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Biology

स्थिर पिन के साथ माउस फीमर के अनुप्रस्थ फ्रैक्चर

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63074
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Developmental Biology, Harvard School of Dental Medicine, 2Keros Therapeutics

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क चूहों पर फ्रैक्चर करने और उपचार प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

फ्रैक्चर मरम्मत कंकाल का एक आवश्यक कार्य है जिसे विट्रो में मज़बूती से मॉडलिंग नहीं किया जा सकता है। एक माउस चोट मॉडल यह परीक्षण करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है कि क्या एक जीन, जीन उत्पाद या दवा हड्डी की मरम्मत को प्रभावित करती है क्योंकि मूरीन हड्डियां मानव फ्रैक्चर उपचार के दौरान देखे गए चरणों को दोहराती हैं। जब एक माउस या मानव एक हड्डी को तोड़ता है, तो एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू की जाती है, और पेरिओस्टेम, हड्डी के चारों ओर एक स्टेम सेल आला, सक्रिय और फैलता है। पेरिओस्टेम में रहने वाली कोशिकाएं तब एक संवहनी नरम कॉलस बनाने के लिए अंतर करती हैं। नरम कॉलस से एक हार्ड कैलस में संक्रमण तब होता है जब भर्ती कंकाल पूर्वज कोशिकाएं खनिज कोशिकाओं में अंतर करती हैं, और फ्रैक्चर किए गए सिरों के ब्रिजिंग के परिणामस्वरूप हड्डी संघ होता है। खनिजीकृत कैलस तब ठीक हड्डी के मूल आकार और संरचना को बहाल करने के लिए रीमॉडलिंग से गुजरता है। फ्रैक्चर हीलिंग का अध्ययन विभिन्न चोट मॉडलों का उपयोग करके चूहों में किया गया है। फिर भी, इस पूरी जैविक प्रक्रिया को दोहराने का सबसे अच्छा तरीका एक लंबी हड्डी के क्रॉस-सेक्शन के माध्यम से तोड़ना है जो दोनों cortices को शामिल करता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि वयस्क चूहों में उपचार का आकलन करने के लिए एक स्थिर, अनुप्रस्थ फीमर फ्रैक्चर को सुरक्षित रूप से कैसे किया जा सकता है। फ्रैक्चर उपचार के विभिन्न चरणों को चिह्नित करने के लिए विस्तृत कटाई और इमेजिंग तकनीकों सहित एक सर्जिकल प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है।

Introduction

फ्रैक्चर, हड्डी की सतह की निरंतरता में टूट जाता है, आबादी के सभी क्षेत्रों में होता है। वे उन लोगों में गंभीर हो जाते हैं जिनके पास उम्र बढ़ने या बीमारी के कारण नाजुक हड्डियां होती हैं, और नाजुकता फ्रैक्चर की स्वास्थ्य देखभाल लागत 5 वर्षों में $ 25 बिलियन से अधिक होने की उम्मीद है 1,2,3,4,5। फ्रैक्चर मरम्मत में शामिल जैविक तंत्र को समझना उपचार प्रक्रिया को बढ़ाने के उद्देश्य से नए उपचारों को विकसित करने में एक प्रारंभिक बिंदु होगा। पिछले शोध से पता चला है कि, फ्रैक्चर पर, चार महत्वपूर्ण कदम होते हैं जो हड्डी को चंगा करने में सक्षम बनाते हैं: (1) हेमेटोमा का गठन; (2) एक फाइब्रोकार्टेलाजिनस कैलस का गठन; (3) हड्डी बनाने के लिए नरम कैलस का खनिजीकरण; और (4) चंगा हड्डी 6,7 के remodeling. फ्रैक्चर को सफलतापूर्वक ठीक करने के लिए कई जैविक प्रक्रियाओं को सक्रिय किया जाता है। सबसे पहले, फ्रैक्चर 6,7 के तुरंत बाद एक तीव्र समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू की जाती है। फिर, पेरिओस्टेम सक्रिय हो जाता है और फैलता है, और पेरिओस्टेल कोशिकाएं एक उपास्थि कैलस बनाने के लिए चोंड्रोसाइट्स में अंतर करती हैं जो बाधित हड्डी खंडों 6,7,8,9 द्वारा छोड़े गए अंतर को भरने के लिए बढ़ती हैं। तंत्रिका और संवहनी कोशिकाएं 6,7,8,9,10 की मरम्मत की सुविधा के लिए आवश्यक अतिरिक्त कोशिकाओं और सिग्नलिंग अणुओं को प्रदान करने के लिए नवगठित कॉलस पर आक्रमण करती हैं। कैलस गठन में योगदान करने के अलावा, पेरिओस्टेल कोशिकाएं ओस्टियोब्लास्ट्स में भी अंतर करती हैं जो ब्रिजिंग कॉलस में बुनी हुई हड्डी को बिछाती हैं। अंत में, ओस्टियोक्लास्ट्स नवगठित हड्डी को अपने मूल आकार और लैमेलर संरचना 7,8,9,10,11 पर लौटने के लिए फिर से तैयार करते हैं। कई समूहों ने फ्रैक्चर मरम्मत के माउस मॉडल विकसित किए। चूहों में पहले और सबसे अधिक बार इस्तेमाल किए जाने वाले फ्रैक्चर मॉडल में से एक ईनहॉर्न दृष्टिकोण है, जहां एक विशिष्ट ऊंचाई12 से पैर पर वजन कम हो जाता है। कोण पर नियंत्रण की कमी और फ्रैक्चर को प्रेरित करने के लिए लागू बल हड्डी के विघटन के स्थान और आकार में बहुत अधिक परिवर्तनशीलता पैदा करता है। इसके बाद, इसके परिणामस्वरूप विशिष्ट फ्रैक्चर हीलिंग प्रतिक्रिया में भिन्नता देखी जाती है। अन्य लोकप्रिय दृष्टिकोण एक टिबियल मोनोकॉर्टिकल दोष या तनाव फ्रैक्चर का उत्पादन करने के लिए सर्जिकल हस्तक्षेप हैं, ऐसी प्रक्रियाएं जो तुलनात्मक रूप से मामूली उपचार प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती हैं10,13। इन मॉडलों में परिवर्तनशीलता मुख्य रूप से प्रक्रिया14 का संचालन करने वाले व्यक्ति के कारण होती है।

