Summary
Her præsenterer vi en protokol til forbedring af succesen med interfasefluorescens in situ-hybridiseringsdetektion på knoglemarvsudstrygninger fra myelomatosepatienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) detektion er en uundværlig metode i genetisk risikostratificering i multipelt myelom (MM), som er en af de mest almindelige hæmatologiske maligniteter. Den identificerende egenskab ved MM er akkumulerede maligne plasmaceller i knoglemarv. FISH-rapporter for MM fokuserer primært på oprensede eller identificerede klonale plasmaceller snarere end alle nukleerede celler ved at sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller markere med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ eller λ. Knoglemarvsinterfasekerner opnås normalt fra friske knoglemarvsceller. Tilfredsstillende berigelse af plasmacelleprøver kræver imidlertid store mængder frisk heparin antikoguleret knoglemarv, som ikke kan opnås i tilfælde af vanskelig knoglemarvsekstraktion eller en knoglemarvstørhane. Heri etablerer vi en ny metode til at forbedre succesen med FISH-detektion på farvede eller ufarvede knoglemarvsudtværinger. Knoglemarvsudstrygninger er lettere at opnå end antikoagulerede knoglemarvsprøver.
Introduction
Myelomatose (MM) er en ondartet plasmacellesygdom (PC) med stærk biologisk heterogenitet og store individuelle forskelle i klinisk effekt med overlevelsesperioder fra måneder til årtier. Cytogenetiske egenskaber er vigtige prognostiske indikatorer for MM. Risikostratificeringssystemet og individualiserede behandlinger baseret på genetiske egenskaber er blevet emner af intens interesse for klinisk forskning på MM1. Afvigelserne af pc'er, der er testet i et fluorescens in situ-hybridiseringspanel (FISH) af knoglemarv (BM), omfatter del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) forstærkning/forstærkning og 1p (CDKN2C) deletion.
Standard metafasecytogenetik bør indgå i den indledende vurdering af MM-patienter. Selvom konventionel G-båndet karyotyping giver fordelen ved en helkromosomanalyse, fører det lave udbytte af denne metode til mange falske negative resultater2. Traditionelt er pc'er blevet betragtet som stort set ude af stand til at opdele, fordi de er slutstadiet af B-lymfocytdifferentiering. Dette gør det vanskeligt at få opdelte billeder. Forbedret cytogenetisk analyse i MM med langtidskulturer (6 dage) og stimulering af kulturer med cytokiner kan være en lovende metode til at identificere cytogenetiske abnormiteter hos nydiagnosticerede MM-patienter3. Selv når dyrkningstiden blev forlænget til 6 dage, blev cytogenetiske abnormiteter imidlertid nøjagtigt rapporteret hos 30%-50% af MM-patienterne4. Desuden er MM karakteriseret ved komplekse cytogenetiske aberrationer, der afspejler dets prognostiske heterogenitet. Opløsningen af traditionel kromosombåndsteknologi er imidlertid lav, hvilket let kan føre til manglende påvisning af kromosomale abnormiteter i MM.
Interfase FISH, helst efter CD138-positiv magnetisk perlebaseret PC-sortering eller mærkning med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ/λ, er uundværlig i analysen af MM5,6. En CD138-positiv udvalgt prøve anbefales kraftigt til det optimerede udbytte af tumorceller. Imidlertid kræver nøjagtig kvantation af cytogenetiske aberrationer mindst 4 ml antikoaguleret BM til pc-sortering. Derudover øger kombinationerne af enten CD138 immunomagnetisk perlesortering med FISH eller cytoplasmatisk κ/λ lyskædeimmunglobulin med FISH-test (cIg-FISH) adskillige eksperimentelle omkostninger og er tidskrævende.
Normalt vurderes PC-forholdet først ud fra den morfologiske undersøgelse af farvede BM-udstrygninger eller BM-biopsiafsnit7,8. BM-prøver af højeste kvalitet (første marvsaspiratprøver) anvendes til morfologisk testning, mens de, der sendes til FISH eller anden påvisning, ofte er de sekundære aspireringsprøver med høje fortyndingsforhold med perifert blod.
Allerede i 1990'erne viste flere undersøgelser, at BM-udstrygninger kan anvendes direkte til interstitielle FISH-undersøgelser, hvilket har vist sig at være en pålidelig og repeterbar metode9. En elegant undersøgelse baseret på cellemorfologi og esterasecytokemi kombineret med FISH af perifert blod og BM-udstrygninger bekræftede dens store kliniske betydning for belysning af kromosomale abnormiteter hos patienter med granulocytisk og lymfatisk leukæmi10.
Heri leverer vi en ny metode til forbedring af succesen med interfase FISH-detektion hos MM-patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen og godkendt af den etiske komité for Zhongnan Hospital ved Wuhan University (nr. 2019065). Prøverne blev indsamlet fra en MM-patient i Hæmatologisk Afdeling, Zhongnan Hospital ved Wuhan University (Kina).
1. Forberedelse af BM-udstrygningerne
- Anbring de første 0,2 ml BM-opløsning på en ren engangsglasrutschebane.
