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Biology

माइक्रोस्कोपी-आधारित परख अध्ययन और SNARE तस्करी का उपयोग कर रीसाइक्लिंग एंडोसोम का विश्लेषण करने के लिए

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/63087
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Cell Biology, Indian Institute of Science, Bangalore KA 560012, India

Summary

रीसाइक्लिंग एंडोसोम एंडोसोम एंडोसोमल ट्यूबलर नेटवर्क का हिस्सा हैं। यहां हम एक ऑर्गेनेल मार्कर के रूप में जीएफपी-एसटीएक्स 13 का उपयोग करके रीसाइक्लिंग एंडोसोम की गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

रीसाइक्लिंग एंडोसोम (आरई) ट्यूबलर-वेसिकुलर ऑर्गेनेल हैं जो सभी सेल प्रकारों में शुरुआती / सॉर्टिंग एंडोसोम से उत्पन्न होते हैं। ये ऑर्गेनेल मेलानोसोम के बायोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो मेलानोसाइट्स द्वारा उत्पादित एक लाइसोसोम से संबंधित ऑर्गेनेल है। आरई मेलानोसाइट-विशिष्ट कार्गो को उनके गठन के दौरान समय से पहले मेलानोसोम तक पहुंचाते हैं। आरई की पीढ़ी में रुकावट, हरमांस्की-पुडलक सिंड्रोम के कई उत्परिवर्ती में मनाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप त्वचा, बाल और आंखों का हाइपोपिग्मेंटेशन होता है। इसलिए, आरई की गतिशीलता (संख्या और लंबाई को देखें) का अध्ययन सामान्य और बीमारी की स्थिति में इन ऑर्गेनेल के कार्य को समझने के लिए उपयोगी है। इस अध्ययन में, हम एक निवासी SNARE STX13 का उपयोग कर आरई गतिशीलता को मापने का लक्ष्य रखते हैं।

Introduction

मेलेनिन पिगमेंट का जैवसंश्लेषण मेलानोसोम में होता है, एक मेलानोसाइट-विशिष्ट लाइसोसोम से संबंधित ऑर्गेनेल (एलआरओ) जो पारंपरिक लाइसोसोम के साथ सह-अस्तित्व में है। एंडोसाइटिक प्रणाली मेलानोसोम के बायोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जो त्वचा के रंग और आयनीकरण विकिरण 1,2,3 के खिलाफ फोटोप्रोटेक्शन के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया के दौरान, मेलेनिन संश्लेषण एंजाइमों को शुरुआती / सॉर्टिंग एंडोसोम पर क्रमबद्ध किया जाता है और फिर ट्यूबलर या वेसिकुलर एंडोसोम के माध्यम से समय से पहले मेलानोसोम में ले जाया जाता है जिसे रीसाइक्लिंग एंडोसोम (आरई) 4,5,6,7,8,9,10 कहा जाता है। इन ऑर्गेनेल का लक्ष्यीकरण और संलयन पूरी तरह से कार्यात्मक पिगमेंटेड मेलानोसोम 7,11,12,13,14 की परिपक्वता को विनियमित करता है। इन ऑर्गेनेल के गठन में दोष या इन ऑर्गेनेल के लिए कार्गो सॉर्टिंग ओकुलोक्यूटेनियस एल्बिनिज़म और अन्य नैदानिक फेनोटाइप का कारण बनता है, जो हर्मांस्की-पुडलक सिंड्रोम 15,16 में मनाया जाता है।