यहां, एक विस्तृत माउस फीमर चोट मॉडल एक पुनरुत्पादक चोट प्रदान करने और फीमर फ्रैक्चर मरम्मत के मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए ब्रेक पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, वयस्क चूहों के फीमर में एक पूर्ण सफलता पेश की जाती है और हड्डी के उपचार में शारीरिक लोडिंग की भूमिका के लिए फ्रैक्चर को स्थिर करती है। ऊतकों की कटाई और हिस्टोलॉजी और माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) का उपयोग करके उपचार प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को इमेजिंग करने के तरीके भी विस्तार से प्रदान किए गए हैं।

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Protocol

वर्णित सभी पशु प्रयोगों को हार्वर्ड मेडिकल एरिया की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में 12 सप्ताह पुराने C57BL / 6J चूहों (पुरुषों और महिलाओं) का उपयोग किया गया था। C57BL / 6J नर और मादा चूहों को 12 सप्ताह की उम्र के आसपास चोटी की हड्डी के द्रव्यमान को प्राप्त करने के लिए फीमर एक स्थिर पिन फिट करने के लिए पर्याप्त चौड़ा है, जिससे उन्हें इस प्रोटोकॉल15 के लिए उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त तनाव बन जाता है।

1. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. सर्जिकल कैंची, सीधे संदंश, घुमावदार संदंश, सर्जिकल क्लैंप, और हीरे काटने के पहिया ( सामग्री की तालिका देखें) सहित सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव करें ताकि संक्रमण के जोखिम को कम किया जा सके।
  2. पोस्ट-सर्जिकल रिकवरी की सुविधा के लिए हीटिंग पैड पर एक साफ माउस पिंजरे रखें। 37-45 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान तक पहुंचने के लिए हीट पैड सेट करें।
  3. एक isoflurane कक्ष का उपयोग कर संज्ञाहरण के तहत माउस जगह. प्रेरण ऑक्सीजन प्रवाह को 2 एल / मिनट पर सेट करें, आइसोफ्लुरेन प्रेरण 2-4% पर, रखरखाव नाक शंकु ऑक्सीजन 2 एल / मिनट पर, और रखरखाव आइसोफ्लुरेन 1.4% है।
  4. पुष्टि करें कि माउस की साँस लेना स्थिर है और वे पैर की अंगुली की चुटकी का जवाब नहीं देते हैं। कॉर्नियल स्क्रैचिंग को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र मरहम की एक पतली परत लागू करें। माउस को एक बाँझ पैड पर स्थानांतरित करें और एक नाक शंकु का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें ताकि चरण 1.3 के समान दर पर लगातार आइसोफ्लुरेन वितरित किया जा सके।
    नोट: 12-सप्ताह के पुराने चूहों या पुराने का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि युवा चूहों से फीमर एक स्थिर पिन को समायोजित करने के लिए बहुत पतले हो सकते हैं।
  5. माउस को 0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें धीमी गति से रिलीज buprenorphine ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. एक इलेक्ट्रिक ट्रिमर का उपयोग करके, फीमर के स्थान के अनुरूप दोनों जांघों पर 2 x 2 सेमी वर्ग शेव करें।
  7. आयोडीन की एक परत फैलाने के लिए बाँझ धुंध या स्वैब का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, इसके बाद 70% इथेनॉल (चित्रा 1 ए) के साथ कुल्ला करें।

