brunn på 1x PBS för avbildning via mikroskopi.
- Matematiskt härleda titer enligt beskrivningen i steg 3.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ekvationer som används för matematisk beräkning av titer beskrevs tidigare2,3.
Kortfattat, för PRRSV, tillämpar vi Karber-metoden:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 där:
I denna formel d = negativ logg över den sista utspädningen med fullständig positiv virusrespons: fem positiva replikat; r = logg över utspädningsområde. N = antal replikat genom utspädning. n = antal brunnar med positivt virussvar vid nästa utspädning.
När det gäller IAV använder vi Muench-formeln:
För detaljer om varje matematisk metod, se Ramakrishnan et al., (2016) och Reed et al., (1938)2,3.
Som ett visuellt exempel skulle den interpolerare som erhållits för PRRSV enligt figur 1 beräknas på följande sätt:
Antalet positiva brunnar som erhölls när ICC (vänster halva av plattan) och Crystal Violet färgning (höger del av plattan) jämfördes var mycket lika för både PRRSV (figur 1) och IAV (figur 2) och kunde i båda fallen upptäcka mellan en och två positiva brunnar mer än den CPE som observerades före färgning genom mikroskopi, även om dessa skillnader inte var statistiskt signifikanta (tabell 1). Medan produktionen som erhålls från kristallviolett färgning är vanligtvis en positiv-negativ brunn, med hjälp av ICC finns det en gradvis minskning av antalet positiva celler som blir märkta när viruset blir mer utspädd. Dessutom kräver ICC användning av ett mikroskop för visualisering, medan kristallviolett lätt kan utföras med öga.
Figur 1: Jämförelse av kristallviolett färgning och immunocytokemisk märkning (ICC) för PRRSV titrering. (A) Visualisering av titreringsplattan för öga, med den vänstra halvan motsvarar kristallviolett färgning och högerhalva motsvarande ICC. B) Schematisk representation av plattan med positiva brunnar som anges med en +-skylt med hjälp av kristallviolett och ICC. C) Mikroskopibild (10x objektiv) av kristallviolett färgning. (D) Mikroskopibild (10x objektiv) av positiva brunnar som detekteras av ICC. Tio-faldig utspädning av viruset från -1 till -8 logg. utfördes. Bilder av positiva brunnar från -1 logg till -5 logg. Oinfekterade celler användes som negativ kontroll (kallas negativ). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Jämförelse av kristallviolettfärgning och immunocytokemisk märkning (ICC) för IAV-titrering. (A) Visualisering av titreringsplattan för öga, där den vänstra halvan motsvarar kristallviolettfärgning och högerhalva motsvarande ICC. B) Schematisk representation av plattan med positiva brunnar som anges med en +-skylt med hjälp av kristallviolett och ICC. C) Mikroskopibild (10x objektiv) av kristallviolett färgning. (D) Mikroskopibild (10x objektiv) av positiva brunnar som detekteras av ICC. Tiofaldiga utspädningar av viruset från 10-1 till 10-8. utfördes. Bilder av positiva brunnar från -1 logg till -5 logg. Oinfekterade celler användes som negativ kontroll (kallas negativ). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Jämförelse av de titrar som erhållits för både PRRSV och IAV med hjälp av de tre visualiseringsmetoderna. Titers uttryckt som den genomsnittliga ± SEM av log10 TCID50/mL i n = 5 replikat. Inga statistiskt signifikanta skillnader konstaterades mellan grupperna (s > 0,05). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viral titreringar används rutinmässigt i virologiforskning, med PFU-detektion och TCID50-analyser som oftast används1,2,3,4. Båda metoderna förlitar sig på detektion av CPE i infekterade celler, och även om de kan bedömas visuellt via mikroskopi, appliceras en färgning vanligtvis för att få ett mer objektivt resultat eller till och med minska inkubationstiden. När det gäller TCID50 är ett av de vanligaste alternativen till visuell CPE-detektion som erbjuder ett exakt och objektivt mått ICC-färgning6, vilket är tidskrävande och ofta dyrt på grund av användningen av specifika antikroppar9,10. Men även om denna typ av analys också drar nytta av tillämpningen av kristallviolett färgning för visualisering, finns det inga jämförande studier som bedömer skillnaderna i känslighet mellan ICC och kristallviolett färgning. Således är protokollet som föreslås här ett lämpligt alternativ för TCID50-baserade virala lager titreringar, eftersom tillämpningen av kristallviolett visade en jämförbar nivå av noggrannhet med den känsliga immunocytochemical intracellulära färgning som riktar sig till specifika virusprotein. Denna metod är mindre tidskrävande, i allmänhet lättare att köra och mer exakt än CPE-detektering via mikroskopi, vilket visar att detta tillvägagångssätt är fördelaktigt att använda för virustitrationer som utförs regelbundet.
De kritiska stegen för denna kristallviolett färgning är en korrekt fixering av cellerna efter 7-dagars inkubationsperioden för titrering och applicering av tillräckligt med kristallviolett för att täcka hela ytan av brunnarna. För att uppnå framgångsrik färgning, se till att icke-infekterade celler var ordentligt täckta med kristallviolett och att alla brunnar är färgade. Detta indikerar att cellerna var friska och protokollet fungerade som förväntat.
Sammanfattningsvis föreslås användningen av kristallviolett färgning som ett snabbare och mindre kostsamt alternativ för objektiv detektion av CPE på TCID50-analyser, med liknande noggrannhet som den specifika ICC intracellulära märkning som vanligen tillämpas under denna typ av titrering. Det kan dock finnas fall där de patogenspecifika antikropparna kan upptäcka positiva brunnar som skulle gå oupptäckta med vår kristallviolett metod, eftersom ICC-positiva kommer att visa framgångsrikt infekterade celler, även innan infektionen leder till CPE. Därför, även om vi inte hittade betydande skillnader mellan de två, rekommenderas det starkt att testa båda metoderna för att bedöma känslighetsnivån i varje virustitrering för att bestämma potentiella skillnader och efterföljande justeringar innan du använder denna färgning rutinmässigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författare vill erkänna Dr. Frank Scholle för hans hjälpsamma kommentarer i manuskriptet, Chloe Mariant för hennes hjälp med mikroskopibilderna och Teresa M. Tiedge för hennes hjälpsamma engelska revision.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