यहां हम आरई का अध्ययन और विश्लेषण करने के लिए एक सरल माइक्रोस्कोपी-आधारित तकनीक का वर्णन करते हैं। इस विधि में, हमने एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 का लाभ उठाया है जो एंडोसोम 17 को रीसाइक्लिंग करने और मेलानोसाइट्स 12,18 में एंडोसोम और मेलानोसोम को सॉर्ट करने के बीच चक्रों पर रहता है। इसके अलावा, एन-टर्मिनल असंरचित नियामक डोमेन (अर्थात् SynN या STX13Π129) को हटाने से SNARE को मेलानोसोम में फंसने की अनुमति मिलती है, जो मेलानोसोम 12 की ओर आगे तस्करी मार्ग को मापता है। हमने अपने अध्ययन 14,19 में एक ज्ञात रीसाइक्लिंग एंडोसोमल मार्कर Rab GTPase (Rab)11 का उपयोग किया है। प्रोटीन GFP-STX13WT, GFP-STX13Π129, mCherry-Rab11, और TYRP1 जंगली प्रकार मेलानोसाइट्स में उनके सापेक्ष स्थानीयकरण के परिमाणीकरण के बाद की प्रतिदीप्ति इमेजिंग मेलानोसोम के लिए उनके लक्ष्यीकरण के अलावा आरई की प्रकृति और गतिशीलता प्रदान करेगी। इस प्रकार, यह एक सरल तकनीक है जिसका उपयोग मेलानोसाइट्स में आरई की गतिशीलता को देखने और मापने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल में मेलानोसाइट्स की सीडिंग शामिल है जिसके बाद प्लास्मिड का अभिकर्मक होता है। आगे के चरणों में आरई की लंबाई और संख्या को मापने के लिए कोशिकाओं का निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग, इमेजिंग और विश्लेषण शामिल है। प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण नीचे दिया गया है।

1. पूर्व इलाज coverslips पर माउस मेलानोसाइट्स के सीडिंग

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम (पूर्ण RPMI माध्यम में 1: 20: RPMI + 10% गर्मी निष्क्रिय FBS + 1x Glutamine + 1x एंटीबायोटिक मिश्रण) के साथ एक पेट्री डिश (यानी, 35 मिमी डिश में 4 - 5) में ग्लास कवरलिप्स कोट करें और इसे 15 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति हुड में सुखाएं। उपयोग करने से पहले 1x PBS के साथ एक बार coverslips धो लें।
  2. जंगली प्रकार के माउस मेलानोसाइट्स (C57BL / 6J से मेलान-इंक 4 ए-आर्फ -1, ए / ए, इंक 4 ए-आर्फ-/ - चूहों, 20 में वर्णित और वेलकम ट्रस्ट फंक्शनल जीनोमिक्स सेल बैंक में उपलब्ध) को एक पेट्री डिश (यानी, 35 या 60 मिमी डिश) में बनाए रखें, जो पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के साथ पूरक है।
    1. 1x PBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और ट्रिप्सिनाइज़िंग कोशिकाओं के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) समाधान के 0.5 या 1 मिलीलीटर जोड़ें। पेट्री डिश से टुकड़ी के लिए 2 - 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. पूर्ण RPMI माध्यम के 1 - 2 mL जोड़ें, निलंबित करें और फिर कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए 376 एक्स जी और फिर 1x पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. centrifugation चरण को दोहराएं और पूर्ण RPMI माध्यम के 1 mL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  5. तहखाने झिल्ली मध्यम लेपित coverslips पर कोशिकाओं बीज 50-60% confluency पर (लगभग 6 x 105 कोशिकाओं पर एक 35 मिमी सेल संस्कृति पकवान पर 4 - 5 coverslips युक्त). हमेशा PMA के 200 nM जोड़ें (पूर्ण RPMI माध्यम में मढ़वाया सेल निलंबन के लिए काम स्टॉक 40 μM phorbol 12-myristate 13-एसीटेट के 5 μL जोड़ें)।
  6. सीडिंग के बाद, प्लेट को 12-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. STX13 plasmids के साथ कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. निम्नलिखित अभिकर्मकों का उपयोग करें: pEGFP-C1-STX13WT और pEGFP-C1-STX13Π129 (12 में वर्णित)। mCherry-Rab11, Graça Raposo, Institute Curie, पेरिस (संदर्भ 19 में वर्णित) से एक तरह का उपहार था। ATCC (TA99) से एंटी-TYRP1 एंटीबॉडी।
  2. सीडिंग के 12 - 24 घंटे के बाद, लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके प्लास्मिड के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें। एक 35 मिमी डिश के लिए, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में OPTI-MEM माध्यम के 250 μL में अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μL लें और OPTI-MEM के 250 μL में प्रत्येक प्लास्मिड के लगभग 200 ng लें।
  3. डीएनए युक्त ट्यूबों और अभिकर्मक अभिकर्मक को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। दोहराए गए पिपेटिंग के बिना मिश्रण करें (कुल मात्रा लगभग 500 μL होगी)। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए हर 10 मिनट में ट्यूब के हाथ दोहन प्रदर्शन।
  4. इनक्यूबेशन के दौरान, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धोएं, एक बार OPTI-MEM के साथ और फिर कोशिकाओं में OPTI-MEM का 1 mL जोड़ें।
  5. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, पकवान को कवर करके ड्रॉपवाइज तरीके से कोशिकाओं में अभिकर्मक अभिकर्मक-डीएनए मिश्रण जोड़ें।
  6. 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ OPTI-MEM माध्यम aspirate और पीएमए के 200 nM के साथ पूरक पूर्ण RPMI माध्यम जोड़ें।
  7. कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. कोशिकाओं का निर्धारण