2. सर्जरी

  1. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, मुंडा, कीटाणुरहित क्षेत्र में 5 मिमी चीरा बनाएं और अंतर्निहित प्रावरणी को उजागर करने के लिए त्वचा को छील लें।
  2. मांसपेशियों को उजागर करने के लिए सीधे संदंश और ठीक कैंची का उपयोग करें और सीधे फीमर को कवर करने वाले प्रावरणी को नाजुक रूप से हड़पने और काटने के लिए। प्रावरणी का एक 5 मिमी कट अंतर्निहित मांसपेशी तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है।
  3. सीधे संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, धीरे से न्यूनतम ऊतक क्षति के साथ फीमर से मांसपेशियों को अलग करें।
  4. एक बार जब फीमर दिखाई देता है, तो अलग की गई मांसपेशियों और हड्डी के बीच फीमर के नीचे घुमावदार संदंश को स्लाइड करें। मांसपेशियों के अलगाव को बनाए रखने के लिए संदंश को धीरे-धीरे खोलने दें और एक साफ कटौती की सुविधा के लिए फीमर को सुरक्षित करें।
    नोट: फीमर को उजागर और मांसपेशियों और त्वचा से अलग रहना चाहिए जब संदंश आयोजित नहीं किए जाते हैं, जैसा कि चित्र 1 बी में दिखाया गया है।
  5. कम शक्ति सेटिंग पर एक हैंडहेल्ड देखा का उपयोग करके फीमर शाफ्ट के बीच में एक अनुप्रस्थ कटौती करें (ब्लेड और रोटरी टूल किट का उपयोग करने के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एक बार फीमर पूरी तरह से कट जाने के बाद, दो फ्रैक्चर सिरों को बनाया जाता है: समीपस्थ अनुभाग (कूल्हे की हड्डी से जुड़ा हुआ) और डिस्टल सेक्शन (घुटने से जुड़ा हुआ, जिसे दमघोंटू जोड़ के रूप में भी जाना जाता है)। एक ही गति में फीमर काटने से बचें। इसके बजाय, 3-5 पास बनाएं जब तक कि फीमर पूरी तरह से काट न जाए। यह आसपास के ऊतकों को ओवरहीटिंग से बचने और महत्वपूर्ण हड्डी के मलबे को उत्पन्न करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो उपचार को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है।
  6. डिस्टल अनुभाग के मज्जा गुहा में एक गाइड सुई (23 G x 1 TW IM, 0.6 mm x 25 mm) ( सामग्री की तालिका देखें) डालें। धीरे से सुई मोड़ के लिए उंगलियों का उपयोग करें के रूप में आप घुटने के जोड़ (चित्रा 1 सी) के माध्यम से धागे के लिए धक्का.
    1. डिस्टल एंड से गाइड सुई को हटा दें और निकटस्थ छोर पर दोहराएं, कूल्हे के जोड़ के माध्यम से गाइड सुई को धक्का देने के लिए एक ही कोमल घुमा गति का उपयोग करें। गाइड सुई को समीपस्थ अंत में छोड़ दें, इसकी नोक के साथ त्वचा से उभरा (चित्रा 1 डी)।
      नोट: फ्रैक्चर सिरों को स्थिर करने के लिए, फ्रैक्चर सिरों के माध्यम से एक मार्ग बनाने के लिए पहले एक गाइड सुई का उपयोग किया गया था, और फिर फ्रैक्चर सिरोंको सुरक्षित करने के लिए इस मार्ग के माध्यम से एक स्थिर पिन थ्रेड किया गया था।
  7. गाइड सुई की नोक में स्थिर पिन (सुई, 27 G x 1 1/4, 0.4 मिमी x 30 मिमी) ( सामग्री की तालिका देखें) डालें (चित्रा 1E)। धीरे से धक्का इतना है कि स्थिर पिन प्रवेश करता है के रूप में गाइड सुई समीपस्थ अंत के मज्जा गुहा से बाहर निकलता है.
    1. गाइड सुई को छोड़ दें। समीपस्थ अंत के साथ डिस्टल एंड को पकड़ने और संरेखित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और डिस्टल मज्जा गुहा के माध्यम से स्थिर पिन को थ्रेड करना जारी रखें जब तक कि यह 2.6 (चित्रा 1 एफ) में बनाए गए मार्ग का उपयोग करके घुटने के जोड़ से बाहर नहीं निकलता है।
      नोट: स्थिर पिन अब कूल्हे और घुटने के जोड़ों से बाहर निकलना चाहिए।
  8. सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करते हुए, समीपस्थ और डिस्टल वर्गों को एक साथ लाने के लिए पिन की नोक को खींचें, इसलिए वे मुश्किल से छू रहे हैं। यदि आवश्यक हो तो फ्रैक्चर संदंश के साथ समाप्त होता है, और सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करके फ्रैक्चर साइट की ओर स्थिर पिन के सिरों को मोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. तार कटर का उपयोग करके सुई के आधार से प्लास्टिक को हटा दें। क्लैंप का उपयोग करके, पिन के दोनों सिरों को मोड़ें जब तक कि वे आंतरिक ऊतक क्षति से बचने के लिए कुंद न हों।
      नोट: फ्रैक्चर सिरों को अब जगह में बंद कर दिया गया है ताकि माउस घायल पैर पर वजन डाल सके। यदि फ्रैक्चर छोर अलग करने में असमर्थ हैं तो पिन सुरक्षित है। सिरों को कुंद करने के लिए एक तार कटर का भी उपयोग किया जा सकता है। स्थिर पिन को अध्ययन की पूरी अवधि के लिए जगह में रहना चाहिए जब तक कि माउस euthanized न हो। पिन को हटाने के प्रयास फ्रैक्चर प्रतिक्रिया को अस्थिर करने और जानवर को नुकसान पहुंचाने की संभावना है। पिन विच्छेदन पर हटाया जा सकता है।
  9. फीमर पर मांसपेशियों को पुनर्स्थापित करने के लिए सीधे संदंश का उपयोग करें। घुमावदार संदंश का उपयोग करके, त्वचा के सिरों को एक साथ पिंच करें और घाव क्लिप का उपयोग करके उद्घाटन को बंद कर दें।
    नोट: क्लिप के साथ त्वचा को बहुत कसकर बंद न करें या माउस इस पैर पर वजन डालने से बचेगा। वसूली के दौरान शारीरिक लोडिंग को सीमित करने से उपचार प्रक्रिया में देरी हो सकती है।
  10. दूसरे पैर पर चरण 2.2 से 2.4 तक दोहराएं और फीमर फ्रैक्चर किए बिना घाव को बंद करें।
    नोट: यह शाम संचालित फीमर contralateral नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  11. आइसोफ्लुरेन एक्सपोजर को वापस लें, माउस को गर्म पिंजरे में रखें, और सुनिश्चित करें कि वे 10-15 मिनट के भीतर चेतना प्राप्त करें।
  12. संकट या संक्रमण के संकेतों के लिए सर्जरी के बाद 5 दिनों के लिए माउस की गतिविधि और चीरा साइट की दैनिक निगरानी करें।
    नोट: यदि जानवर दर्द के संकेतों को प्रदर्शित करता है, तो खा नहीं रहा है, और / या अपने हिंडलिंब्स पर चलने में संकोच करता है, पशु चिकित्सा कर्मियों के साथ परामर्श करें और अतिरिक्त एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
  13. सर्जरी के 10 दिन बाद घाव क्लिप को हटा दें।
    नोट: यदि घाव 10 दिनों के बाद बंद होने के लिए प्रकट नहीं होता है, तो क्लिप को हटाने से पहले पशु चिकित्सा व्यक्तित्व और IACUC से परामर्श करें।