- Spred BM-udstrygningerne til ensartet tykkelse med skarpe haler ved hurtigt at fjerne BM'en. Tør derefter naturligt.
- Dæk BM-filmene med 1 ml Wright-Giemsa-opløsning i ca. 10 s ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1 ml fosfatbuffer til diasene.
BEMÆRK: Pas på at forhindre, at farvestofopløsningen tørrer eller flyder af diasene. - Bland farvestofopløsningen forsigtigt og hold den i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl diasene med rent vand og tør dem i luft ved stuetemperatur.
- Brug fremadrettet lysmikroskopi til at detektere ondartede pc'er. Pc'erne skal være godt spredt.
2. FISH-forbehandling af BM-udstrygningerne
- Dæk det hybridiserede område med fikseringsopløsning i 10 minutter for at misfarve og rette pc'erne.
- For at fremstille frisk fikserende opløsning blandes methanol med iseddike i et volumenforhold på 3:1.
- Skyl glideren med deioniseret vand (dH2O) og tør det i luft ved stuetemperatur.
- Forvarm en krukke indeholdende 2x SSC-buffer til 56 °C i et vandbad. Fortynd bufferen frisk til 20x SSC inden brug.
- For at forberede 20x SSC blandes grundigt 176 g natriumchlorid og 88 g natriumcitrat med 800 ml dH2O. Mål pH og juster til pH 5,3 ± 0,2. Tilsæt derefter dH2O for at bringe det endelige volumen til 1 L.
- Vask den tilberedte BM-udstrygning i den forvarmede 2x SSC-buffer i 10 minutter, efterfulgt af at dyppe den i deioniseret vand ved stuetemperatur.
- Dehydrer udstrygningen i en ethanolgradient (70%, 85% og 100% ethanol, hver i 1 min). Lufttør udstrygningen i 10 min.
3. BM smør FISK og vask
BEMÆRK: Alle trin blev udført i et mørkt rum for at forhindre fluorescensslukning.
- Tilsæt TP53 / centromer af kromosom 17 (CEP17) sondeblanding til hybridiseringsområdet og dæk det med et dækslip. Tryk forsigtigt med en fin spids pincet for at fjerne luftbobler nedenunder.
- Forsegl alle sider af dæksedlen med gummicement for at sikre god tæthed.
- Efter størkning af gummicementen skal du placere glideren på en automatisk FISH-maskine. Udfør denaturering ved 78 °C i 5 minutter efterfulgt af hybridisering ved 37 °C natten over.
- Tag rutsjebanen op fra FISH-maskinen. Brug en finspids pincet til forsigtigt at fjerne gummicementen.
- Sænk rutsjebanen i 2x SSC ved stuetemperatur i ca. 1 eller 2 minutter for at vaske dækselslipsen af.
- Vask rutsjebanen i 68 °C forvarmet 0,4x SSC/0,3 % NP-40 buffer i et vandbad i 2 min.
- Der fremstilles 0,4x SSC/0,3 % NP-40-opløsning ved grundig blanding af 20 ml 20x SSC (pH 5,3) med 950 ml dH2O. Derefter tilsættes 3 ml NP-40 og blandes grundigt, indtil det er helt opløst. Mål pH og juster til 7,0-7,5 med NaOH. Tilsæt derefter dH2O for at bringe det endelige volumen af den samlede opløsning til 1 L.
- Vask rutsjebanerne med 2x SSC i et 37 °C vandbad i 1 min. Sæt oprejst i mørket for at tørre grundigt i 10 min.
- Tilsæt 10 μL DAPI til det hybridiserede område og dæk med en dækseddel.
4. FISH-analyse og billeddannelse
- Se det hybridiserede dias ved hjælp af et passende filtersæt på et fluorescensmikroskop.
- Brug et monokromatisk blåt fluorofor optisk filter til at observere fluorescensintensiteten af cellekernen. Tag cellekernebilleder under et DAPI-filtersæt.
- Brug en kromosomcentromoersonde til at vise, hvor mange kromosomer en celle indeholder. Mærk CEP17 med grøn fluorescens. Brug et spektrumgrønt fluorofor optisk filter til at observere placeringen af CEP17. Tag et CEP17-signalbillede under det grønne filtersæt.
- Mærk TP53-genet med orange fluorescens. Brug et spektrum orange fluorofor optisk filter til at observere TP53. Tag et TP53-signalbillede under dette sæt.
- Flet disse tre billeder og undersøg dem for numeriske abnormiteter.
