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Biochemistry

प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न मानव हृदय ऑर्गेनोइड्स को स्व-असेंबलिंग उत्पन्न करना

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/63097
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

Summary

यहां, हम स्व-संगठन द्वारा मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का कुशलतापूर्वक उपयोग करके विकासात्मक रूप से प्रासंगिक मानव हृदय ऑर्गेनोइड्स (एचएचओ) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल विकासात्मक संकेतों के अनुक्रमिक सक्रियण पर निर्भर करता है और अत्यधिक जटिल, कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक मानव हृदय ऊतकों का उत्पादन करता है।

Abstract

स्वास्थ्य और बीमारी में मानव हृदय विकास का अध्ययन करने की क्षमता विट्रो में मानव हृदय की जटिलता को मॉडल करने की क्षमता से अत्यधिक सीमित है। अधिक कुशल अंग-जैसे प्लेटफ़ॉर्म विकसित करना जो विवो फेनोटाइप में जटिल मॉडल कर सकते हैं, जैसे कि ऑर्गेनोइड्स और अंग-ऑन-ए-चिप, मानव हृदय विकास और बीमारी का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ाएगा। यह पेपर मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके आत्म-संगठन द्वारा अत्यधिक जटिल मानव हृदय ऑर्गेनोइड्स (एचएचओ) उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करके चरणबद्ध विकास पथ सक्रियण करता है। Embryoid निकायों (EBs) गोल नीचे, अल्ट्रा-कम अनुलग्नक कुओं के साथ एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में उत्पन्न होते हैं, जो व्यक्तिगत निर्माणों की निलंबन संस्कृति की सुविधा प्रदान करते हैं।

ईबी एक तीन-चरणीय WNT सिग्नलिंग मॉडुलन रणनीति द्वारा hHOs में भेदभाव से गुजरते हैं, जिसमें कार्डियक मेसोडर्म भाग्य को प्रेरित करने के लिए एक प्रारंभिक WNT मार्ग सक्रियण शामिल है, निश्चित कार्डियक वंशावली बनाने के लिए WNT निषेध का एक दूसरा चरण, और प्रोएपिकार्डियल अंग ऊतकों को प्रेरित करने के लिए एक तीसरा WNT सक्रियण चरण। ये चरण, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में किए गए, अत्यधिक कुशल, पुन: प्रस्तुत करने योग्य हैं, और प्रति रन बड़ी मात्रा में ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन करते हैं। विभेदन के दिन 3 से दिन 11 तक इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा विश्लेषण से पता चलता है कि दिन 15 में एचएचओ के अंदर पहले और दूसरे दिल के क्षेत्र विनिर्देशों और अत्यधिक जटिल ऊतकों का पता चलता है, जिसमें एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के क्षेत्रों के साथ मायोकार्डियल ऊतक शामिल हैं, साथ ही एंडोकार्डियल ऊतक के साथ पंक्तिबद्ध आंतरिक कक्ष भी शामिल हैं। ऑर्गेनोइड्स भी संरचना भर में एक जटिल संवहनी नेटवर्क और एपिकार्डियल ऊतक के बाहरी अस्तर को प्रदर्शित करते हैं। एक कार्यात्मक दृष्टिकोण से, एचएचओ ने मजबूत रूप से हराया और सामान्य कैल्शियम गतिविधि को प्रस्तुत किया जैसा कि फ्लूओ -4 लाइव इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया गया है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल मानव अंग जैसे हृदय ऊतकों में इन विट्रो अध्ययन के लिए एक ठोस मंच का गठन करता है।

Introduction

जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) मनुष्यों में जन्मजात दोष का सबसे आम प्रकार है और सभी जीवित जन्मों के लगभग 1% को प्रभावित करता है1,2,3। ज्यादातर परिस्थितियों में, सीएचडी के कारण अज्ञात रहते हैं। प्रयोगशाला में मानव हृदय मॉडल बनाने की क्षमता जो विकासशील मानव हृदय के समान है, सरोगेट पशु मॉडल के बजाय मनुष्यों में सीएचडी के अंतर्निहित कारणों का सीधे अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम आगे का गठन करती है।

प्रयोगशाला में उगाए गए ऊतक मॉडल का प्रतीक ऑर्गेनोइड्स, 3 डी सेल निर्माण हैं जो सेल संरचना और शारीरिक कार्य में रुचि के एक अंग के समान हैं। ऑर्गेनोइड्स अक्सर स्टेम कोशिकाओं या पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न होते हैं और सफलतापूर्वक मस्तिष्क 4,5, गुर्दे 6,7, आंत 8,9, फेफड़े 10,11, यकृत 12,13, और अग्न्याशय 14,15 जैसे कई अंगों को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। , बस कुछ नाम के लिए. हाल के अध्ययनों में विट्रो में दिल के विकास का अध्ययन करने के लिए आत्म-असेंबलिंग दिल ऑर्गेनोइड्स बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया गया है। इन मॉडलों में माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) का उपयोग करके प्रारंभिक हृदय विकास 16,17 को एट्रिओवेंट्रिकुलर विनिर्देश 18 और मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) तक मॉडल करना शामिल है ताकि बहु-रोगाणु परत कार्डियक-एंडोडर्म ऑर्गेनोइड्स 19 और अत्यधिक जटिल सेलुलर संरचना के साथ कार्डियोइड्स 20 उत्पन्न किया जा सके।

यह पेपर एक कुशल और लागत प्रभावी तरीके से अत्यधिक जटिल एचएचओ उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास 3-चरण WNT मॉडुलन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। ऑर्गेनोइड्स 96-वेल प्लेटों में उत्पन्न होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक स्केलेबल, उच्च-थ्रूपुट सिस्टम होता है जिसे आसानी से स्वचालित किया जा सकता है। यह विधि एचपीएससी समुच्चय बनाने और कार्डियोजेनेसिस के विकासात्मक चरणों को ट्रिगर करने पर निर्भर करती है, जिसमें मेसोडर्म और कार्डियक मेसोडर्म गठन, पहला और दूसरा हृदय क्षेत्र विनिर्देशन, प्रोपिकार्डियल अंग गठन और एट्रिओवेंट्रिकुलर विनिर्देश शामिल हैं। भेदभाव के 15 दिनों के बाद, एचएचओ में हृदय में पाए जाने वाले सभी प्रमुख सेल वंश, अच्छी तरह से परिभाषित आंतरिक कक्षों, अलिंद और वेंट्रिकुलर कक्षों और पूरे ऑर्गेनोइड में एक संवहनी नेटवर्क होता है। यह अत्यधिक परिष्कृत और पुनरुत्पादक हृदय ऑर्गेनोइड प्रणाली हृदय विकास, और बीमारियों और औषधीय स्क्रीनिंग के अध्ययन में संरचनात्मक, कार्यात्मक, आणविक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों की जांच करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