3. ऊतक फसल

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 साँस लेना के माध्यम से चूहों euthanize.
    नोट: यह प्रक्रिया अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन के इच्छामृत्यु पर पैनल के अनुरूप है।
  2. कैंची और संदंश का उपयोग करके, दोनों माउस पैरों से त्वचा को हटा दें, कूल्हे की हड्डी से ऊरु के सिर को विस्थापित करें, और पैर को मुक्त करने के लिए आसन्न मांसपेशियों में कटौती करें।
    नोट: फीमर के आसपास बहुत अधिक मांसपेशियों को हटाने से बचें क्योंकि कॉलस को हटाया जा सकता है या क्षतिग्रस्त किया जा सकता है।
  3. स्थिर पिन से बचने, टिबिया से फीमर को अलग करने के लिए घुटने के जोड़ के माध्यम से काटें।
  4. स्थिर पिन के सिरों को उजागर करने के लिए फीमर के दूरस्थ और समीपस्थ भागों के चारों ओर विच्छेदन करें।
  5. एक हार्ड वायर कटर के साथ, पिन के मुड़े हुए कुंद सिरों को काट लें ताकि पिन का केवल सीधा हिस्सा रह जाए। धीरे-धीरे और धीरे-धीरे स्थिर पिन को फीमर से बाहर स्लाइड करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    नोट:: यदि पिन आसानी से बाहर स्लाइड नहीं करता है, तो बल लागू न करें क्योंकि यह कॉलस को हटा सकता है और नमूने को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके बजाय, पिन को घुमाने और इसे नाजुक रूप से हटाने का प्रयास करें। पिन को हटाना भी निर्धारण के बाद आसान हो सकता है।