नोट:: निम्न प्रक्रिया ऊतक संस्कृति हुड के बाहर किया जाता है।

  1. अभिकर्मक के 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धोएं और फिर 30 मिनट के लिए 3% फॉर्मेल्डिहाइड (1x PBS में ताजा तैयार) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. फिक्सेशन के बाद, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धोएं और आगे के उपयोग तक 1x PBS में कवरलिप्स स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को कांच की स्लाइड्स पर रखा जा सकता है (नीचे देखें) या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. कोशिकाओं के immunostaining

  1. एक आर्द्र कक्ष तैयार करें: एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किए गए पेट्री डिश में नम फिल्टर पेपर पर पैराफिन फिल्म कट टुकड़ा रखें।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 25 μL तैयार करें (1x PBS में 0.2% saponin, 1x PBS में 0.1% BSA और 1x PBS में 0.02% सोडियम azide)। 1:200 के कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी जोड़ें। आर्द्र कक्ष में एक पैराफिन फिल्म पर एक बूंद के रूप में इस समाधान जोड़ें।
  3. संदंश के साथ कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक उठाएं, इसे प्राथमिक एंटीबॉडी स्टेनिंग समाधान की इस बूंद पर उलटें और फिर आर्द्र कक्ष के ढक्कन को कवर करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. इसी तरह, 1: 500 के कमजोर पड़ने पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें और इसे आर्द्र कक्ष में कवरस्लिप के बगल में पैराफिन फिल्म पर रखें। नाभिक को धुंधला करने के लिए, समाधान में DAPI (1:20,000 से 1:30,000) जोड़ें।
  5. संदंश का उपयोग करके, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान से कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक उठाएं और इसे 1x पीबीएस (एक ग्लास बीकर में) में तीन बार डुबोएं।
  6. कवरस्लिप पर अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए टिशू पेपर पर कवरस्लिप पर टैप करें। इसे आर्द्र कक्ष में द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला समाधान पर रखें और समाधान में फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एंटीबॉडी की उपस्थिति के कारण इसे प्रकाश में उजागर न करें।
  7. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कवरस्लिप को फिर से इनक्यूबेट करें। कृपया हमेशा कवरस्लिप के किनारे पर एक नोट रखें जिसमें इन चरणों में कोशिकाएं हैं।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान से कवरस्लिप को ध्यान से उठाएं और फिर इसे 1x PBS में तीन बार डुबोएं। इसके अलावा, कवरस्लिप पर अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए टिशू पेपर पर कवरस्लिप टैप करें।
  9. एक ग्लास स्लाइड पर फ्लोरोमाउंट-जी बढ़ते अभिकर्मक के 12 μL रखें और बढ़ते अभिकर्मक पर सना हुआ कवरस्लिप (कांच की ओर सामना करना पड़ रहा है) को ध्यान से रखें। टिशू पेपर पर ग्लास स्लाइड को उलटें और फिर धीरे से दबाएं।

5. कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. ब्राइट-फील्ड (बीएफ) और प्रतिदीप्ति (आईएफ) फिल्टर के तहत दाग कोशिकाओं को 60x (तेल) एपोक्रोमैटिक उद्देश्य या एक समान कॉन्फ़िगरेशन के साथ किसी अन्य माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीसीडी कैमरे से सुसज्जित एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि दें।

6. आरई स्थानीयकृत प्रोटीन और melanosomes के बीच ओवरलैप का परिमाणीकरण:

नोट: फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन के बीच मैंडर के ओवरलैप गुणांक के परिमाणीकरण के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन किया जाता है (लिंक से स्वतंत्र रूप से डाउनलोड करने योग्य: https://imagej.net/software/fiji/)। एकाधिक चैनलों के साथ TIFF छवि का उपयोग करें।

  1. कच्ची छवि खोलें। छवि विकल्प पर जाएँ, रंग | का चयन करें चैनलों को विभाजित करें, और विश्लेषण के लिए दो चैनलों का उपयोग करें।
  2. प्लगइन विकल्प में JACoP प्लगइन खोलें।
  3. दोनों चैनलों के लिए दहलीज सेट करें जैसे कि सभी उज्ज्वल धब्बे चुने जाते हैं और पृष्ठभूमि समाप्त हो जाती है।
  4. विश्लेषण विकल्प पर जाएं, मैंडर के ओवरलैप गुणांक प्राप्त करने के लिए M1 और M2 गुणांक का चयन करें।
  5. JACoP प्लगइन में विश्लेषण विकल्प दबाएँ और मैंडर के ओवरलैप गुणांक को प्रदर्शित करता है जो परिणाम देखें।

7. रीसाइक्लिंग एंडोसोम 'ट्यूबलर संख्या और लंबाई का परिमाणीकरण:

नोट:: फ़िजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर नलिकाओं की संख्या और लंबाई के परिमाणीकरण के लिए निम्न चरणों का पालन किया जाता है।

  1. कच्ची छवि खोलें छवि पर जाएँ विकल्प पर जाएँ, रंग | का चयन करें चैनलों को विभाजित करें और विश्लेषण के लिए वांछित चैनल का उपयोग करें।
  2. छवि पर फिर से जाएँ, प्रकार | का चयन करें 8-बिट छवि में कनवर्ट करें.
  3. फिर प्लगइन्स पर जाएं, विश्लेषण | का चयन करें ट्यूबनेस । 0.1075 पर सिग्मा मान सेट करें। ठीक दबाएँ.
  4. छवि पर फिर से जाएँ, प्रकार | का चयन करें 8 बिट छवि में कनवर्ट करें.
  5. छवि | पर जाएँ | समायोजित करें थ्रेशोल्ड (सभी छवियों के लिए एक ही थ्रेशोल्ड मानों का उपयोग करें। छवियों में लगभग समान तीव्रता होनी चाहिए)।
  6. प्रक्रिया | पर जाएँ द्विआधारी | मुखौटा में कनवर्ट करें.
  7. प्रक्रिया पर जाएँ, बाइनरी का चयन करें और फिर Skeletonize का चयन करें।
  8. विश्लेषण करने के लिए जाओ, कंकाल का चयन करें और कंकाल का विश्लेषण करें चुनें। परिणाम और आउटपुट में | का चयन करें (a) सबसे बड़े सबसे छोटे पथ की गणना करें | (b) विस्तृत जानकारी दिखाएं | (c) लेबल कंकाल प्रदर्शित करें। ठीक दबाएँ.
    नोट:: परिणाम सारणीबद्ध स्वरूप में खुल जाएगा। औसत शाखा लंबाई का स्तंभ चयनित सेल में सभी विभिन्न नलिकाओं की लंबाई दिखाता है (माइक्रोमीटर में मान प्राप्त करने के लिए स्केल सेट करें)।
  9. सेल में नलिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण पर जाएं, और कण विकल्प का विश्लेषण करें का चयन करें। ठीक दबाएँ.
    नोट:: प्राप्त परिणामों में, गणना स्तंभ उस विशेष कक्ष में नलिकाओं की संख्या दिखाता है।
  10. डेटा सहेजें और विश्लेषण करें।