1. एचपीएससी संस्कृति और रखरखाव

नोट: मानव प्रेरित PSCs (hiPSCs) या मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) को विभेदन या आगे क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए EBs उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने से पहले पिघलने के बाद कम से कम 2 लगातार मार्गों के लिए सुसंस्कृत करने की आवश्यकता होती है। hPSCs पीएससी माध्यम में सुसंस्कृत कर रहे हैं ( सामग्री की तालिका देखें) तहखाने-झिल्ली-extracellular मैट्रिक्स (BM-ECM) पर लेपित 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों. 6-अच्छी तरह से प्लेटों में एचपीएससी पर मध्यम परिवर्तन करते समय, अवांछित सेल टुकड़ी या तनाव को रोकने के लिए सीधे कोशिकाओं के शीर्ष पर होने के बजाय सीधे अच्छी तरह से आंतरिक पक्ष में माध्यम जोड़ें। उपयोगकर्ताओं को प्री-वार्मिंग पीएससी मीडिया से सावधान रहना चाहिए जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म नहीं किया जाना चाहिए; इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी पीएससी मीडिया थर्मोस्टेबल थे।

  1. बीएम-ईसीएम के साथ अच्छी तरह से प्लेटों को कोट करने के लिए, बर्फ पर बीएम-ईसीएम (निर्माता के निर्देशों के अनुसार -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के एक एलीकोट को पिघलाएं और बीएम-ईसीएम के 0.5 मिलीग्राम को 12 मिलीलीटर ठंडे डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) / एफ 12 माध्यम (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के साथ मिलाएं। DMEM / F12-BM-ECM मिश्रण के 2 मिलीलीटर को 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं पर वितरित करें और कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिकाओं को पिघलाने के लिए, सबसे पहले, एचपीएससी क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस मनका या पानी के स्नान में 1-2 मिनट के लिए पिघलाएं जब तक कि केवल थोड़ी मात्रा में बर्फ दिखाई न दे। पिघले हुए कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे पीएससी माध्यम के 8-9 मिलीलीटर को रॉक अवरोधक, थियाज़ोविविन (थियाज़) के 2 μM के साथ पूरक जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें और Thiaz के 2 μM के साथ पूरक पीएससी माध्यम में सेल गोली resuspend. संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोवियल सेल एकाग्रता और संस्कृति के आधार पर 1-2 कुओं में वितरित करें, पीएससी माध्यम को बदलने से पहले 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
  3. 48 घंटे के अंतराल पर कोशिकाओं पर माध्यम बदलें। क्रमशः DMEM / F12 (1 mL / well) और PSC माध्यम (2 mL / well) का उपयोग करके धोने और मध्यम परिवर्तन करें।
    नोट: Washes सेल अपशिष्ट और मलबे को हटाने में मदद करते हैं जबकि ताजा मीडिया परिवर्तन पोषक तत्वों के एक नए स्रोत के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते हैं।
  4. माध्यम को एस्पिरेट करके उप-प्रवाह (60-80% confluent) पर कोशिकाओं को पारित करना, फिर 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड समाधान (कोई कैल्शियम नहीं, कोई मैग्नीशियम नहीं) के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोना; डीपीबीएस)। DPBS aspirate और hPSCs के लिए पृथक्करण अभिकर्मक के 1 mL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), सभी की आकांक्षा के बाद लेकिन 10 s के बाद अभिकर्मक की एक पतली फिल्म।
  5. HPSCs के लिए पृथक्करण अभिकर्मक की पतली फिल्म के साथ 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाओं के बीच अंतराल न बन जाए।
    नोट:: पृथक्करण को रोकने के लिए समय कक्ष-पंक्ति-निर्भर है।
  6. अच्छी तरह से थियाज़ (पीएससी माध्यम + थियाज़) के 2 μM के साथ पूरक पीएससी माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और सेल टुकड़ी को प्रेरित करने के लिए धीरे से प्लेट को टैप करें। किसी भी बड़े उपनिवेशों को तोड़ने के लिए 1-2 बार माध्यम में अलग कोशिकाओं को पिपेट करें, और पीएससी माध्यम + थियाज़ में कोशिकाओं को 1: 6 अच्छी तरह से अनुपात में फिर से निलंबित कर दें (1 से कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के 12 मिलीलीटर में फिर से निलंबित किया गया)। BM-ECM-लेपित कुओं पर कोशिकाओं को फिर से लिखें।