4. हिस्टोलॉजी - Alcian ब्लू / Eosin /

नोट: Alcian ब्लू / ऑरेंज जी / Eosin धुंधला नियमित रूप से उपास्थि (नीले) और हड्डी (गुलाबी) की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। उपास्थि क्षेत्र को कुल कैलस क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिमाणित किया जा सकता है (चित्रा 2 ए, बी)।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन में फीमर को ठीक करें।
  2. फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में निश्चित नमूनों को धोएं।
  3. 0.5M EDTA में नमूने रखें, पीएच 8.0 2 सप्ताह के लिए धीरे-धीरे घूर्णन शेकर पर। कुशल decalcification सुनिश्चित करने के लिए हर दूसरे दिन EDTA समाधान बदलें।
    नोट:: शेकर के लिए कोई विशिष्ट rpm आवश्यक है; सुनिश्चित करें कि तरल सभी नमूनों को कवर करने के लिए कंटेनर में बहता है। पूर्ण डिकैल्सिफिकेशन का परीक्षण फीमर के एक्स-रे द्वारा किया जा सकता है।
  4. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए नमूनों को संसाधित करने के लिए उन्हें निम्नलिखित समाधानों (1 ज प्रत्येक) में इनक्यूबेट करें: 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylene, Xylene, पैराफिन, पैराफिन।
  5. अनुभाग के लिए पैराफिन में नमूनों को एम्बेड करें।
  6. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके फ्रैक्चर किए गए फीमर के 5-7 μm मोटे अनुदैर्ध्य वर्गों को काटें।
  7. Xylene के 2 स्नान (प्रत्येक 5 मिनट) में incubating द्वारा वर्गों deparaffinize.
  8. निम्नलिखित इथेनॉल ग्रेडिएंट (प्रत्येक 2 मिनट) में incubating द्वारा वर्गों rehydrate: 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
  9. 1min के लिए नल के पानी में स्लाइड रखें।
  10. पूरक फ़ाइल 1 में उल्लिखित हिस्टोलॉजी के लिए एल्शियन ब्लू, एसिड अल्कोहल, अमोनियम पानी और ईओसिन / ऑरेंज जी के समाधान बनाएं।
    नोट:: प्रत्येक समाधान के सुझाए गए वॉल्यूम पूरी तरह से धुंधला करने के लिए स्लाइड्स को डुबोने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  11. 30 s के लिए एसिड अल्कोहल में स्लाइड रखें और 40 मिनट के लिए Alcian नीले रंग में इनक्यूबेट करें।
  12. चल रहे नल के नीचे धीरे से धोएं जब तक कि पानी लगभग 2 मिनट के लिए स्पष्ट न हो जाए।
  13. स्लाइड को एसिड अल्कोहल में 1 सेकंड के लिए तेजी से डुबोएं।
  14. चरण 4.9 में वर्णित के रूप में कुल्ला।
  15. 15 सेकंड के लिए अमोनियम पानी में इनक्यूबेट करें।
  16. चरण 4.9 में वर्णित के रूप में कुल्ला।
  17. 1 मिनट के लिए 95% EtOH में रखें और 90 s के लिए Eosin / Orange G में इनक्यूबेट करें।
  18. 70% EtOH, 80% EtOH और 100% EtOH में एक ही डुबकी के साथ स्लाइड्स को जल्दी से निर्जलित करें।
  19. स्लाइड्स को साफ़ करने के लिए 1 मिनट के लिए Xylene में स्लाइड रखें।
  20. इमेजिंग के लिए बढ़ते मीडिया और एक coverslip लागू होते हैं।
    नोट: आणविक विश्लेषण के लिए, आरएनए और प्रोटीन को कॉलस से अलग किया जा सकता है। एक विच्छेदन दायरे के तहत मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें और एक स्केलपेल का उपयोग करके अंतर्निहित हड्डी से कैलस को अलग करें।

5. माइक्रोसीटी

नोट: उपचार के बाद के चरणों में, माइक्रोसीटी को हार्ड कॉलस और फ्रैक्चर गैप में खनिजीकरण को छवि और मापने के लिए किया जा सकता है। C57BL/6J चूहों में, कॉलस को आमतौर पर 10 दिनों के बाद फ्रैक्चर (dpf) (चित्रा 2C) के बाद माइक्रोसीटी द्वारा खनिज और पता लगाने योग्य होता है।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन में फीमर को ठीक करें।
    नोट: MicroCT एक ही फीमर histology के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में यह EDTA decalcification (चरण 4.3) से पहले किया जाता है. दोनों तकनीकों के लिए एक ही फीमर का उपयोग करते समय, माइक्रोसीटी करें, नमूनों को पुनः प्राप्त करें और चरण 4.3 पर जाएं।
  2. फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में निश्चित नमूनों को धोएं और 70% ईटीओएच में स्टोर करें।
  3. 55 kVP के ऊर्जा स्तर और 145 μA की तीव्रता पर 7 μm के एक आइसोट्रोपिक वोक्सेल आकार के साथ माइक्रोसीटी का प्रदर्शन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. कॉलस को शामिल करने और कॉर्टिकल हड्डी को बाहर करने के लिए माइक्रोसीटी स्लाइस को समोच्च करें।
    नोट:: के रूप में callus समय के साथ और अधिक mineralized हो जाता है, थ्रेशोल्ड विज़ुअलाइज़ करने और विभिन्न चरणों में callus मात्रा को मापने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  5. कैलस वॉल्यूम के माप के रूप में कैलस समोच्च में निहित हड्डी की मात्रा प्राप्त करें।
    नोट: फ्रैक्चर गैप को सीधे माइक्रोसीटी स्लाइस पर ब्रेक द्वारा कब्जा की गई दूरी के रूप में मापा जा सकता है।