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Representative Results

MELANOSOMES के लिए STX13Π129 उत्परिवर्ती स्थानीयकरण का परिमाणीकरण
माउस जंगली प्रकार मेलानोसाइट्स में STX13 के Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी GFP-STX13WT vesicular और ट्यूबलर संरचनाओं और GFP-STX13Π129 सेल सतह के अलावा अंगूठी जैसी संरचनाओं के रूप में स्थानीयकृत (चित्रा 1A) के रूप में स्थानीयकृत दिखाया गया। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर रिंग-जैसे GFP-STX13Π129 ने मेलानोसोम प्रोटीन TYRP1 (चित्रा 1A) और उज्ज्वल-क्षेत्र इमेज्ड मेलानोसोम (डेटा नहीं दिखाया गया है) 12 के साथ सह-स्थानीयकरण दिखाया। जैसा कि पहले दिखाया गया है, अतिरंजित GFP-STX13WT का एक समूह melanosomes12 में मनाया जाता है। GFP-STX13WT और GFP-STX13Π129 के सापेक्ष स्थानीयकरण को मापने के लिए मेलानोसोम के लिए, हमने फिजी का उपयोग किया है और JACoP प्लगइन के साथ विश्लेषण किया है। TYRP1 के साथ GFP-STX13Π129 के बीच मापा गया मैंडर का ओवरलैप गुणांक (MOC) TYRP1 (चित्रा 1B) के साथ GFP-STX13WT की तुलना में लगभग 1.5 गुना अधिक है। दिलचस्प बात यह है कि TYRP1 ने GFP-STX13WT (चित्रा 1B) की तुलना में GFP-STX13Π129 के साथ 2.9 गुना अधिक MOC मान दिखाए। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि मेलानोसोम के लिए GFP-STX13Π129 का स्थानीयकरण एक स्थिर स्थिति में GFP-STX13WT की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक है।

रीसाइक्लिंग एंडोसोम के लिए STX13WT स्थानीयकरण का परिमाणीकरण
GFP-STX13WT की Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी ने ज्ञात रीसाइक्लिंग एंडोसोमल प्रोटीन Rab11 (mCherry-Rab11 के रूप में व्यक्त) (चित्रा 2A, B) के साथ सह-स्थानीयकरण दिखाया। MCherry-Rab11 के साथ GFP-STX13WT के बीच मापा गया MOC GFP-STX13WT (चित्रा 2B) के साथ mCherry-Rab11 की तुलना में लगभग 1.4 गुना अधिक है। GFP-STX13WT-positive endosomal नलिकाओं की संख्या और लंबाई को मापने के लिए, हमने प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया है। mCherry-Rab11 प्रयोगों में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है (चित्रा 2)। GFP-STX13WT के साथ संक्रमित मेलानोसाइट्स ने mCherry-Rab11 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में प्रति सेल नलिकाओं की एक उच्च संख्या दिखाई (चित्रा 2 C शीर्ष ग्राफ, बार बी के साथ बार ए की तुलना करें)। हालांकि, नलिका संख्याओं को कोशिकाओं में GFP-STX13WT और mCherry-Rab11 की सह-अभिव्यक्ति पर कम कर दिया जाता है (चित्रा 2C शीर्ष ग्राफ, सी के साथ बार ए की तुलना करें, और डी के साथ बार बी)। दिलचस्प बात यह है कि GFP-STX13WT और mCherry-Rab11 दोनों के लिए औसत नलिका लंबाई (μm) व्यक्तिगत रूप से या एक साथ व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में एक-दूसरे के लिए तुलनीय है (चित्रा 2 C नीचे ग्राफ)। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि GFP-STX13WT REs को Rab11 के समान स्थानीयकृत करता है।