2. 3 डी स्व की पीढ़ी मानव दिल organoids इकट्ठा

  1. Embryoid body (EB) गठन:
    नोट: भ्रूणीय शरीर के गठन से पहले अवलोकन योग्य विभेदित कोशिकाओं को सीमित करना अनिवार्य है। 60-80% confluency पर एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के दो से तीन कुओं organoids की एक एकल 96 अच्छी तरह से प्लेट के लिए पर्याप्त कोशिकाओं उपज होगा। ईबी या ऑर्गेनोइड्स को तापमान के झटके को कम करने के लिए किसी भी माध्यम परिवर्तन से पहले सभी मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस मनका या पानी के स्नान में एलीकोट और गर्म किया जाना चाहिए (इसमें सेल पृथक्करण अभिकर्मक शामिल नहीं हैं)। चित्र 1A, B देखें।
    1. दिन -2
      1. ईबी बनाने के लिए, दिन -2 पर, किसी भी सेल मलबे को धोने और डीपीबीएस को एस्पिरेट करने के लिए कम से कम 10 सेकंड के लिए डीपीबीएस के साथ उप-कन्फ्लुएंट एचपीएससी (60-80% कन्फ्लुएंट) को धोएं।
      2. कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें एक एकल-सेल स्थिति में छोड़ने के लिए, 3-6 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से कमरे के तापमान सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करते समय टुकड़ी को प्रेरित करने के लिए धीरे से प्लेट को टैप करें ~ हर मिनट 5 बार। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए पीएससी माध्यम + थियाज के 1 एमएल जोड़ें।
      3. कोशिकाओं को इकट्ठा करने और किसी भी शेष समुच्चय को तोड़ने के लिए, एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए मीडिया को 2-3 बार अच्छी तरह से ऊपर और नीचे पिपेट करें। एकल सेल निलंबन को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 × जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
      4. वांछित सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, supernatant को छोड़ दें और पीएससी माध्यम + थियाज़ के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और पीएससी माध्यम + थियाज़ में कोशिकाओं को 100,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
      5. ईबी गठन के लिए कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, एक राउंड-बॉटम अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL (10,000 कोशिकाओं) को जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। 3 मिनट के लिए 100 × जी पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. दिन -1
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 50 μL को सावधानीपूर्वक निकालें और 250 μL प्रति अच्छी तरह से 250 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए 37 °C तक गर्म किए गए ताजा पीएससी माध्यम के 200 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
        नोट: निकालें और अच्छी तरह से अच्छी तरह से नीचे EBs परेशान करने से बचने के लिए अच्छी तरह से पक्ष पर ध्यान से माध्यम जोड़ें। ईबी की नाजुक प्रकृति और निलंबन संस्कृति के कारण, ईबी को परेशान करने से बचने के लिए माध्यम को बदलते समय प्रत्येक कुएं में तरल की एक छोटी मात्रा को छोड़ना आवश्यक है।
  2. मानव हृदय organoid (hHO) भेदभाव:
    नोट: सभी मीडिया को किसी भी मीडिया परिवर्तन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस मनका या पानी के स्नान में गर्म किया जाना चाहिए। निकालें और अच्छी तरह से अच्छी तरह से नीचे विकासशील organoids परेशान करने से बचने के लिए अच्छी तरह के पक्ष में ध्यान से माध्यम जोड़ें। आंदोलन को कम करने और अवरोधकों और विकास कारकों को धीरे-धीरे हटाने की अनुमति देने के लिए मीडिया परिवर्तनों के बीच धोने की आवश्यकता नहीं है। 2% बी -27 पूरक (सामग्री की तालिका) के साथ आरपीएमआई का उपयोग भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान किया गया था। बी -27 पूरक में इंसुलिन होता है जब तक कि निर्दिष्ट न हो (0-5 दिनों में इंसुलिन मुक्त)। चित्र 1C देखें.
    1. दिन 0
      1. एक मेसोडर्म वंश की ओर भेदभाव शुरू करने के लिए, प्रत्येक कुएं से माध्यम के 166 μL को हटा दें (~ कुल अच्छी तरह से मात्रा का 2/3rd ) और RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें जिसमें इंसुलिन-मुक्त B-27 पूरक, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng / mL हड्डी morphogenetic protein 4 (BMP4), और 1.5 ng / mL Activin A 4 μM CHIR99021 की अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए, 4 μM CHIR9021 की अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए। 1.25 ng/mL BMP4, और 1 ng/mL Activin A. Incubate for 24 h at 37 °C, 5% CO2.
    2. दिन 1
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 166 μL निकालें और इंसुलिन मुक्त बी -27 पूरक के साथ ताजा RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. दिन 2
      1. कार्डियक मेसोडर्म विनिर्देश को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक कुएं से माध्यम के 166 μL को हटा दें और RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें जिसमें इंसुलिन-मुक्त B-27 पूरक और 3 μM WNT-C59 शामिल हैं, जो 2 μM Wnt-C59 की अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए है। 37 °C, 5% CO2 पर 48 h के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. दिन 4
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 166 μL निकालें और इंसुलिन मुक्त बी -27 पूरक के साथ ताजा RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. दिन 6
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 166 μL निकालें और B-27 पूरक के साथ RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. दिन 7
      1. proepicardial भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 166 μL को हटा दें और 2 μM CHIR99021 की अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए B-27 पूरक और 3 μM CHIR99021 युक्त ताजा RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 166 μL निकालें और ताजा RPMI 1640 के 166 μL बी -27 पूरक युक्त जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: दिन 7 पर इस दूसरे माध्यम परिवर्तन पर अतिरिक्त सावधानी बरतने की सलाह दी जाती है क्योंकि मीडिया परिवर्तनों के कारण ऑर्गेनोइड्स आंदोलन के लिए अधिक प्रवण होते हैं।
      3. दिन 7 के बाद से विश्लेषण या प्रयोग के लिए संग्रह या हस्तांतरण तक, प्रत्येक कुएं से माध्यम के 166 μL को हटाकर हर 48 घंटे में मध्यम परिवर्तन करें और बी -27 पूरक युक्त ताजा RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें।
        नोट: ऑर्गेनोइड्स 15 वें दिन में विश्लेषण और प्रयोग के लिए तैयार हैं जब तक कि पहले के विकास के चरण ब्याज के न हों। उन्हें दीर्घकालिक संस्कृति या परिपक्वता प्रयोगों के लिए पिछले दिन 15 सुसंस्कृत किया जा सकता है।