BEMÆRK: I en normal interfasecelle observeres to orange og to grønne signaler inde i en kerne med blå fluorescens, hvilket indikerer et par normale kromosom 17 (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den indledende morfologiske vurdering af en nydiagnosticeret MM-patient viste det sig, at 15% af pc'erne i en BM-udstrygning havde større og mørkere kerner sammen med større mængder cytoplasma end normale pc'er (figur 2A). Det første rør af heparin anti-koaguleret BM detekteret af immunophenotype teknikken afslørede kun 2,3% af de monoklonale afvigende pc'er. CD138 immunomagnetisk perlesortering i kombination med FISH eller cIg-FISH teknikken er afgørende for at opnå et nøjagtigt FISH resultat. Aspireret BM er dog begrænset, hvis det er en tør hane. BM smears blev brugt til at teste interfase FISH. En repræsentativ binukleeret pc i BM-film blev lokaliseret af et fluorescensmikroskoptrin Vernier-tykkelse (figur 2B). FISH blev påført BM-udstrygningerne for at teste for TP53 og CEP17. FISH-resultaterne viste fire orange og fire grønne signaler i en interfase PC-kerne (figur 2C), hvilket tyder på, at fire kopier af kromosom 17 var lokaliseret i metafasen PC-kerner. Karyotyping resultater blev opnået ved at forlænge kulturtiden op til 3 dage og yderligere analyseret ved hjælp af FISH analytisk software (figur 2D). Nøjagtigheden af interfase FISH-resultaterne på BM-udstrygningerne blev yderligere verificeret.
Figur 1: Normale signaler fra TP53/CEP17 FISH-sonden for interfaseceller (1000x). Fluorescensintensiteten af cellekernen var blå, TP53 var orange, og CEP17 var grøn. I disse 3 normale interfaseceller optrådte både to orange og to grønne signaler inde i den blåfluorescerende kerne, hvilket indikerer to par af det normale kromosom 17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologi og genetiske billeder af knoglemarv (BM) hos patienter med myelomatose (MM). (A) Myelomceller med grupperet fordeling angivet med pilene (
) efter Wright-Giemsa-farvning af BM-udstrygningen (1000×). (B) Binukleatplasmacytoidceller angivet med pile (
) på et gråtonebillede taget af et sort-hvidt kamera på et fluorescensmikroskop (1000×). (C) TP53 / centromer af kromosom 17 (CEP17) fluorescens in situ hybridisering (FISH) sonde test for BM smear. FISH afslører fire TP53 - og fire CEP17-signaler i hver kerne (→) (1000×). (D) Unormalt kromosomkaryogram viser to par kromosom 17 i en kerne (
). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af FISH til genetisk risikostratificering i MM er afgørende. Den kritiske del af FISH-rapporter er ikke alle nukleerede celler, men klonale pc'er, der specifikt er renset eller identificeret ved sortering med anti-CD138 magnetiske perler eller mærkning med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ eller λ. Interfase FISH efter PC-sortering eller cIg-FISH viste sig at være signifikant ved diagnosen MM på grund af den relativt lavere andel af pc'er i BM. Disse metoder har dog nogle mangler, herunder komplekse processer, høje prøvekrav og høje eksperimentelle omkostninger. Halvtreds pc'er kan hurtigt lokaliseres af en mikroskop-fase Vernier-tykkelse. BM-udstrygninger er meget lettere at opnå end antikoagulerende BM-prøver, fordi opnåelse af antikoaguleret BM kræver komplekse procedurer for at opnå kernen. Derfor etablerede vi en overbevisende metode til BM smear FISH til påvisning af MM-celler.
For det første skal BM-udstrygninger foretages af en erfaren morfologisk analytiker. For at sprede BM'en i udtværinger placeres sprederen foran aspiraten i en vinkel på 30°-45° og trækkes tilbage for at komme i kontakt med væsken11. Derefter bevæges sprederen ensartet fremad i en jævn bevægelse. BM-udstrygningens massevished skal skræddersys, så længden er ca. tre fjerdedele af diaset12. BM-filmen skal være smallere end diaset for at sikre, at celler på alle kanter kan detekteres13. Udvælgelsen af hybridiseringsområdet og lokaliseringen af pc'er var kritisk i vores protokol, og det kræver en erfaren morfologisk analytiker. For BM-udstrygninger, der indeholder færre pc'er, skal pc'erne lokaliseres ved hjælp af et fremadrettet fluorescensmikroskop olienedsænkningsmål og Vernier-kalibre på det objektive stadium, og deres billeder kan tages ved monokrome skud. Hvis pc'erne f.eks. kun tegnede sig for 3 % af de samlede nukleerede celler i en BM-film ved morfologisk undersøgelse, bør et godt dispergeret hybridområde på 8 mm x 8 mm indeholde mindst 50 pc'er til en FISH-test. Efter FISH-hybridisering skal fluorescenssignaler i mindst 50 pc'er tælles af en erfaren analytiker14.
En begrænsning af denne teknik er imidlertid kravet om friske BM-udstrygninger. Hvis BM-udstrygningerne opbevares i over 2 år, kan de resulterende FISH-billeder være uklare, hvilket resulterer i fejlfortolkning.
Samlet set kan ovennævnte BM smear FISH i vid udstrækning anvendes til patienter med hæmatologiske maligniteter, når BM-ekstraktion er vanskelig, eller BM tør tap forekommer, selv i hypoproliferative sygdomme med færre nukleerede celler. Vi håber, at flere patienter med hæmatologiske maligniteter kan få gavn af denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af innovationsfonden for WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