Figure 1
चित्र 1: जंगली प्रकार के मेलानोसाइट्स में मेलानोसोम के लिए GFP-STX13WT और GFP-STX13Π129 का स्थानीयकरण। (A) मेलान-इंक4a-Arf-1 मेलानोसाइट्स को GFP-STX13WT और GFP-STX13Π129 से संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को तय किया गया था, एंटी-टायरपी 1 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था और फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था। इनसेट सफेद बॉक्स वाले क्षेत्रों के आवर्धित दृश्य हैं। तीर GFP-STX13WTto REs और GFP-STX13Π129 के स्थानीयकरण को मेलानोसोम के लिए इंगित करते हैं। स्केल सलाखों, 10 μm. (ख) एसटीएक्स13 और टायरपी1 के बीच सहस्थानीयकरण का परिमाणीकरण। GFP-STX13WT या GFP-STX13Π129 के बीच TYRP1 के साथ मैंडर के ओवरलैप गुणांक (M) को अलग-अलग दर्शाया गया है (मतलब ± S.E.M.) प्लॉट में अलग से। N = 3. * पी ≤0.05 और **** पी ≤0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जंगली प्रकार के मेलानोसाइट्स में एंडोसोम को रीसाइक्लिंग करने के लिए GFP-STX13WT का स्थानीयकरण। (A) Melan-Ink4a-Arf-1 मेलानोसाइट्स GFP-STX13WT और mCherry-Rab11 के साथ transfected थे। कोशिकाओं को तय किया गया था और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था। इनसेट सफेद बॉक्स वाले क्षेत्रों के आवर्धित दृश्य हैं। तीर GFP-STX13WT के स्थानीयकरण को mCherry-Rab11-positive compartments के लिए इंगित करते हैं। स्केल सलाखों, 10 μm. (बी) एसटीएक्स 13 और आरएबी 11 के बीच सह-स्थानीयकरण का परिमाणीकरण। MCherry-Rab11 के साथ GFP-STX13WT के बीच मैंडर का ओवरलैप गुणांक (M) और इसके विपरीत प्लॉट में अलग-अलग (S.E.M.) ± मतलब) का प्रतिनिधित्व किया जाता है। N = 3. पी ≤0.001. C. STX13- या Rab11-positive REs की संख्या और लंबाई (μm में) का परिमाणीकरण। GFP-STX13WT और mCherry-Rab11 की नलिकाओं /सेल और औसत नलिका लंबाई की औसत संख्या को प्लॉट में अलग-अलग दर्शाया गया है (मतलब ± S.E.M.) अलग-अलग। N = 3. ध्यान दें कि कोशिकाओं को GFP-STX13WT और mCherry-Rab11 (C) और (D) में transfected कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रीसाइक्लिंग एंडोसोम एंडोसाइटिक ऑर्गेनेल का एक समूह है, और वे सभी सेल प्रकारों 21,22,23,24,25 में सेल की सतह पर कार्गो के रीसाइक्लिंग की मध्यस्थता करते हैं। मेलेनोसाइट्स जैसे विशेष सेल प्रकारों में, ये ऑर्गेनेल आंशिक रूप से अपने बायोजेनेसिस 3,16,26 के लिए मेलानोसोम की ओर अपने तस्करी मार्ग को मोड़ते हैं। इसके अलावा, आरई को शुरुआती / सॉर्टिंग एंडोसोम पर पोस्ट कार्गो सॉर्टिंग उत्पन्न किया जाता है और रूपात्मक रूप से ट्यूबलर-वेसिकुलर संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं। उनकी गतिशीलता (संख्या और लंबाई) कई सेलुलर कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें मोटर प्रोटीन 21,22,23,24,25,27,28 शामिल हैं। कुछ अध्ययनों ने मेलानोसाइट्स 14,19 में आरई को लेबल करने के लिए एक मार्कर के रूप में Rab11 का उपयोग किया। जबकि गैर-मेलानोसाइट्स में, STX13 और KIF13A का उपयोग Rab11 के अलावा REs13,17,19 की कल्पना और विशेषता के लिए किया गया है। इस अध्ययन में, हमने एसटीएक्स 13 का उपयोग मेलानोसाइट्स में आरई को लेबल करने के लिए एक मार्कर के रूप में किया है, जिसके बाद Rab11-positive नलिकाओं (चित्रा 2) के साथ तुलना की गई है। दिलचस्प बात यह है कि STX13 (GFP-STX13Π129) में N-टर्मिनल विलोपन के परिणामस्वरूप MELANOSOMES (चित्रा 1) के लिए SNARE का गलत स्थानीयकरण होता है। इस प्रकार, मेलानोसाइट्स में GFP-STX13WT और GFP-STX13Π129 का स्थानीयकरण क्रमशः आरई और मेलानोसोम की कल्पना करता है। इन प्रोटीनों का उपयोग स्थिर-राज्य स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए संबंधित ऑर्गेनेल मार्करों के रूप में किया जा सकता है।