3. Organoid विश्लेषण

  1. पूरे ऑर्गेनोइड्स को स्थानांतरित करना (लाइव या फिक्स्ड)
    नोट: लाइव ऑर्गेनोइड ट्रांसफर के लिए, सुनिश्चित करें कि पिपेट युक्तियाँ उपयोग की जाती हैं बाँझ हैं।
    1. टिप खोलने से 5-10 मिमी एक P200 पिपेट टिप को काटें, जिसके परिणामस्वरूप ~ 2-3 मिमी व्यास का एक विस्तृत उद्घाटन होता है।
    2. टिप को सीधे राउंड-बॉटम में डालें जिसमें ऑर्गेनोइड होता है ताकि पिपेट पूरी तरह से ऊर्ध्वाधर (प्लेट के लंबवत) हो। सुनिश्चित करें कि पिपेट प्लंजर पहले से ही माध्यम में टिप डालने से पहले सभी तरह से दबाया गया है।
    3. धीरे-धीरे पिपेट प्लंजर को जारी करें, ऑर्गेनोइड को इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त माध्यम (100-200 μL) लेते हैं।
    4. लक्ष्य गंतव्य के लिए माध्यम में organoid हस्तांतरण (उदाहरण के लिए, फिक्सिंग के लिए, लाइव इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग, नई प्लेट संस्कृति)।
  2. फिक्सिंग organoids
    नोट: फिक्सिंग और धुंधला organoids या तो 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट या microcentrifuge ट्यूबों में किया जा सकता है. पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) को केवल धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए।
    1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में निर्धारण के लिए, प्रति ट्यूब 1-8 ऑर्गेनोइड्स के साथ अलग-अलग ट्यूबों में लाइव ऑर्गेनोइड्स को स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रति ट्यूब 8 organoids से अधिक न करें।
    2. ध्यान से निकालें और organoids को छूने के बिना ट्यूब से जितना संभव हो उतना माध्यम त्याग दें।
    3. प्रत्येक ट्यूब या कुएं में 4% पीएफए जोड़ें (300-400 μL प्रति माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब और 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 100-200 μL)। 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट:: इनक्यूबेशन बार 1 ज से अधिक एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों की आवश्यकता हो सकती है और अनुशंसित नहीं हैं।
    4. ऑर्गेनोइड्स को परेशान किए बिना पीएफए को सुरक्षित रूप से त्याग दें। 1.5 ग्राम / एल ग्लाइसिन (DPBS / Gly) के साथ पूरक DPBS के साथ 3 washes प्रदर्शन करें, 4% PFA के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही मात्रा का उपयोग करके, धोने के बीच 5 मिनट की प्रतीक्षा कर रहे हैं। DPBS / Gly को निकालें और immunostaining या अन्य विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें या DPBS जोड़ें और 2 सप्ताह तक के लिए भविष्य के उपयोग के लिए 4 °C पर स्टोर करें।
      नोट: 2 सप्ताह से अधिक समय तक निश्चित ऑर्गेनोइड्स को संग्रहीत करने से ऊतक क्षरण और संदूषण हो सकता है और इसकी सिफारिश नहीं की जाती है।
  3. पूरे माउंट immunofluorescent धुंधला
    1. ब्लॉकिंग / permeabilization समाधान के 100 μL जोड़ें (10% सामान्य गधा सीरम + 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) + 0.5% ट्राइटन एक्स -100 1x DPBS में) प्रत्येक अच्छी तरह से या निश्चित organoids युक्त ट्यूब के लिए। एक शेकर पर रात भर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रति ट्यूब 8 organoids से अधिक न करें।
    2. ध्यान से निकालें और organoids को छूने के बिना संभव के रूप में ब्लॉकिंग समाधान के रूप में ज्यादा के रूप में त्याग. DPBS के साथ 3 washes प्रदर्शन, धोने के बीच 5 मिनट इंतजार कर रहे हैं.
    3. अनुशंसित सांद्रता में वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1% सामान्य गधा सीरम + 0.5% बीएसए + 0.5% ट्राइटन एक्स -100 1x DPBS में) तैयार करें। एक शेकर पर 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. ध्यान से निकालें और organoids को छूने के बिना संभव के रूप में एंटीबॉडी समाधान के रूप में ज्यादा के रूप में त्याग. DPBS के साथ 3 washes प्रदर्शन, धोने के बीच 5 मिनट इंतजार कर रहे हैं.
    5. अनुशंसित सांद्रता में वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान (1% सामान्य गधा सीरम + 0.5% बीएसए + 0.5% ट्राइटन एक्स -100 1x DPBS में) तैयार करें। यदि एंटीबॉडी फ्लोरोसेंटली लेबल किए जाते हैं, तो शेकर पर 24 घंटे के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया गया)।
    6. ध्यान से निकालें और organoids को छूने के बिना संभव के रूप में एंटीबॉडी समाधान के रूप में ज्यादा के रूप में त्याग. DPBS के साथ 3 washes प्रदर्शन, धोने के बीच 5 मिनट इंतजार कर रहे हैं.
    7. स्लाइड के किनारों के पास एक बढ़ते माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में घुड़सवार मोतियों (व्यास में 90-300 μm) के साथ स्लाइड तैयार करें जहां ऑर्गेनोइड्स के साथ कवरस्लिप रखा जाएगा।
      नोट: आगे बढ़ने से पहले मोतियों के चारों ओर बढ़ते माध्यम को सूखने की अनुमति देने की सिफारिश की जाती है; यह मोतियों को चारों ओर घूमने से रोक देगा। चित्र 2 देखें।
    8. स्लाइड पर एक कट पिपेट टिप का उपयोग करके दाग वाले ऑर्गेनोइड्स को स्थानांतरित करें, मोतियों के बीच, स्लाइड पर एक बार ऑर्गेनोइड्स के बीच संपर्क से बचने के लिए रिक्ति सुनिश्चित करें। ऑर्गेनोइड के चारों ओर अतिरिक्त तरल को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए एक लुढ़का हुआ प्रयोगशाला पोंछे के कोने का उपयोग करें।
    9. बढ़ते-समाशोधन माध्यम के साथ ऑर्गेनोइड्स को कवर करें (फ्रुक्टोज-ग्लिसरॉल क्लियरिंग समाधान 60% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) ग्लिसरॉल और 2.5 एम फ्रुक्टोज है) 37 प्रति स्लाइड बढ़ते-समाशोधन माध्यम के 120-150 μL का उपयोग करके।
      नोट: यह एक कट पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए अनुशंसा की जाती है जब बढ़ते-समाशोधन माध्यम के साथ काम कर रहा है क्योंकि यह बहुत चिपचिपा है।
    10. बढ़ते-समाशोधन समाधान के साथ कवर किए गए ऑर्गेनोइड्स के साथ स्लाइड पर कवरस्लिप को होवर करें और धीरे-धीरे स्लाइड पर कवरस्लिप दबाएं, यह सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड्स घुड़सवार मोतियों के बीच हैं।
    11. शीर्ष कोट नाखून वार्निश का उपयोग कर स्लाइड पर coverslip की परिधि सील. स्लाइड को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सूखने की अनुमति दें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कैल्शियम क्षणिक इमेजिंग जीवित दिल organoids में
    नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार, Fluo4-AM को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) में 0.5 mM की अंतिम स्टॉक समाधान एकाग्रता के लिए पुनर्गठित किया गया था। Fluo4-AM सीधे 96-अच्छी तरह से प्लेट में organoid अच्छी तरह से जोड़ा गया था।
    1. RPMI 1640 माध्यम का उपयोग करके organoids पर 2 washes प्रदर्शन.
      1. कुएं से खर्च किए गए माध्यम के 166 μL को निकालें।
      2. गर्म RPMI 1640 माध्यम के 166 μL जोड़ें, मध्यम के 166 μL निकालें, और ताजा RPMI 1640 माध्यम के 166 μL जोड़ें।
        नोट: washes अपशिष्ट सामग्री और सेल मलबे को हटाने के लिए किया जाता है। माध्यम के दो तिहाई को धोने के दौरान कुओं से हटा दिया जाता है ताकि कार्यात्मक परख से पहले अच्छी तरह से नीचे ऑर्गेनोइड्स को परेशान करने से बचा जा सके।
    2. Organoids करने के लिए Fluo4-AM माध्यम जोड़ें.
      1. एक 1.5 μM समाधान तैयार करने के लिए B-27 पूरक युक्त RPMI 1640 करने के लिए DMSO में पुनर्गठित Fluo4-AM जोड़ें।
      2. कुएं से 166 μL माध्यम निकालें।
      3. 1 μM की अंतिम अच्छी तरह से सांद्रता के लिए B-27 पूरक युक्त RPMI 1640 में 1.5 μM Fluo4-AM का 166 μL जोड़ें। 37 °C पर इनक्यूबेट करें, 30 मिनट के लिए 5% CO2 ।
    3. चरण 3.4.1 के रूप में 2 washes निष्पादित करें।
    4. अच्छी तरह से बी -27 पूरक युक्त RPMI 1640 के 166 μL जोड़ें।
    5. P200 पिपेट टिप की एक कट टिप का उपयोग करते हुए, ऑर्गेनोइड को ग्लास-बॉटम पेट्री डिश में स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, # 1.5 उच्च-प्रदर्शन कवरग्लास के साथ 8-अच्छी तरह से चेंबर वाले कवर ग्लास) माध्यम के 100-200 μL के साथ।
      नोट: पूरे organoids स्थानांतरित करने पर अनुभाग 3.1 देखें।
    6. छवि ऑर्गेनोइड्स एक तापमान के साथ एक माइक्रोस्कोप के नीचे रहते हैं- और सीओ 2-नियंत्रित कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर।
    7. ऑर्गेनोइड भर में विभिन्न स्थानों पर कई 10-20 एस वीडियो रिकॉर्ड करें, जो प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर में वृद्धि और कमी दिखाते हैं क्योंकि कैल्शियम कोशिकाओं में प्रवेश करता है और बाहर निकलता है।
      नोट:: उच्च रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग के लिए, यह 10 एफपीएस या तेज की गति से रिकॉर्ड करने के लिए अनुशंसित है; 50 एफपीएस की सिफारिश की जाती है।
    8. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (जैसे, ImageJ) का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्रों का चयन करके और समय के साथ तीव्रता के स्तर को मापने के द्वारा वीडियो का विश्लेषण करें।
    9. मिलीसेकंड और प्लॉट में समय बनाम ΠF/F0 का उपयोग करके तीव्रता रिकॉर्डिंग को सामान्य करें।

