安定化ピン付きマウス大腿骨の横骨折
Summary
このプロトコルは、成体マウスに骨折を行い、治癒過程を監視する方法を記載する。
Abstract
骨折修復は、 インビトロで確実にモデル化することができない骨格の不可欠な機能である。マウス傷害モデルは、マウスの骨がヒトの骨折治癒中に観察された段階を再現するため、遺伝子、遺伝子産物、または薬物が骨の修復に影響を与えるかどうかをテストするための効率的なアプローチです。マウスやヒトが骨を折ると炎症反応が始まり、骨自体を囲む幹細胞ニッチである骨膜が活性化され、膨張します。その後、骨膜に生息する細胞が分化し、血管新生ソフトカルスを形成する。軟カルスから硬質カルスへの移行は、動員された骨格前駆細胞が石灰化細胞に分化し、骨折した末端の架橋が骨結合をもたらすときに起こる。その後、石灰化したカルスは、治癒した骨の元の形状と構造を復元するために改造を受けます。骨折治癒は、様々な傷害モデルを用いてマウスにおいて研究されている。それでも、この生物学的プロセス全体を再現する最良の方法は、両方の皮質を含む長骨の断面を突破することです。このプロトコルは、成体マウスの治癒を評価するために、安定化された横大腿骨骨折を安全に行うことができる方法を記述している。骨折治癒のさまざまな段階を特徴付けるための詳細な収穫および画像化技術を含む外科的プロトコルも提供される。
Introduction
骨折、骨表面の連続性の切断は、集団のすべてのセグメントで起こる。彼らは老化や病気のために壊れやすい骨を持っている人々で重篤になり、脆弱性骨折の医療費は5年間で250億ドルを超えると予想されています1,2,3,4,5。骨折修復に関与する生物学的メカニズムを理解することは、治癒プロセスを強化することを目的とした新しい治療法を開発する際の出発点となるでしょう。以前の研究では、骨折時に、骨を治癒させる4つの重要なステップが起こることが示されている:(1)血腫の形成;(2)線維軟骨カルスの形成;(3)軟質カルスの石灰化により骨を形成する工程;(4)治癒した骨のリモデリング 6,7.多くの生物学的プロセスは、骨折を正常に治癒するために活性化される。第1に、急性炎症促進反応が骨折の直後に開始される6,7。そして、骨膜が活性化・膨張し、骨膜細胞が軟骨細胞に分化して軟骨カルスを形成し、破壊された骨セグメント6、7、8、9によって残された隙間を埋めるために成長する。神経および血管細胞は、新たに形成されたカルスに侵入して、修復を容易にするために必要な追加の細胞およびシグナル伝達分子を提供する6、7、8、9、10。カルス形成に寄与することに加えて、骨膜細胞はまた、架橋カルスに織り込まれた骨を横たえる骨芽細胞に分化する。最後に、破骨細胞は、新しく形成された骨を元の形状および層状構造7、8、9、10、11に戻すように改造する。多くのグループが骨折修復のマウスモデルを開発した。マウスにおいてより早く、最も頻繁に使用される骨折モデルの1つは、特定の身長から脚に体重を落とすアインホーンアプローチである12。角度と骨折を誘発するために加えられる力に対する制御の欠如は、骨の不連続性の位置およびサイズに多くの変動性を作り出す。続いて、観察される特定の骨折治癒応答に変動をもたらす。他の一般的なアプローチは、脛骨単皮質欠損またはストレス骨折を生じる外科的介入であり、比較的穏やかな治癒応答を誘導する手順である10、13。これらのモデルにおける変動性は、主に、手順14を実施する人によるものである。
ここで、詳細なマウス大腿骨損傷モデルは、再現性のある傷害を提供し、大腿骨骨折修復の定量的および定性的評価を可能にするために、骨折の制御を可能にする。具体的には、成体マウスの大腿骨に完全なブレークスルーが導入され、骨折端を安定させて、骨治癒において物理的負荷が果たす役割を説明する。組織を採取し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影法(microCT)を用いて治癒プロセスの異なるステップを画像化するための方法も詳細に提供される。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールで詳述されている傷害モデルは、(1)血腫の形成を伴う炎症促進反応、(2)軟質カルスを形成するための骨膜からの骨格前駆細胞の動員、(3)骨芽細胞によるカルスの石灰化および(4)破骨細胞による骨のリモデリングを含む、自然骨折の治癒中に観察される4つの重要なステップすべてを包含する。
この原稿に記載された外科的処置は、少なくとも12週齢の成?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、このプロジェクトの財政的支援と指導に対してVicki Rosen博士に感謝します。また、ハーバード大学医学部の獣医およびIACUCのスタッフには、滅菌技術、動物の幸福、およびこのプロトコルの開発に使用された材料に関する相談に感謝します。
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
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