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Representative Results

C57BL / 6J चूहों में, एक सफल सर्जरी पहले उल्लिखित उपचार चरणों को पूरा करती है, जिसमें कोई स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया नहीं होती है या शाम-संचालित contralateral फीमर में पेरिओस्टेल भागीदारी नहीं होती है। एक हेमेटोमा सर्जरी के कुछ घंटों बाद बनता है, और पेरिओस्टेम को चोंड्रोजेनेसिस के लिए कंकाल पूर्वजों की भर्ती करने के लिए सक्रिय किया जाता है। विभिन्न सेल आबादी, जैसे कि Prx1 + mesenchymal पूर्वजों, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल (चित्रा 3) का उपयोग करके मरम्मत प्रक्रिया के दौरान पता लगाया जा सकता है। फ्रैक्चर (डीपीएफ) के बाद 5 दिनों में, एल्शियन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग नरम कैलस की कल्पना करने और बाद में उपास्थि क्षेत्र (चित्रा 2 ए, बी) को मापने के लिए किया जा सकता है। खनिजीकरण माइक्रोसीटी द्वारा 28 डीपीएफ (चित्रा 2 सी) पर पता लगाने योग्य है। खनिजीकृत कॉलस की मात्रा, फ्रैक्चर गैप की दूरी, और यांत्रिक परीक्षण द्वारा मापी गई हड्डी की ताकत का उपयोग आमतौर पर फ्रैक्चर मरम्मत के मात्रात्मक परिणामों के रूप में किया जाता है। आनुवांशिक संशोधन या दवा हस्तक्षेप वसूली के पाठ्यक्रम को बदल सकता है, इसलिए मरम्मत के विभिन्न चरणों में फ्रैक्चर को चिह्नित करने के लिए एक समय-पाठ्यक्रम अध्ययन करने की सिफारिश की जाती है। पूरे कैलस को आणविक विश्लेषण के लिए विच्छेदित किया जा सकता है और contralateral हड्डी शाफ्ट को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।  यदि फ्रैक्चर सिरों को पिन के साथ संरेखित या पर्याप्त रूप से सुरक्षित नहीं किया जाता है, तो परिणामी छवियां फ्रैक्चर साइट के सभी या एक तरफ कॉलस गठन की कमी दिखाएंगी (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: स्थिर पिन का फ्रैक्चर और सम्मिलन। (A) C57BL/6J माउस के दाहिने पैर पर एक वर्ग शेव किया जाता है। (बी) त्वचा और प्रावरणी में एक चीरा बनाने के बाद, मांसपेशियों, त्वचा और हड्डी को अलग करने के लिए फीमर के नीचे घुमावदार संदंश को सुरक्षित किया जाता है। (सी) कट करने के बाद, दो फ्रैक्चर सिरों का निर्माण किया जाता है: कूल्हे की हड्डी से जुड़े फीमर का समीपस्थ खंड और घुटने से जुड़ा डिस्टल सेक्शन। गाइड सुई (हरे) को दूरस्थ अनुभाग में डाला जाता है और घुटने के जोड़ के माध्यम से धक्का दिया जाता है। (डी) गाइड सुई को दूरस्थ अनुभाग से हटा दिया जाता है, समीपस्थ अनुभाग में डाला जाता है, और कूल्हे के जोड़ के माध्यम से धक्का दिया जाता है। (ई) स्थिर पिन (ग्रे सुई) को कूल्हे के जोड़ से निकलने वाली गाइड सुई में डाला जाता है। (एफ) स्थिर पिन को समीपस्थ अनुभाग के माध्यम से, डिस्टल अनुभाग में, और घुटने के जोड़ के माध्यम से सी में गाइड सुई द्वारा बनाए गए पथ का उपयोग करके धक्का दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: फीमर फ्रैक्चर के हिस्टोलॉजी और माइक्रोसीटी। (ए) फीमर फ्रैक्चर के फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन वर्गों को 5, 10 और 28 डीपीएफ पर एकत्र किया गया था और एल्सियन ब्लू / ईोसिन / ऑरेंज जी के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 500 μm। (बी) उपास्थि क्षेत्र को 5, 10 और 28 डीपीएफ पर इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। (सी) 28 डीपीएफ पर, खनिजीकरण देखा गया था, और कैलस की मात्रा और फ्रैक्चर गैप को माइक्रोसीटी द्वारा मापा जा सकता था। स्केल बार = 1,000 μm. माध्य ± SEM के रूप में दिखाया गया डेटा. खनिजीकृत कैलस की मात्रा को फ्रैक्चर साइट पर कॉर्टिकल हड्डी के चारों ओर कंटूरिंग द्वारा मापा गया था। गहरे भूरे रंग का क्षेत्र छवि पर खनिजीकृत कॉलस को चित्रित करता है, जबकि कॉर्टिकल हड्डी (हल्के भूरे) को माप में शामिल नहीं किया गया है। माध्य ± SEM के रूप में दिखाया गया डेटा. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मॉडल फ्रैक्चर के बाद Prx1 + periosteal कोशिकाओं के विस्तार की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया। Prx1CreER; Rosa26tdTomato चूहों को tdTomato अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए tamoxifen के 80 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के साथ पांच दिनों के लिए दैनिक इंजेक्ट किया गया था। अंतिम इंजेक्शन के तीन दिन बाद, फीमर फ्रैक्चर शुरू किया गया था, और चूहों को ट्रैक करने के लिए 7 या 14 डीपीएफ पर बलिदान किया गया था, जहां Prx1-व्यक्त कोशिकाएं और उनकी संतान (Prx1+) फ्रैक्चर कॉलस और विस्तारित पेरिओस्टेम के भीतर स्थित हैं। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सर्जिकल मुद्दों के कारण अनियमित उपचार का उदाहरण। फ्रैक्चर सिरों को ठीक से संरेखित नहीं किया गया था और इस उदाहरण में फीमर के समीपस्थ अनुभाग के माध्यम से स्थिर पिन को छेदा गया था। इन त्रुटियों के परिणामस्वरूप कैलस गठन हुआ जहां फीमर को कट साइट के बजाय छेदा गया था (पीला बॉक्स)। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: हिस्टोलॉजी के लिए आवश्यक समाधानों की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में विस्तृत चोट मॉडल में सहज फ्रैक्चर के उपचार के दौरान देखे गए सभी चार महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं, जिनमें (1) हेमेटोमा के गठन के साथ प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया, (2) नरम कैलस बनाने के लिए पेरिओस्टियम से कंकाल पूर्वजों की भर्ती, (3) ओस्टियोब्लास्ट्स द्वारा कॉलस का खनिजीकरण और (4) ओस्टियोक्लास्ट द्वारा हड्डी की रीमॉडलिंग शामिल है।