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Representative Results

विट्रो में स्व-आयोजन एचएचओ प्राप्त करने के लिए, हमने पहले कार्डियोमायोसाइट्स 21 और एपिकार्डियल सेल 22 के 2 डी मोनोलेयर भेदभाव के लिए वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल को संशोधित और संयुक्त किया है, जो WNT Pathway modulators का उपयोग करके और 3D precardiac organoids16 के लिए विकास कारकों BMP4 और Activin A का उपयोग करके 96-well plate EB और hHO भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके यहां वर्णित है और चित्रा 1 में दिखाया गया है। , WNT Pathway activator CHIR99021 की सांद्रता और एक्सपोजर अवधि को मानव PSCs से व्युत्पन्न अत्यधिक पुनरुत्पादक और जटिल hHOs उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया था। HPSCs या PSC माध्यम में सुसंस्कृत hPSCs या hESCs को 60-80% तक कॉलोनी-जैसे गठन में कम से कम कोई दृश्यमान भेदभाव के साथ EB पीढ़ी के लिए आदर्श हैं (चित्रा 1B)।

ईबी को दिन 0 पर भेदभाव शुरू करने से पहले 24 घंटे के बाद एक मध्यम परिवर्तन के साथ 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दी गई थी। दिन 0 पर, ईबी को प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के तहत प्रत्येक कुएं के केंद्र में एक अंधेरे गोलाकार समुच्चय के रूप में दिखाई देना चाहिए। विभेदन प्रोटोकॉल WNT Pathway सक्रियण और विकास कारक के अलावा ठीक 24 ज के लिए के साथ दिन 0 पर शुरू होता है. WNT Pathway inhibitor WNT-C59 का उपयोग करके दिन 2 पर एक कार्डियक मेसोडर्म प्रेरण के बाद इस मेसोडर्म प्रेरण के परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड का एक महत्वपूर्ण विस्तार होगा ~ 200 μm व्यास में 500-800 μm व्यास में दिन 4 पर और 1 मिमी के रूप में ज्यादा के रूप में (organoids दिन 15 (चित्रा 1C) द्वारा आकार में मामूली कमी का अनुभव कर सकते हैं)। एचएचओ दिन 6 (वीडियो 1) के रूप में जल्दी से मारना शुरू कर देगा, जिसमें 100% ऑर्गेनोइड्स दिन 10 (वीडियो 2) द्वारा दिखाई देने वाली पिटाई दिखाते हैं (जब तक कि दवा उपचार से गुजरना न हो या यदि अपर्याप्त एचपीएससी का उपयोग ईबी उत्पन्न करने के लिए नहीं किया गया था)। यह 5 अलग-अलग एचपीएससी सेल लाइनों 23 में देखा गया है।

दिल के शारीरिक विकास के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करने के लिए एचएचओ की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने भेदभाव प्रोटोकॉल में विभिन्न समय बिंदुओं पर ऑर्गेनोइड्स एकत्र किए और हृदय क्षेत्र मार्करों की उपस्थिति और ट्रांसक्रिप्टोमिक अभिव्यक्ति की तलाश की। पहले दिल के क्षेत्र (एफएचएफ) मार्कर, HAND1, और दूसरे दिल क्षेत्र (SHF) मार्कर, HAND2 के लिए Immunofluorescent धुंधला, क्रमशः दिन 3 और दिन 5 के आसपास उत्पन्न होने वाली इन कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं में उनकी परमाणु उपस्थिति का पता चला (चित्रा 3 ए)।