अध्ययनों से पता चला है कि कई प्रोटीन जैसे TYRP1, TYR (tyrosinase), VAMP7, OCA2, Rab32/38 अन्य इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 3,29 के अलावा मेलानोसोम के लिए स्थानीयकरण करते हैं। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि एन-टर्मिनल ने एसटीएक्स 13 उत्परिवर्ती (जीएफपी-एसटीएक्स 13 Π129) को नष्ट कर दिया है, जो मेलानोसोम और प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीयकृत है। हम परिकल्पना करते हैं कि GFP-STX13Π129 संभवतः एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि आरई से सेल सतह और एलआरओ तक तस्करी का अध्ययन किया जा सके। इसके विपरीत, GFP-STX13WT REs को Rab11 के समान स्थानीयकृत करता है। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि GFP-STX13WT का उपयोग मेलानोसाइट्स में आरई को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है। हम भविष्यवाणी करते हैं कि GFP-STX13WT Rab11 की तुलना में एक बेहतर आरई मार्कर हो सकता है क्योंकि Rab11 overexpression endosomal dynamics को बदल देता है। कुल मिलाकर, GFP-STX13WT स्थिर-राज्य स्थिति में उनकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक संभावित आरई मार्कर के रूप में कार्य करता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था (BT/ PR32489/ BRB/10/1786/2019 को SRGS के लिए); विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (CRG / 2019 / 000281 SRGS के लिए); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 से SRGS) और IISc-DBT साझेदारी कार्यक्रम (SRGS के लिए)। विभाग में बुनियादी ढांचे को DST-FIST, DBT और UGC द्वारा समर्थित किया गया था। एएमबी को डीबीटी-जेआरएफ (डीबीटी / 2015 / आईआईएससी / एनजे -02) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99) ATCC HB-8704
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific 11668-500
Matrigel matrix BD Biosciences 356231
OPTI-MEM ThermoFisher Scientific 022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
RPMI Medium 1640 ThermoFisher Scientific 31800-022

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dell'Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
  2. Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
  3. Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).
  4. Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
  5. Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
  6. Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
  7. Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
  8. Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
  9. Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
  10. Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
  11. Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
  12. Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
  13. Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).
  14. Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).
  15. Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
  16. Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
  17. Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
  18. Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
  19. Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
  20. Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
  21. Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
  22. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  23. Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
  24. Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
  25. Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
  26. Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
  27. Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
  28. Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
  29. Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).

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जीव विज्ञान अंक 180
माइक्रोस्कोपी-आधारित परख अध्ययन और SNARE तस्करी का उपयोग कर रीसाइक्लिंग एंडोसोम का विश्लेषण करने के लिए
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Bhatt, A. M., Setty, S. R. G. The… More

Bhatt, A. M., Setty, S. R. G. The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking. J. Vis. Exp. (180), e63087, doi:10.3791/63087 (2022).

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