इस पांडुलिपि में वर्णित सर्जिकल प्रक्रिया कम से कम 12 सप्ताह पुराने वयस्क चूहों के लिए अनुकूलित है। एक 27 जी एक्स 1 1/4 (0.4 मिमी x 30 मिमी) सुई का उपयोग स्थिर पिन के रूप में किया जाता है क्योंकि यह इस उम्र में मज्जा गुहा की चौड़ाई के लिए आदर्श आकार है। यदि आवश्यक हो, तो छोटे जानवरों के लिए प्रोटोकॉल में संशोधन किया जा सकता है यदि एक पतले स्थिर पिन का उपयोग किया जाता है। स्थिर पिन सर्जरी की सफलता का एक अनिवार्य हिस्सा है क्योंकि अस्थिरता फ्रैक्चर उपचार16 को काफी प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। अन्य स्थिरीकरण विधियों की समीक्षा की गई है और सभी अपने फायदे और सीमाओं के साथ आते हैं 17,18,19। आदर्श स्थिरीकरण का चयन अनुसंधान प्रश्न और प्रयोगात्मक लक्ष्य के आधार पर किया जाना चाहिए। यहां वर्णित स्थिरीकरण की एक सीमा यह है कि पिन विकास प्लेटों और जोड़ों के माध्यम से जाता है। यदि आर्टिकुलर या ग्रोथ प्लेट उपास्थि से योगदान चिंता का विषय है, तो हम एक और स्थिर विधि पर विचार करने का सुझाव देते हैं।