दोनों मार्करों की अभिव्यक्ति ऑर्गेनोइड्स के क्षेत्रों में होती है जो एफएचएफ के लिए दिन 7 के बाद आकार में कम हो जाती है और एसएचएफ के लिए दिन 9 के बाद होती है। दिलचस्प बात यह है कि दिन 7 ऑर्गेनोइड्स की उच्च-आवर्धन छवियों से पता चला है कि अधिकांश HAND1-व्यक्त कोशिकाएं मूल में कार्डियोमायोसाइट्स थीं (जैसा कि कार्डियोमायोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर TNNT2 द्वारा दिखाया गया है)। इसके विपरीत, HAND2-व्यक्त कोशिकाओं में से कई ने कार्डियोमायोसाइट्स मार्कर (चित्रा 3 बी) को व्यक्त नहीं किया। यह अवलोकन माउस ईएससी से व्युत्पन्न प्रीकार्डियक ऑर्गेनोइड्स के साथ समझौते में है जो एसएचएफ पूर्वज कोशिकाओं से गैर-मायोसाइट्स कोशिकाओं के विकास का प्रदर्शन करता है16। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आरएनए-अनुक्रमण डेटा से पता चलता है कि HAND1 और HAND2 दोनों के लिए आरएनए टेप ों को दिन 3 से व्यक्त किया गया था, जिसमें FHF मार्कर को दिनों 3 और 11 के बीच अधिक उच्च रूप से व्यक्त किया गया था और SHF मार्कर को दिन 13 (चित्रा 3 C) के बाद अधिक उच्च रूप से व्यक्त किया गया था।

Immunofluorescence धुंधला विभिन्न सेल प्रकार के वंशों के मार्करों की उपस्थिति का पता चला है कि मानव दिल बनाते हैं. मायोकार्डियल ऊतक (कार्डियोमायोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर TNNT2 का उपयोग करके पहचाने जाने योग्य) एपिकार्डियल ऊतक (परमाणु प्रतिलेखन कारक WT1 और उपकला झिल्ली मार्कर TJP1 द्वारा चिह्नित) (चित्रा 4A) से सटे हुए हैं। एनएफएटीसी 1 को व्यक्त करने वाली एंडोकार्डियल कोशिकाओं को ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 4 बी) के भीतर आंतरिक कक्ष जैसी संरचनाओं की दीवारों को अस्तर करने का पता लगाया गया था। एक पोत जैसे नेटवर्क में एंडोथेलियल कोशिकाओं को विभेदन के दिन 13 के रूप में देखा जा सकता है (चित्रा 4 सी)। अंत में, हम कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स की उपस्थिति की रिपोर्ट करते हैं जो ऑर्गेनोइड (चित्रा 4 डी) में इंटरमिक्स्ड होते हैं। इन सेल-प्रकार मार्करों को आरएनए-सेक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल (चित्रा 4 ई) में भी देखा गया था। ऑर्गेनोइड्स में सेल प्रकारों की संरचना, जैसा कि उनके द्वारा कब्जा किए गए ऑर्गेनोइड के क्षेत्र द्वारा मापा जाता है, ~ 58% कार्डियोमायोसाइट्स पाया गया था, जिसमें बाकी में गैर-मायोसाइट्स कार्डियक कोशिकाएं शामिल थीं, जिनमें एपिकार्डियल कोशिकाएं (~ 15%), एंडोकार्डियल कोशिकाएं (~ 13%), कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (~ 12%), और एंडोथेलियल कोशिकाएं (~ 1%) (चित्रा 4 एफ) शामिल थीं।

ऑर्गेनोइड्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन को पूरे ऑर्गेनोइड्स में व्यक्तिगत कोशिकाओं के लाइव कैल्शियम इमेजिंग द्वारा मापा गया था। फ्लूओ -4 प्रतिदीप्ति तीव्रता कैल्शियम प्रवेश और सेल से बाहर निकलने के कारण समय के साथ बदलती रहती है, जिससे नियमित कार्रवाई क्षमता का पता चलता है (चित्रा 5 ए)। ऑर्गेनोइड के उच्च-आवर्धन क्षेत्र पर कैल्शियम की तीव्रता दिखाने वाले हीटमैप्स व्यक्तिगत कोशिकाओं में कैल्शियम क्षणिकों के कारण बढ़ी हुई तीव्रता दिखाते हैं (चित्रा 5 बी और वीडियो 3)।

Figure 1
चित्र 1: भ्रूणीय शरीर उत्पादन और हृदय ऑर्गेनोइड विभेदन चरण(A) (1-2) विघटित कोशिकाओं को एक मल्टीचैनल पिपेट के माध्यम से 96-अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट के कुओं में बीज दिया जाता है। (3) 96-अच्छी तरह से प्लेट को तब सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, जो कोशिकाओं को केंद्र में एकत्रित करने की अनुमति देता है। (4) समय के साथ, विकास कारकों और मार्ग मॉड्यूलेटर के अलावा के बाद, भ्रूण शरीर कई कार्डियक वंशों में अंतर करना शुरू कर देता है और आंतरिक माइक्रोचैंबर्स के आसपास स्थानिक और शारीरिक रूप से प्रासंगिक अलग-अलग सेल आबादी बनाता है। (बी) भ्रूण शरीर की पीढ़ी की प्रगति की प्रतिनिधि छवियां, 2-आयामी आईपीएससी संस्कृति (बाएं) के साथ शुरू होती हैं और एक दिन 0 भ्रूण शरीर (दाएं) के साथ समाप्त होती हैं; स्केल बार = 500 μm. (C) मानव हृदय ऑर्गेनोइड भेदभाव प्रोटोकॉल का सारांश, जिसमें संबंधित समय बिंदुओं, अवधियों के साथ रासायनिक मार्ग मॉड्यूलेटर और अवरोधक शामिल हैं, और दिन 1 से दिन 15 तक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत ऑर्गेनोइड छवियों को विकसित करना; स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग के लिए स्लाइड पर पूरे ऑर्गेनोइड बढ़ते हैं। इमेजिंग के लिए स्लाइड और बढ़ते ऑर्गेनोइड्स तैयार करने के लिए चरण। (ए) कांच की स्लाइड की परिधि पर माइक्रोबीड्स का प्लेसमेंट। (बी) बढ़ते माध्यम के साथ माइक्रोबीड्स को कवर करना। (सी) मोतियों के बीच स्लाइड पर ऑर्गेनोइड्स को स्थानांतरित करना और ऑर्गेनोइड्स के आसपास के अतिरिक्त तरल को हटाना। (d) समाशोधन/बढ़ते माध्यम के साथ ऑर्गेनोइड्स को कवर करना। (ई) ऑर्गेनोइड्स और मोतियों के साथ स्लाइड के शीर्ष पर कवरस्लिप रखना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एचएचओ में पहला दिल का क्षेत्र और दूसरा दिल क्षेत्र विनिर्देश शारीरिक मानव हृदय विकास को दोहराता है। (ए) दिन 3 से दिन 11 एचएचओ की कॉन्फोकल इम्युनोफ्लोरेसेंस छवियां जो एफएचएफ (HAND1, शीर्ष) और SHF (HAND2, नीचे), और कार्डियोमायोसाइट्स (TNNT2) और परमाणु डाई DAPI के गठन को दर्शाती हैं; स्केल सलाखों = 500 μm. (बी) कार्डियोमायोसाइट्स मार्कर TNNT2 के साथ HAND1 और HAND2 के सह-स्थानीयकरण को दिखाने वाले दिन 7 ऑर्गेनोइड्स की उच्च-आवर्धन छवियां; स्केल सलाखों = 50 μm. (C) FHF मार्कर HAND1 (लाल) और SHF मार्कर HAND2 (नीला) के RNA-Seq जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिन 0 से दिन 19 तक। संक्षेप: hHOs = मानव दिल organoids; FHF = पहला दिल क्षेत्र; SHF = दूसरा दिल क्षेत्र; हाथ = दिल और तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव व्यक्त; TNNT2 = कार्डियक ट्रोपोनिन T2; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एचएचओ कार्डियक वंशों को विकसित करते हैं। (A-D) दिन 15 hHOs के confocal immunofluorescence छवियों कार्डियोमायोसाइट्स (TNNT2) के गठन और गैर-मायोसाइट्स कार्डियक कोशिकाओं में परमाणु डाई DAPI के साथ धुंधला दिखा. (ए) पूरे ऑर्गेनोइड और एपिकार्डियल मार्कर डब्ल्यूटी 1 (हरे) और उपकला झिल्ली मार्कर टीजेपी 1 (सफेद) के उच्च आवर्धन शीर्ष पर उपकला मूल की एपिकार्डियल कोशिकाओं को दिखाते हुए और मायोकार्डियल ऊतक के आसन्न; स्केल बार = 500 μm, इनसेट = 50 μm. (B) एंडोकार्डियल मार्कर NFATC1 (हरे) कक्षों के अस्तर पर अभिव्यक्ति; स्केल बार = 500 μm. (C) PECAM1 (हरे रंग) द्वारा दिखाए गए hHOs में एंडोथेलियल पोत नेटवर्क। स्केल बार = 500 μm. (D) कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स मार्करों THY1 और VIM क्रमशः हरे और सफेद रंग में दिखाया गया है, पूरे ऑर्गेनोइड में वितरित किया जाता है। स्केल बार = 500 μm. (E) RNA-Seq जीन अभिव्यक्ति hHOs में मौजूद प्रमुख सेल प्रकारों के प्रोफाइल 0 से 19 दिनों के भेदभाव के दिनों से। संक्षेप: hHOs = मानव दिल organoids; TNNT2 = कार्डियक ट्रोपोनिन T2; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; WT1 = विल्म के ट्यूमर -1 प्रतिलेखन कारक; NFATC1 = सक्रिय टी सेल के साइटोप्लाज्मिक परमाणु कारक; PECAM1 = प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1; VIM = vimentin. (एफ) एचएचओ में औसत ऊतक प्रकार की संरचना का पाई चार्ट, इमेजजे का उपयोग करके पूरे ऑर्गेनोइड में तीन जेड-विमानों में परमाणु धुंधला करके एक पूरे ऑर्गेनोइड पर संबंधित सेल मार्कर के साथ प्रतिशत क्षेत्र के रूप में गणना की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: Fluo-4 जीवित मानव हृदय organoids में कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग रहते हैं. (ए) पूरे ऑर्गेनोइड्स के भीतर व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिनिधि कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग। (बी) हीटमैप फ्लूओ -4 तीव्रता द्वारा निर्धारित कार्रवाई क्षमता के बीच कम और चरम कैल्शियम के स्तर को दर्शाता है; स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

वीडियो 1: कमरे के तापमान पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत भेदभाव के दिन 6 पर एचपीएससी से व्युत्पन्न प्रतिनिधि ऑर्गेनोइड की लाइव इमेजिंग। संक्षिप्त नाम: hPSC = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: कमरे के तापमान पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत भेदभाव के दिन 15 में एचपीएससी से व्युत्पन्न प्रतिनिधि ऑर्गेनोइड की लाइव इमेजिंग। संक्षिप्त नाम: hPSC = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 3: दिन 10 organoid की लाइव रिकॉर्डिंग एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कैल्शियम transients के हीटमैप दिखा रहा है. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कार्डियक मूल की अन्य कोशिकाओं में हाल की प्रगति का उपयोग मानव हृदय विकास 22,24,25 और रोग 26,27,28 को मॉडल करने के लिए किया गया है और चिकित्सीय 29,30 और विषाक्त एजेंटों को स्क्रीन करने के लिए उपकरण के रूप में 31,32 . यहां, हम अत्यधिक जटिल एचएचओ में ईबी को उत्पन्न करने और अलग करने के लिए एक आसान-से-लागू, अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह प्रोटोकॉल कई सेल लाइनों में सफल रहा है, जिसमें hPSCs और hESCs23 शामिल हैं, जो लगातार पिटाई आवृत्तियों और सेल प्रकार संगठन को दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल कार्डियोमायोसाइट्स भेदभाव 24, एपिकार्डियल सेल भेदभाव 22, और माउस ईएससी 16 से व्युत्पन्न प्रीकार्डियक ऑर्गेनोइड्स के लिए पहले से वर्णित प्रोटोकॉल से पहलुओं को आकर्षित करता है और पूरी तरह से परिभाषित माध्यम में रासायनिक अवरोधकों और विकास कारकों का उपयोग करके विहित डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के चरणबद्ध मॉडुलन को अनुकूलित करता है। इस प्रोटोकॉल की पीढ़ी में कई अनुकूलन पद्धतियों को नियोजित किया गया था।