सर्जिकल तकनीक में परिवर्तनशीलता और जानवरों के बीच इस सर्जरी को करते समय एक चिंता का विषय है। इसलिए, विशेष रूप से मात्रात्मक रीडआउट के लिए पर्याप्त संख्याओं का उपयोग करने और समूहों में समान प्रकार के फ्रैक्चर की तुलना करने की सिफारिश की जाती है। 2 मिमी से अधिक अंतराल से बचने के लिए फीमर वर्गों को एक साथ सुरक्षित करना महत्वपूर्ण है। अनुभागों के बीच अंतराल में परिवर्तनशीलता कॉलस के आकार और मरम्मत के समय को काफी प्रभावित कर सकती है। अनुभागों को भी ठीक से संरेखित किया जाना चाहिए। ढीले और misaligned फ्रैक्चर नमूनों भर में अधिक महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का कारण होगा और उपचार को खराब कर सकता है।

वजन-असर हड्डी के उपचार के समय के लिए भी महत्वपूर्ण है और चूहों के बीच परिवर्तनशीलता पेश कर सकता है। अधिकांश चूहों ने सर्जरी के कुछ घंटों बाद घायल पैर पर कम से कम वजन डाला, लेकिन अगले दिन तक सामान्य रूप से चलना चाहिए। यह सत्यापित करना कि माउस सामान्य रूप से चलता है और लोड दोनों पैरों पर समान रूप से वितरित किया जाता है, महत्वपूर्ण है, खासकर जब एक शाम-संचालित नियंत्रण के रूप में contralateral फीमर का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, सर्जरी एक प्रणालीगत सूजन को ट्रिगर कर सकती है जो contralateral पैर को प्रभावित करती है। इसलिए इस तकनीक को स्थापित करते समय गैर-संचालित चूहों के लिए शाम-संचालित फीमर की तुलना करने की सिफारिश की जाती है। गैर-संचालित नियंत्रण होने से आरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव जैसे मात्रात्मक परिणामों के लिए भी बेहतर हो सकता है।

फ्रैक्चर ज्यामिति की स्थिरता अन्य तरीकों20 के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकती है, लेकिन एक आरी का उपयोग करके सर्जन के लिए अधिक नियंत्रण की अनुमति मिलती है और आगामी फ्रैक्चर में परिवर्तनशीलता को कम करता है। देखा दृष्टिकोण भी समीपस्थ माउस फीमर के metaphyseal फ्रैक्चर बनाने के लिए सफलतापूर्वक21 इस्तेमाल किया गया है.

फ्रैक्चर उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया में नर और मादा चूहों के बीच अंतर शायद ही कभी देखा जाता है। हालांकि, सेक्स उम्र और नशीली दवाओं के हस्तक्षेप के साथ एक कारक बन सकता है, इसलिए नमूनों के संयोजन से पहले लिंग के मतभेदों से पूछताछ करने के लिए एक ही लिंग के जानवरों की तुलना या आंकड़ों का प्रदर्शन करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को C57BL6 / J चूहों के लिए डिज़ाइन किया गया था। अन्य माउस उपभेदों का उपयोग करने वाले जांचकर्ताओं को किसी भी लिंग अंतर की पहचान करने के लिए पुरुष और महिला चूहों में उपचार की तुलना करनी चाहिए।

हमारा मानना है कि यह फीमर फ्रैक्चर सर्जरी चूहों में महत्वपूर्ण उपचार चरणों को दोहराने के लिए एक कुशल मॉडल है और इसका उपयोग मनुष्यों में फ्रैक्चर वसूली पर आनुवंशिक संशोधनों या चिकित्सीय हस्तक्षेपों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम परियोजना के साथ वित्तीय सहायता और मार्गदर्शन के लिए डॉ विकी रोसेन को धन्यवाद देते हैं। हम बाँझ तकनीक, पशु कल्याण और इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों के बारे में परामर्श के लिए हार्वर्ड स्कूल ऑफ मेडिसिन में पशु चिकित्सा और आईएसीयूसी कर्मचारियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle BD precision 305193 Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) BD precision 305136 Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit Braintree Scientific, INC ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX Electron Microscopy Sciences 10350
Ammonium hydroxide Millipore Sigma AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX Abrasive technologies CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit Dremel 7700 1/15
Eosin Y ThermoScientific 7111
Fine curved dissecting forceps VWR 82027-406
Hematoxulin Gill 2 Sigma-Aldrich GHS216
Hydrochloric acid Millipore Sigma HX0603-4
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Microsurgical kit VWR 95042-540
Orange G Sigma-Aldrich 1625
Phloxine B Sigma-Aldrich P4030
Povidone-Iodine Swabs PDI S23125
SCANCO Medical µCT35 Scanco
Slow-release buprenorphine Zoopharm

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References

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जीव विज्ञान अंक 178 माउस फ्रैक्चर फीमर हड्डी चोट periosteum
स्थिर पिन के साथ माउस फीमर के अनुप्रस्थ फ्रैक्चर
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Moore, E. R., Feigenson, M.,… More

Moore, E. R., Feigenson, M., Maridas, D. E. Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin. J. Vis. Exp. (178), e63074, doi:10.3791/63074 (2021).

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