सबसे पहले, रासायनिक अवरोधक सांद्रता और जोखिम अवधि, साथ ही साथ विकास कारकों के अलावा, 3 डी पर्यावरण के लिए अनुकूलित किया गया है और पिछले work23 में चर्चा की गई है। इन्हें शारीरिक जटिलता और विवो मानव हृदय के प्रतिनिधित्व के साथ संरचनाओं को स्पष्ट करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें शारीरिक संरचना और कार्डियोमायोसाइट्स के अनुपात गैर-मायोसाइट्स कार्डियक सेल प्रकारों (एपिकार्डियल कोशिकाओं, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स) के अनुपात के साथ थे। दूसरा, दो-तिहाई मध्यम परिवर्तन रणनीति ईबी / ऑर्गेनोइड्स के न्यूनतम आंदोलन की अनुमति देती है, क्योंकि वे कुएं के नीचे निलंबन में बैठते हैं, जबकि माध्यम को ताज़ा करने पर रासायनिक अवरोधकों और विकास कारकों के लिए एक ढाल जोखिम की सुविधा भी प्रदान करते हैं। WNT Pathway activation के माध्यम से कार्डियक मेसोडर्म भेदभाव का संयोजन, inhibition24 के बाद, और एक दूसरे WNT Pathway activation22 के माध्यम से proepicardial विनिर्देश के बाद के प्रेरण, अत्यधिक जटिल hHOs उपज करने के लिए एक एकल प्रोटोकॉल के लिए अनुमति देता है। ऑर्गेनोइड्स 15 दिनों के भेदभाव के बाद 1 मिमी तक बढ़ते हैं और आसानी से लाइव या निश्चित विश्लेषण और assays के लिए स्थानांतरित किए जा सकते हैं। तीसरा, ऑर्गेनोइड्स के बड़े आकार को देखते हुए, स्लाइड और कवरस्लिप के बीच स्थान बनाए रखने के लिए माइक्रोबीड्स या अन्य समान संरचनाओं का उपयोग ऑर्गेनोइड्स की 3 डी संरचना को बेहतर ढंग से संरक्षित करने और इमेजिंग प्रक्रिया में सुधार करने के लिए पाया गया था।

यह विकासशील मानव हृदय मॉडल हृदय विकास के अन्यथा दुर्गम चरणों तक पहुंच की अनुमति देता है, जैसे कि शुरुआती पहले और दूसरे दिल के क्षेत्र विनिर्देशन-भेदभाव के दिनों 3 और 9 के बीच मनाया जाता है- और कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं में संगठन जो हृदय के ऊतकों को जन्म देता है, जिसमें मायोकार्डियम, एंडोकार्डियम, एपिकार्डियम, एंडोथेलियल वास्कुलचर और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट का समर्थन शामिल है, जो भेदभाव के 15 वें दिन मनाया गया था। इस प्रोटोकॉल से व्युत्पन्न हृदय ऑर्गेनोइड्स में मौजूद ऊतक प्रकार संरचना 33 और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल 23,34 दोनों में मानव भ्रूण के दिल के अत्यधिक प्रतिनिधि हैं। इसलिए वे ऊतक-ऊतक और सेल-सेल उच्च-क्रम इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं जो इन विवो हार्ट के समान हैं। यह प्रोटोकॉल प्रयोगों और सेल लाइनों में अत्यधिक कुशल और पुनरुत्पादक था, जो ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करता है जिसमें ज्यादातर कार्डियोमायोसाइट्स शामिल होते हैं और इसमें गैर-मायोसाइट्स कार्डियक कोशिकाएं शामिल होती हैं, जैसे कि एपिकार्डियल कोशिकाएं, एंडोकार्डियल कोशिकाएं, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाएं, शारीरिक संरचना का प्रतिनिधित्व करती हैं23,33,35।

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट्स बनाने की अल्ट्रास्ट्रक्चर के विश्लेषण और ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी और कॉन्फोकल इमेजिंग के माध्यम से कक्षों और एक संवहनी नेटवर्क के विकास पर पिछले कार्य 23 में विस्तार से चर्चा की गई है। हाल ही में प्रकाशित अन्य मौजूदा प्रोटोकॉल पर इस दिल के ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ 17,18,19,20,36,37 पूरे ऑर्गेनोइड में एंडोथेलियल नेटवर्क का मजबूत गठन है, जिससे प्रारंभिक मानव हृदय में संवहनी विकास और बीमारी की जांच करने की क्षमता की अनुमति मिलती है, प्रोटोकॉल में आगे बाहरी प्रेरण की आवश्यकता के बिना। अंत में, हृदय ऑर्गेनोइड्स का कार्यात्मक विश्लेषण विभिन्न दृष्टिकोणों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें ऑर्गेनोइड भर में कार्डियोमायोसाइट्स में कैल्शियम क्षणिकों को ट्रैक करने के लिए कैल्शियम-संवेदनशील डाई का उपयोग शामिल है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने कोशिकाओं में प्रवेश करने और बाहर निकलने वाले कैल्शियम की प्रतिदीप्ति तीव्रता दर्ज की और अत्यधिक प्रतिनिधि कार्रवाई क्षमता देखी। अन्य संभावित कार्यात्मक विश्लेषण विधियों में एक कैल्शियम-संवेदनशील संकेतक के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग या माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी 23 का उपयोग करके प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग शामिल है।

यहां वर्णित हृदय ऑर्गेनोइड्स विकासशील मानव भ्रूण के दिल के पुनरावृत्ति हैं, फिर भी अधिक परिपक्व, वयस्क जैसी विशेषताओं का प्रदर्शन करने में सीमित हैं। भविष्य के प्रोटोकॉल इन ऑर्गेनोइड्स में परिपक्वता को प्रेरित करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल पर निर्माण कर सकते हैं और वयस्क हृदय को बेहतर मॉडल करने वाले निर्माणों को उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल मानव हृदय के लघु मॉडल बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है और हृदय विकास और बीमारी के अनुसंधान अध्ययनों या फार्मास्यूटिकल्स स्क्रीनिंग के लिए सीमित है और प्रत्यारोपण के माध्यम से हृदय ऊतक के प्रतिस्थापन जैसे नैदानिक हस्तक्षेप के साधन के रूप में उपयुक्त नहीं हो सकता है। कुल मिलाकर, हम यहां अत्यधिक पुनरुत्पादक और परिष्कृत मानव हृदय ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक आसान-से-पालन और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो मानव हृदय विकास, रोग एटियलजि और औषधीय स्क्रीनिंग में अनुसंधान अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या K01HL135464 और R01HL151505 के तहत और पुरस्कार संख्या 19IPLOI34660342 के तहत अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था। हम एमएसयू उन्नत माइक्रोस्कोपी कोर और डॉ विलियम जैक्सन को एमएसयू डिपार्टमेंट ऑफ फार्माकोलॉजी एंड टॉक्सिकोलॉजी में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, आईक्यू माइक्रोस्कोपी कोर और अनुक्रमण सेवाओं के लिए एमएसयू जीनोमिक्स कोर तक पहुंच के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम भी Aguirre लैब के सभी सदस्यों को उनकी मूल्यवान टिप्पणियों और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermal Mixer ThermoFisher Scientific 13-687-717
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket

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References

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जैव रसायन अंक 175
प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न मानव हृदय ऑर्गेनोइड्स को स्व-असेंबलिंग उत्पन्न करना
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Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).

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